一種基于雞恒定鏈片段的新型疫苗載體的構(gòu)建與應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種靶向雞MHCII類(lèi)分子的疫苗載體及其制備方法。該載體是以雞恒定鏈的胞漿區(qū)、跨膜區(qū)和部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔區(qū)片段80個(gè)氨基酸組成。該載體通過(guò)直接與MHCII類(lèi)分子結(jié)合而提高所連接抗原肽進(jìn)入抗原肽遞呈途徑效率，進(jìn)而增強(qiáng)免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和特異性抗體水平。本發(fā)明將提供多肽抗原的高效免疫載體，在提高疫苗效率及疫病防控方面發(fā)揮重要作用，具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種基于雞恒定鏈片段的新型疫苗載體的構(gòu)建與應(yīng)用
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是涉及一種用雞恒定鏈胞漿區(qū)和跨膜區(qū)多肽片段構(gòu)建疫苗載體及其應(yīng)用。
[0002]【背景技術(shù)】:疫苗是防控傳染病的主要工具。常規(guī)疫苗中的抗原分子誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性抗原或淋巴細(xì)胞，保護(hù)動(dòng)物。在誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生特異性免疫時(shí)，動(dòng)物MHC分子起了轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)合抗原肽的作用。MHC分子是脊椎動(dòng)物多態(tài)性最高的分子，它們選擇性地與抗原肽結(jié)合，即經(jīng)處理的抗原分子成為多肽(抗原肽)，進(jìn)入MHC分子中特有的凹槽，與相應(yīng)的MHC分子結(jié)合，并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面。在此過(guò)程中，病原體的蛋白分子含多種抗原肽，大部分不是保護(hù)性抗原，然而它們均被提呈，所以難以保證具有功能的特定保護(hù)性抗原被有效提呈而發(fā)揮作用。
[0003]恒定鏈?zhǔn)荕HCII類(lèi)分子的伴侶蛋白，由胞漿區(qū)、跨膜區(qū)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔區(qū)三個(gè)片段組成(Koch N，Lauer W，Habicht J，Dobberstein B:Primary structure of the genefor the murine Ia antigen-associated invariant chains (Ii).An alternativelyspliced exon encodes a cysteine-rich domain highly homologous to a repetitivesequence of thyroglobulin.EMBO J1987，6:1677-1683)。在 MHCII 類(lèi)分子提呈抗原肽過(guò)程中，恒定鏈起著輔助作用。在MHCII類(lèi)分子成熟過(guò)程中，恒定鏈與之結(jié)合，其CLIP占據(jù)MHCII類(lèi)分子的凹槽，防止內(nèi)源性多肽進(jìn)入(Ghosh P，Amaya Mj Mellins Ej WileyDC.The structure of an intermediate in class II MHC maturation:CLIP boundto HLA-DR3.Nature，1995,378:457-462)。在成熟的MHCII類(lèi)分子，在其他輔助因子的作用下，恒定鏈被解離，外源性抗原肽進(jìn)入凹槽。根據(jù)恒定鏈的這種特性，有的將恒定鏈內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔區(qū)中的 CLIP (class ΙΙ-associated invariant chain peptide)用抗原妝進(jìn)行替換(Nagata T，Aoshi Tj Suzuki M et al.1nduction of protective immunityto Listeria monocytogenes by immunization with plasmid DNA expressing ahelper T-cell epitope that replaces the class II—associated invariantchain peptide of the invariant chain.1nfect Immunj 2002;70(5):2676-80.GaoMj Wang HP, Wang YN et al.HCV-NS3Thlminigene vaccine based on invariant chainCLIP genetic substitution