專利名稱：一種快捷構(gòu)建amiRNA干擾載體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所涉及的技術(shù)領(lǐng)域?yàn)榛A(chǔ)分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及到小干擾RNA載體的構(gòu)建，其應(yīng)用涉及到動(dòng)物、植物、微生物。
背景技術(shù)：
體內(nèi)的miRNA是基因表達(dá)調(diào)控的重要手段之一，在基因功能分析中，RNA干擾技術(shù)是實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄后沉默(PTGS)的重要方式，而人工miRNA的構(gòu)建與應(yīng)用是成熟利用miRNA技術(shù)實(shí)現(xiàn)基因沉默的標(biāo)志，具有較高的效率和特異性。關(guān)于人工miRNA構(gòu)建方法最初采用了多輪PCR的方法，全部采用PCR方法進(jìn)行構(gòu)建人工miRNAI，此技術(shù)容易產(chǎn)生非特異性條帶，需要設(shè)計(jì)多對(duì)引物，多次PCR整體思路復(fù)雜。后來發(fā)現(xiàn)了酶切連接法，但是用到了稀有的限制性內(nèi)切酶，酶切位點(diǎn)不可選擇，其使用受到了一定的限制，而且價(jià)格昂貴2;2009年報(bào)道了通過PCR反向擴(kuò)增供給載體然后重組的方法，此方法操作步驟復(fù)雜而且無法避免將供給載體的部分序列構(gòu)建到轉(zhuǎn)基因載體中3。針對(duì)這些已有的方法存在的問題和不足，本方法采用typeIIS型限制性內(nèi)切酶(此類內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)與酶切位點(diǎn)不在同一位點(diǎn))作為粘末端產(chǎn)生酶，直接將退火得到的miRNA中間部分與骨架側(cè)翼部分進(jìn)行連接，而且酶切連接一步法實(shí)現(xiàn)，無需凝膠回收酶切片段，簡(jiǎn)單、方便、快捷地將整個(gè)構(gòu)建過程合并在一個(gè)體系中，只需1_2個(gè)小時(shí)即可完成。I
Schwab， R., et al., Highly specific gene silencing by artificialmicroRNAs in Arabidopsis.Plant Cell, 2006.18(5): p.1121—32Wang，X.， et al., A highly efficient method for construction of riceartificial MicroRNA vectors.Mol Biotechnol，2010.46(3): p.211—8
3Chen, S.，· et al.，A versatile zero background T~vector system for genecloning and functional genomics.Plant Physiol, 2009.150(3): p.1111—21。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)這些已有的方法存在的問題和不足，本發(fā)明提供了一種快捷構(gòu)建人工小RNA載體的方法。本方法用于構(gòu)建人工miRNA干擾載體，其特點(diǎn)是基于能夠?qū)崿F(xiàn)無縫連接的技術(shù)原理，將靶標(biāo)序列與骨架序列進(jìn)行連接，從而產(chǎn)生與天然miRNA前體在結(jié)構(gòu)上一致的amiRNA前體。具體地，該方法采用了含有amiRNA前體骨架的載體以及含有正向靶標(biāo)-環(huán)部骨架-反向靶標(biāo)的DNA片段，所述載體上的兩側(cè)翼序列之間有一對(duì)相同但方向相反的typells型內(nèi)切酶酶切序列，所述DNA片段兩端含有預(yù)設(shè)的typeIIS內(nèi)切酶酶切序列，并且載體上酶切產(chǎn)生的粘末端和合成的DNA上酶切產(chǎn)生的粘末端可以完全互補(bǔ)，通過此typeIIS酶切并連接酶切產(chǎn)物，即可完成載體構(gòu)建。上述DNA片段可同通過將三條單鏈DNA退火并延伸得到，這三條分別為A序列:含有正向靶標(biāo)和typells型內(nèi)切酶酶切正向序列的單鏈DNA，B序列:中間骨架序列，C序列:含有反向靶標(biāo)和typells型內(nèi)切酶酶切反向序列的單鏈DNA，B序列的兩端分別和A序列以及C序列的一端部分重疊。所述DNA片段的兩個(gè)內(nèi)切酶識(shí)別序列的排列方向?yàn)椤罢?反向”的排列，所述載體上的兩側(cè)翼序列之間有一對(duì)分別為“反向-正向”排列的typells型內(nèi)切酶識(shí)別序列?？梢酝ㄟ^typells型內(nèi)切酶和T4連接酶同時(shí)酶切和連接含有amiRNA前體骨架(側(cè)翼部分)的載體和此DNA，以完成載體構(gòu)建。含祀標(biāo)干擾序列的DNA片段可從WMD3網(wǎng)站(http://wmd3.weigelworld.0rg/cg1-bin/webapp.cgi page= Designer;project=stdwmd)上得到對(duì)所干擾的基因的革巴序列，為此特異性的21bp的靶干擾序列設(shè)計(jì)引物兩條，還有一條可重復(fù)使用的骨架環(huán)引物，用此三條引物進(jìn)行退火，可得到長(zhǎng)116bp的DNA片段。DNA片段克隆到載體骨架的方法可以是:將含有amiRNA前體骨架的載體和含靶標(biāo)干擾序列的DNA片段按照合適(1:10到10:1之間)的摩爾比同時(shí)進(jìn)行酶切和連接，在內(nèi)切酶的作用下載體和片段的兩端產(chǎn)生相同的黏末端，再在連接酶的作用下可以相互連接，因此可以形成最終的針對(duì)所選基因的特異性amiRNA干擾載體。本方法采用typeIIS型限制性內(nèi)切酶(此類內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)與酶切位點(diǎn)不在同一位點(diǎn))作為粘末端產(chǎn)生酶，直接將退火得到的miRNA中間部分與骨架側(cè)翼部分進(jìn)行連接，而且酶切連接一步法實(shí)現(xiàn)，無需凝膠回收酶切片段，簡(jiǎn)單、方便、快捷地將整個(gè)構(gòu)建過程合并在一個(gè)體系中，只需1-2個(gè)小時(shí)即可完成。


圖1是pAS干擾表達(dá)載體的圖譜。圖2顯示的是在煙草中驗(yàn)證此方法產(chǎn)生的載體對(duì)⑶S基因的干擾。左側(cè)為對(duì)照組，為含質(zhì)粒PCAMBIA1301的農(nóng)桿菌(可表達(dá)⑶S基因)，右側(cè)為含質(zhì)粒pCAMBIA1301的農(nóng)桿菌和含質(zhì)粒pAS-gus的農(nóng)桿菌的混合實(shí)驗(yàn)`組，由此可見干擾載體對(duì)于⑶S基因的干擾效果十分顯著。圖3顯示的是定量PCR結(jié)果驗(yàn)證煙草葉片中⑶S基因的表達(dá)量。柱狀圖表示對(duì)照組(圖2左側(cè)葉片)和實(shí)驗(yàn)組(圖2右側(cè)葉片)⑶S基因的相對(duì)表達(dá)量，圖上的短橫線表示所得數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差，由此可得干擾載體對(duì)靶基因GUS所表達(dá)的蛋白可抑制56%左右。圖4是amiRNA的骨架示意圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1:PAS(pre - amiRNA on typeIIS)系統(tǒng)的建立 針對(duì)植物轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)設(shè)計(jì)了 PAS干擾表達(dá)載體，其圖譜如圖1。此載體是將pCAMBIA1300用QuikChange突變?cè)噭┖邢?typeIIS (BsaI)后加了一段 cassette,此 cassette 包括 CaMV35s-pre528-ccdB-pre528_Nos ter 全序列通過人工合成得到。CaMV35s表示花椰菜花葉病毒35s啟動(dòng)子；pre528_l表示水稻內(nèi)源干擾miRNA(0sMIR528)的一部分骨架，序列為 CAGCAGCAGCCACAGCAAAAITTGGITTGGGATAGGTAGGTGTTATGTT AGGTCTGGTTTTTTGGCTGTAGCAGCAGCAGT ;ccdB表示大腸桿菌致死基因，但它對(duì)DB3.1菌株不會(huì)致毒，雖然圖譜中未標(biāo)出，但其中含有其自身的啟動(dòng)子及終止子，序列為:
AGAGACCAATTCTCGACTAAGTTGGCAGCATCACCCGACGCACTTTGCGCCGAATAAATACCTGTGACGGAAGATCACTTCGCAGAATAAATAAATCCTGGTGTCCCTGTTGATACCGGGAAGCCCTGGGCCAACTTTTGGCGAAAATGAGACGTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAAGGAAGCTAAACTTTTGCTGACGAGAACAGGGACTGGTGAAATGCAGTTTAAGGTTTACACCTATAAAAGAGAGAGCCGTTATCGTCTGTTTGTGGATGTACAGAGTGATATTATTGACACGCCTGGGCGACGGATGGTGATCCCCCTGGCCAGTGCACGTCTGCTGTCAGATAAAGTCTCCCGTGAACTTTACCCGGTGGTGCATATCGGGGATGAAAGCTGGCGCATGATGACCACCGATATGGCCAGTGTGCCGGTATCCGTTATCGGGGAAGAAGTGGCTGATCTCAGCCACCGCGAAAATGACATCAAAAACGCCATTAACCTGATGTTCTGGGGAATATAAATGTCAGGCTCCCTTATACACAGGTCGACGGTCTCAACGAGCCCTTGGTCTCA ;pre528_2 表示水稻內(nèi)源干擾 miRNA (OsMIR528)的另一部分骨架，序列為 GTTCCTGCTGCTAGGCTGTTCTGTGGAAGITTGCAGAGITTATATTATGGGITTAATCGTCCATGGCATCAGCATCAGCAGC ；Nos ter 表示終止子。實(shí)施例2:用PAS系統(tǒng)干擾基因⑶S