enhances CD4 (+)Thlcell responses in vivo[J].Vaccine, 2006; 24 (26):5491-7)，或者用CLIP區(qū)N端前4個(gè)肽(即I1-key)作為引導(dǎo)片段(Xu Mj Lu X，Sposato M et al.11-Key/HPV16E7hybrid peptide immunotherapy forHPV16+cancers.Vaccine, 2009;27 (34):4641-7.Zinckgraf JWjSposato M，Zielinski Vet al.1dentification of HLA class II H5N1 hemagglutinin epitopes followingsubvirion influenza A (H5N1) vaccination.Vaccine, 2009; 27 (39): 5393-401)，進(jìn)行革巴向結(jié)合MHCII分子，提高免疫效果。我們的研究發(fā)現(xiàn)，這兩種方式均能提高免疫效果(孟凡濤，陳芳芳，余為一.兩種恒定鏈活性片段載體在增強(qiáng)抗體分泌中的作用比較.中國(guó)免疫學(xué)雜志.2012.28:579-683);但是在繼續(xù)研究恒定鏈靶向活性片段時(shí)發(fā)現(xiàn)，雞恒定鏈N端的胞漿區(qū)、跨膜區(qū)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔區(qū) N端部分序列在細(xì)胞膜定位和與MHCII結(jié)合中起關(guān)鍵作用(圖5，圖6)。進(jìn)一步用這兩個(gè)片段作為載體，連接已知抗原肽，構(gòu)建靶向MHCII類(lèi)分子的融合蛋白抗原。免疫動(dòng)物后，可以提高特異性抗體效價(jià)。比用抗原肽取代恒定鏈的CLIP提高了約5倍，比與I1-key連接抗原肽則提高約2倍(圖7)。這可能是因?yàn)楹愣ㄦ湹腃端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔區(qū)，約有142個(gè)氨基酸，占整個(gè)恒定鏈分子的64%，在與MHCII分子結(jié)合的同時(shí)，干擾了抗原肽與淋巴細(xì)胞表面受體的結(jié)合，影響淋巴細(xì)胞的活化，并使增強(qiáng)抗體產(chǎn)生作用的下降。而用I1-key四肽作為載體，由于四肽并不能與MHCII分子穩(wěn)定結(jié)合，同樣達(dá)不到最佳效果。只有以雞恒定鏈的胞漿區(qū)和跨膜區(qū)為載體的抗原肽融合分子，既能在胞膜區(qū)定位，又能與MHCII分子結(jié)合，并且沒(méi)有干擾與淋巴細(xì)胞表面受體的不必要的片段而由抗原肽很好結(jié)合并誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞活化，所以能獲得最佳免疫誘導(dǎo)效果。。
[0004]
【發(fā)明內(nèi)容】
:本發(fā)明解決的問(wèn)題在于提供一種靶向雞MHCII類(lèi)分子的疫苗載體，使與之連接的抗原肽直接進(jìn)入MHCII類(lèi)分子遞呈途徑，以提高活化免疫細(xì)胞和增強(qiáng)特異性免疫應(yīng)答效果。該載體可以連接各種具保護(hù)性抗原肽(包括多價(jià)抗原肽)。
[0005]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):
[0006]一種誘導(dǎo)高效免疫應(yīng)答具有靶向雞MHCII類(lèi)分子的載體，是將抗原肽與恒定鏈的胞漿區(qū)、跨膜區(qū)和內(nèi)腔區(qū)前段(如附圖1)的序列的C端與抗原肽的N端連接。
[0007]所描述的載體是由上述區(qū)段的氨基酸序列組成如圖2所示。在構(gòu)建含有抗原肽時(shí)，通過(guò)圖3的大引物核苷酸序列用PCR將載體與抗原肽核酸序列連接。
[0008]所描述的抗原肽是具有保護(hù)性或者其他功能性(如T細(xì)胞依賴(lài)性抗原肽或脫敏原)，其末端含有恒定鏈的胞漿區(qū)、跨膜區(qū)和內(nèi)腔區(qū)前段C端下游的2個(gè)氨基酸序列的核苷酸。在構(gòu)建含抗原肽核苷酸片段時(shí)，該6個(gè)核苷酸序列被包含在5'端的引物中。
[0009]該載體可應(yīng)用于各種亞 單位疫苗的制備。
[0010]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0011]本發(fā)明把具有膜定位和結(jié)合MHCII類(lèi)分子的恒定鏈胞漿區(qū)、跨膜區(qū)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔區(qū)前段作為抗原肽載體，使所攜帶的抗原肽與MHCII類(lèi)分子共定位于細(xì)胞膜(圖4)，并靶向結(jié)合MHCII類(lèi)分子(圖5)，從而提高了抗原肽被遞呈給淋巴細(xì)胞表面受體，實(shí)現(xiàn)高效激活特異性免疫細(xì)胞。
[0012]本發(fā)明所構(gòu)建的疫苗載體，根據(jù)用新城疫病毒保護(hù)性短肽F2蛋白所進(jìn)行雞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)靶向MHCII而得到高效免疫應(yīng)答，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性免疫抗體效價(jià)比單獨(dú)用抗原肽免疫的抗體效價(jià)高9倍(圖7);其誘導(dǎo)產(chǎn)生的IL-2提高3倍；在保護(hù)性試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組的發(fā)病率低于、而保護(hù)率則高于單獨(dú)用抗原肽免疫的對(duì)照組。
[0013]本發(fā)明構(gòu)建的載體還具有攜帶多價(jià)抗原肽的疫苗載體應(yīng)用。載體可以連接多達(dá)60至80個(gè)氨基酸殘基，這些可包含至少3個(gè)不同來(lái)源的抗原肽。這些抗原肽均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)不同的抗原肽的特異性抗體。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】:
[0014]圖1載體結(jié)構(gòu)(Ii結(jié)構(gòu)、載體與抗原肽示意圖)
[0015]圖2載體連接抗原肽方式與核苷酸序列
[0016]圖3多價(jià)抗原肽連接的方式與核苷酸序列
[0017]圖4雞恒定鏈載體、抗原肽和載體-抗原肽核苷酸片段以及重組質(zhì)粒雙酶切鑒定圖[0018]圖5雞恒定鏈載體、載體-抗原肽與MHCII類(lèi)分子的細(xì)胞膜共定位
[0019]圖6雞恒定鏈載體、載體-抗原肽與MHCII類(lèi)分子的免疫共沉淀與免疫印跡
[0020]圖7雞恒定鏈載體-抗原肽與單一抗原肽誘導(dǎo)特異性免疫的效果比較
【具體實(shí)施方式】
[0021]本發(fā)明將保護(hù)性抗原肽或其他功能性(如病毒、細(xì)菌或腫瘤的)抗原肽連接恒定鏈載體，最后插入原核表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)。
[0022]實(shí)施例1:載體-單一抗原肽的構(gòu)建與應(yīng)用
[0023]1.總 RNA 抽提
[0024]使用Trizol Reagent抽提雞脾臟細(xì)胞總RNA。具體操作方法如下:取30~50mg脾臟用組織研磨器研碎分兩次加入1000 μ L Trizol，充分研磨。將液體移入1.5mL離心管中，12000rpm, 5min, 4°C離心,將上清移入新的1.5mL離心管中，室溫靜置5min。加入200 μ L氯仿(每ImL Trizol試劑加入0.2mL氯仿),劇烈振蕩15s,室溫靜置5min,4°C, 12, OOOrpm,離心15min。小心將上層無(wú)色液相轉(zhuǎn)移到另一無(wú)菌RNase-free的1.5mL離心管中，加入500 μ L異丙醇(每ImL Trizol試劑加入0.5mL異丙醇)充分混勻，室溫靜置IOmin,4°C,
12,OOOrpm,離心IOmin。棄上清,加入1000 μ L75%乙醇(RNA專(zhuān)用，每ImL Trizol試劑至少加入lmL75%無(wú)水乙醇)洗滌，渦旋混勻后，4°C，12000rpm，5min。棄上清，室溫干燥I~2min,加入50 μ L無(wú)菌RNase-free雙蒸水溶解η。離心管內(nèi)的溶液即為雞脾臟細(xì)胞總RNA樣品，可立即使用或者_(dá)80°C保存。注意:以上操作均需戴一次性無(wú)菌手套且勤換，嚴(yán)防RNA酶的污染。提取的RNA在1.2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行檢測(cè)并用紫外線分光光度計(jì)上測(cè)定260nm和280nm吸光度值，觀察RNA的完整性并計(jì)算RNA濃度和純度。
[0025]2.反轉(zhuǎn)錄獲cDNA
[0026]以提取的總RNA為模板，用Oligo dT引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。具體操作按如下進(jìn)行:
[0027]在微量離心管中依次加入如下溶液:RNA，ly g ;01igo dT引物(50 μ M)，L O μ L ;dNTP Mix(IOMm), l.0yL ;無(wú) RNase 水至 10.0μ L。混勻后，離心 3 ~5s，65°C 水浴 5min 變性退火，立即冰浴冷卻。然后依次加入下列溶液:5XPrimescript? Buffer, 4.0uL ;RNase抑制劑(40U/y L)，0.5μ L ；Primescript?Rtase (200U/ μ L)，1.0μ L ;無(wú) Rnase 水至 20.0 μ L042°C 60min,70°C 15min 以終止反應(yīng)。_20°C保存。
[0028]3.擴(kuò)增全長(zhǎng)恒定鏈序列
[0029]以cDNA第一鏈為模板，分別以atggctgaggagcagcg為上游引物和ctacttggctttcacca 為下游引物，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系:10XLAPCR Buffer (Mg2+),5.0 μ L ；dNTP Mixture (2.5mM)，4.0 μ L ;P1 (20 μ M)，1.0 μ L ;P2 (20 μ M)，1.0 μ L ；cDNA,