選靶基因⑶S ( ￠-葡萄糖苷酸酶基因)進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)(GenBank注冊(cè)編號(hào)AY292368)。(I)通過WMD3在線軟件篩選出⑶S基因的特異靶位點(diǎn)為TAATAACATACGGCGTGACAT
(2)針對(duì)此靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物:
pam1-F:caggagg tctcaggaaTAATAACATACGGCGTGACATcaggagattcagttpam1-R:gtcctggtctcagcagTAATAACATACCGCGAGACATagagaggcaaaagpami—M:caggagattcagtttgaagctggacttcacttttgcctctct
(3)將此三條單鏈引物退火延伸，可得到一條116bp的DNA片段，即為caggaggtctcaggaaTAATAACATACGGCGTGACATcaggagattcagtttgaagctggacttcacttttgcctctctATGTCTCGCGGTATGTTATTActgctgagaccaggac。(4)將3得到的DNA片段和pAS-amiRNA用BsaI和T4 DNA Iigase同時(shí)反應(yīng)一段時(shí)間(0.5-5h)后，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)中，若此片段未能克隆入載體中，此載體在大腸桿菌中不能生長(zhǎng)，能長(zhǎng)出來的菌斑表示此片段已成功克隆到pAS-amiRNA中，一般情況下都是正確的重組子并命名為pAS-gus。(5)將載體pAS-gus轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，侵染煙草植株以驗(yàn)證干擾效果，如圖2所示。在煙草中驗(yàn)證此方法產(chǎn)生的載體對(duì)⑶S基因的干擾。左側(cè)為對(duì)照組，為含質(zhì)粒PCAMBIA1301的農(nóng)桿菌(可表達(dá)⑶S基因)，右側(cè)為含質(zhì)粒pCAMBIA1301的農(nóng)桿菌和含質(zhì)粒pAS-gus的農(nóng)桿菌的混合實(shí)驗(yàn)組，由此可見干擾載體對(duì)于GUS基因的干擾效果十分顯著。(6)qRT-PCR結(jié)果定量分析干擾效果，如圖3所示。定量PCR結(jié)果驗(yàn)證煙草葉片中⑶S基因的表達(dá)量。柱狀圖表示對(duì)照組(圖2左側(cè)葉片)和實(shí)驗(yàn)組(圖2右側(cè)葉片)⑶S基因的相對(duì)表達(dá)量，圖上的短橫線表示所得數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差，由此可得干擾載體對(duì)靶基因GUS所表達(dá)的蛋白可抑制56%左右。
權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建miRNA干擾載體的方法，該方法采用了含有amiRNA前體骨架的載體以及含有正向靶標(biāo)-環(huán)部骨架-反向靶標(biāo)的DNA片段，所述載體上的兩側(cè)翼序列之間有一對(duì)相同但方向相反的typells型內(nèi)切酶酶切序列，所述DNA片段兩端含有預(yù)設(shè)的typeIIS內(nèi)切酶酶切序列，并且載體上酶切產(chǎn)生的粘末端和合成的DNA上酶切產(chǎn)生的粘末端可以完全互補(bǔ),通過此typeIIS酶切并連接酶切產(chǎn)物，即可完成載體構(gòu)建。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述DNA片段的構(gòu)建方法是通過將三條單鏈DNA退火并延伸得到，這三條分別為A序列含有正向靶標(biāo)和typells型內(nèi)切酶酶切正向序列的單鏈DNA，B序列中間骨架序列，C序列含有反向靶標(biāo)和typells型內(nèi)切酶酶切反向序列的單鏈DNA，B序列的兩端分別和A序列以及C序列的一端部分重疊。
3.權(quán)利要求I方法構(gòu)建得到的miRNA干擾載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種構(gòu)建人工小RNA(amiRNA)表達(dá)載體的方法，其通過人工合成含有正向靶標(biāo)-環(huán)部骨架-反向靶標(biāo)的DNA，且此DNA片段兩端含有預(yù)設(shè)的typeIIS內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，將其克隆到含有此typeIIS限制性內(nèi)切酶的含有amiRNA前體骨架的載體中得到小RNA(amiRNA)表達(dá)載體。該方法具有高效率、高通量的優(yōu)點(diǎn)，而且操作簡(jiǎn)單，用此方法構(gòu)建一個(gè)干擾載體只需要設(shè)計(jì)一對(duì)50bp左右的引物，1-2小時(shí)即可完成構(gòu)建。
文檔編號(hào)C12N15/63GK103255158SQ20131020516
公開日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月28日
發(fā)明者李陽(yáng), 李陽(yáng)生, 盧楠, 李楊 申請(qǐng)人:武漢大學(xué)