2.0yL ；LA Taq DNA聚合酶，0.5 μ L ;加ddH20至總?cè)莘e50.0 μ L。恒定鏈基因按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增:95°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸8min。同時(shí)設(shè)滅菌的雙蒸水作為空白對(duì)照。PCR結(jié)束后，取3μ L反應(yīng)產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè) 鑒定。然后經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的基因片段，采用DNA凝膠回收試劑盒(DNA Gel Extraction Kit)回收純化目的基因片段。電泳和測(cè)序鑒定后保存。
[0030]4.構(gòu)建恒定鏈(胞漿區(qū)、跨膜區(qū)和部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔區(qū))載體片段[0031]以上述步驟3中所獲得的PCR產(chǎn)物全長(zhǎng)恒定鏈為模板，以ccggaattcatggctgaggagcagcg 為上游引物:gcgtcgacctacttcctctgcagcgactc 為下游引物(下劃線所標(biāo)注分別為EocR I和Sal I的酶切位點(diǎn))擴(kuò)增恒定鏈載體片段(圖2XPCR反應(yīng)體系:10XExPCR Buffer (Mg2+), 5.0 μ L ；dNTP Mixture (2.5mM)，4.0 μ L ;上游引物(20 μ Μ)，
1.0 μ L ;下游引物(20 μ Μ)，1.0 μ L ;模板，l.0yL ；ExTaq DNA 聚合酶，0.5 μ L ;加 ddH20 至總?cè)莘e50.0 μ L。按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增:98°C變性10s，58°C退火30s，72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸8min。同時(shí)設(shè)滅菌的雙蒸水作為空白對(duì)照。純化回收獲得的序列同前。電泳和測(cè)序鑒定后保存。其核苷酸序列為:
[0032]atggctgaggagcagcgggacctcatctcctccgatggcagcagtggggtgctccccattgggaacagcgagag atcctcgcttggccgcagaactgcgctgtcagcgctgtccatcctggtggcactgctgatcgccggccaggctgtc accatctactatgtgtaccagcagagcgggcagatcagcaagctgaccaagacctcgcagaccctgaagctggag tcgctgcagaggaag ;氨基酸序列為:
[0033]MAEEQRDLISSDGSSGVLPIGNSERSSLGRRTALSALSILVALLIAGQAVTIYYVYQQSGQISKLTKTSQTLKLESLQRK
[0034]5.連接載體與抗原肽片段
[0035]5.1修飾恒定鏈載體片段。以上述步驟4所獲得的恒定鏈載體片段為模板，以CCRRaattCatRRCtRaRRaRCaRCR (下劃線所標(biāo)注為EocR I的酶切位點(diǎn))為上游引物；RatRttRRcaRcattcttcctctRCaRCRaC (下劃線為重疊延伸部分)為下游引物。PCR反應(yīng)體系:10 XExPCR Buffer (Mg2+), 5.0ijL ；dNTP Mixture (2.5mM)，4.0 μ L ;上游引物(20 μ Μ)，
1.0 μ L ;下游引物(20 μ Μ)，1.0 μ L ;模板，l.0yL ；Εχ Taq DNA 聚合酶，0.5 μ L ;加 ddH20 至總?cè)莘e50.0 μ L。按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增:98°C變性10s，58°C退火30s，72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸8min。同時(shí)設(shè)滅菌的雙蒸水作為空白對(duì)照。純化回收獲得的序列同前。
[0036]5.2修飾抗原肽片段。以擴(kuò)增抗原肽片段(雞新城疫病毒F基因的片段為例:陳芳芳，禽類(lèi)MHCII類(lèi)分子結(jié)構(gòu)與抗病性關(guān)系和基于I1-Key的病毒抗原免疫作用的研究。博士論文，2011年，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué))為模板，以RtcRctRcaRaRRaaRaatRctRccaacatc為上游引物(下劃線為重疊延伸部分)、RcRtcRacctacatcttcccaactRc為下游引物(下劃線為Sal I酶切位點(diǎn)重疊延伸部分)。PCR反應(yīng)體系:10 XExPCR Buffer (Mg2+)，5.0 μ L ;dNTPMixture (2.5mM), 4.0 μ L ;上游引物(20 μ Μ)，1.0 μ L ;下游引物(20 μ Μ)，1.0 μ L ;以 F2 抗原片段為模板，1.0yL ；Ex Taq DNA聚合酶，0.5μ L ;加ddH20至總?cè)莘e50.0μ L。按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增:98°C變性10s，58°C退火30s，72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，72°C延伸8min。同時(shí)設(shè)滅菌的雙蒸水作為空白對(duì)照。純化回收獲得的序列同前。
[0037]5.3以重疊延伸PCR方法連接恒定鏈載體與抗原肽。以第一步和第二步擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，上游引物外為步驟5.1的上游引物，下游引物為5.2的下游引物。PCR反應(yīng)體系:10XExPCR Buffer (Mg2+), 5.0 μ L ；dNTP Mixture (2.5mM)，4.0 μ L ;上游引物(20 μ Μ)，l.0yL;下游引物(20μΜ)，1.0μ?;2 個(gè)模板，各 L0yL;Ex Taq DNA 聚合酶，0.5 μ L ;加ddH20至總?cè)莘e50.0 μ L。按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增:98°C變性10s，58 °C退火30s，72 °C延伸lmin,30個(gè)循環(huán)，72°C延伸8min。同時(shí)設(shè)滅菌的雙蒸水作為空白對(duì)照。純化回收獲得的序列同前。電泳和測(cè)序鑒定后保存。
[0038]6.構(gòu)建載體-抗原肽原核表達(dá)重組質(zhì)粒[0039]6.1載體-抗原肽融合基因和質(zhì)粒的雙酶切。將回收的載體-抗原肽融合基因和質(zhì)粒分別置以下系統(tǒng)進(jìn)行酶切:融合基因/質(zhì)粒，各800ng;EcoR I酶，LOyL5Sal I酶，1.0yL;10XH Buffer，3.0 μ L，至終容積30.0 μ L。孵育37。。，lh。核酸的純化回收同前。
[0040]6.2載體-抗原肽融合基因和質(zhì)粒的連接轉(zhuǎn)化和鑒定。按以下系統(tǒng)進(jìn)行連接:酶切載體-抗原肽融合基因產(chǎn)物，0.3pmoI ;酶切后質(zhì)粒產(chǎn)物，0.03pmol ；T4DNA ligase, 1.0 μ L ；10XT4DNA Buffer，約2.5 μ L至終容積25.0μ L。置16°C，反應(yīng)lh。將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化工程菌感受態(tài)細(xì)胞。以常規(guī)菌液PCR鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒。
[0041]7.載體-抗原肽融合基因的表達(dá)和提取
[0042]7.1制備重組工程菌。用常規(guī)方法制備感受態(tài)工程菌。
[0043]7.2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。挑取重組菌單菌落,接入2.0mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C靜置培養(yǎng)過(guò)夜；取適量過(guò)夜培養(yǎng)物按1:100接入500mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，370C 230rpm振蕩培養(yǎng)3.0h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；加入IPTG繼續(xù)振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)4.0h。用常規(guī)方法濃縮蛋白，采用切膠法或柱層析提取和純化載體-抗原肽融合蛋白。用SDS-PAGE電泳檢測(cè)蛋白純度。
[0044]8.融合蛋白的免疫學(xué)活性檢測(cè)
[0045]8.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫。選擇3-4周齡健康雞10羽，分2組，免疫抗原分別為抗原肽和載體-抗原肽。肌肉注射，初次免疫按3yg/k體重計(jì)算(按體積比1:1的比例與弗氏完全佐劑混勻)，10天后再次免疫(加弗氏不完全佐劑)，第20天三免，劑量等同第2次。三免疫后I周翅靜脈采血，分離血清。
[0046]8.2ELISA檢測(cè)特異性抗血清效價(jià)。用抗原肽進(jìn)行包被，并設(shè)立空載體表達(dá)蛋白為對(duì)照，抗融合蛋白抗血清作為一抗，以辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗雞Ig為二抗，按常規(guī)方法進(jìn)行。
[0047]實(shí)施例2:載體-多價(jià)抗原肽的構(gòu)建與應(yīng)用
[0048]1.雞恒定鏈的克隆。mRNA提取、反轉(zhuǎn)錄獲cDNA和擴(kuò)增全長(zhǎng)恒定鏈序列同實(shí)施例1方法步驟的I至3。
[0049]2.構(gòu)建多價(jià)抗原肽片段
[0050]2.1引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)3對(duì)引物分別擴(kuò)增抗原肽1，抗原肽2和抗原肽3片段(圖3):
[0051]Pl上游/Pl下游:P1上游:含保護(hù)堿基、EcoRI酶切位點(diǎn)和編碼病原A保護(hù)性抗原肽核苷酸序列的起始區(qū)；P1下游:含保護(hù)堿基、SalI酶切位點(diǎn)和編碼病原A保護(hù)性抗原肽核苷酸序列的終止區(qū)；
[0052]P2上游/P2下游:P2上游:含保護(hù)堿基、SalI酶切位點(diǎn)和編碼病原B保護(hù)性抗原肽核苷酸序列的起始區(qū)；P2下游:含保護(hù)堿基、BgLII酶切位點(diǎn)和編碼病原B保護(hù)性抗原肽核苷酸序列的終止區(qū)；[0053]P3上游/P3下游:P3上游:含保護(hù)堿基、BgLII酶切位點(diǎn)和編碼病原C保護(hù)性抗原肽核苷酸序列的起始區(qū)；P3下游:含保護(hù)堿基、XhoI酶切位點(diǎn)和編碼病原C保護(hù)性抗原肽核苷酸序列的終止區(qū)。
[0054]2.2構(gòu)建多價(jià)抗原肽
[0055]具體方法:按照常規(guī)PCR方法，分別擴(kuò)增抗原肽1、抗原肽2和抗原肽3三個(gè)片段。PCR擴(kuò)增后的抗原肽I和抗原肽2產(chǎn)物分別用Sal I進(jìn)行單酶切。具體為:抗原肽I (或者抗原肽 2)片段 25.5 μ L，Sal I 酶 1.5 μ L，IOXH Buffer，3.0 μ L，至總?cè)莘e 30.0 μ L, DNA 凝膠方法回收酶切產(chǎn)物抗原肽I和抗原肽2。用T4連接酶連接抗原肽I和抗原肽2，lh。以連接產(chǎn)物為模板，以引物Pl上游和P2下游擴(kuò)增抗原肽I和抗原肽2獲得抗原肽1-抗原肽2重組片段。將獲得該重組片段與抗原肽3片段分別用BgLII進(jìn)行單酶切后回收，并用T4連接酶進(jìn)行連接，再以抗原肽1-抗原肽2-抗原肽3的連接產(chǎn)物為模板，用引物Pl上游和P3下游，擴(kuò)增含三個(gè)抗原肽片段的重組多價(jià)抗原肽。
[0056]3.連接載體片段與抗原肽序列、構(gòu)建載體-抗原肽原核表達(dá)重組質(zhì)粒、載體-抗原肽融合基因的表達(dá)和提取和融合蛋白的免疫學(xué)活性檢測(cè)同實(shí)施例1方法步驟的6、7和8。
【權(quán)利要求】
1.一種靶向結(jié)合雞MHCII類(lèi)分子的疫苗載體，其特征在于，所述載體由雞恒定鏈N端80個(gè)氨基酸殘基組成，并在其C端與抗原肽連接。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗載體，其特征在于:所述的80個(gè)氨基酸殘基是由雞恒定鏈的N端的胞漿區(qū)、跨膜區(qū)和部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔區(qū)組成的片段，編碼該片段的核苷酸序列的3'端連接抗原肽核苷酸序列，構(gòu)成載體/抗原肽融合基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗載體，其特征在于:所述的編碼80個(gè)氨基酸殘基和抗原肽的融合基因位于各種原核表達(dá)質(zhì)粒，后者經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入工程菌和被誘導(dǎo)表達(dá)載體/抗原肽融合蛋白分子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗載體，其特征在于:與載體連接的抗原肽片段包括由一種病原保護(hù)性抗原表位和由多種病原保護(hù)性抗原表位連接而成的多價(jià)抗原肽。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗載體，其特征在于:編碼抗原肽的核苷酸序列的連接由編碼三至四個(gè)甘氨酸或其他合適氨基酸的核苷酸構(gòu)成。
6.一種權(quán)利要求1所述的疫苗載體的制備方法，包括以下步驟: 1)構(gòu)建所述的編碼雞恒定鏈N端80個(gè)氨基酸殘基的基因片段； 2)構(gòu)建所需要的編碼抗原肽核苷酸序列； 3)將編碼I)所述雞恒定鏈N端80個(gè)氨基酸殘基的基因片段3'端與2)所述的編碼抗原肽核苷酸序列5'相連接。 4)將3)所述的融合基因插·入原核表達(dá)質(zhì)粒。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK103819562SQ201310216073
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2013年6月3日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月3日
【發(fā)明者】陳芳芳, 潘玲, 余為一 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)