一種產(chǎn)磷脂酶c的重組大腸桿菌及制備磷脂酶c的方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)磷脂酶C的重組大腸桿菌及制備磷脂酶C的方法和應(yīng)用，其步驟為：A、磷脂酶C基因的制備：PCR引物的設(shè)計(jì)及磷脂酶C基因片段的擴(kuò)增。B、重組質(zhì)粒的構(gòu)建：經(jīng)EcoR?I和Not?I酶切得大小為1158bp的磷脂酶C基因片段，將其克隆到高拷貝質(zhì)粒pET28a上，得到重組質(zhì)粒pET28a-P.f-PLC；C、工程菌的構(gòu)建：用轉(zhuǎn)化方法將質(zhì)粒pET28a-P.f-PLC導(dǎo)入到E.coil?BL21(DE3)。液體發(fā)酵能產(chǎn)生有活力的磷脂酶C，胞內(nèi)外酶活力可達(dá)408.5U/ml。在油脂精煉、磷脂改性、醫(yī)療等領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種產(chǎn)磷脂酶C的重組大腸桿菌及制備磷脂酶C的方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)磷脂酶C的大腸桿菌，同時(shí)還涉及一種產(chǎn)磷脂酶C的大腸桿菌的制備方法以及該工程菌發(fā)酵生產(chǎn)的磷脂酶C在植物油脂脫膠等方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]磷脂酶C(PLC，:EC3.1.4.3)是專一水解天然磷脂Sn_3位磷脂酰酯鍵的水解酶，在生物的生命活動中起著第二信使的作用，廣泛分布于細(xì)菌、酵母菌、粘菌、果蠅、蛙及各種哺乳動物體中，可應(yīng)用于醫(yī)藥、飼料改良和食品工業(yè)領(lǐng)域。醫(yī)藥方面，用于研制抗血小板聚集藥物，預(yù)防血栓形成和心腦血管疾病。在飼料改良方面，磷脂酶添加于飼料中水解磷脂，改善飼料的利用效率和促進(jìn)動物生長。在食品工業(yè)方面，PLC可被應(yīng)用于油脂脫膠；同時(shí)由于磷脂酶可使面團(tuán)形成膠狀復(fù)合體，減少淀粉回生，應(yīng)用于烘焙行業(yè)。
[0003]近年來，隨著PLC在食品、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，國內(nèi)外學(xué)者對其進(jìn)行了大量的研究。與其他來源的PLC相比，微生物具有生長繁殖快、培養(yǎng)周期短、產(chǎn)酶量高等特點(diǎn)。
[0004]國內(nèi)對磷脂酶C的研究雖起步較晚，但也取得了一定成果，例如:2005年陳濤等人對篩選到的產(chǎn)PLC菌株Bacillus cereus Shenzhen754_l進(jìn)行三次紫外線和兩次C06O-Y射線誘變處理，篩選出三株高PLC活性的誘變株，酶活分別達(dá)到14.878、16.450、16.400U/ml (陳濤，王常高，劉曉輝，何東平.高產(chǎn)磷脂酶C菌株的誘變選育.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17 (6):712-716.) ;2007 年高林對 Bacillus cereus Shenzhen754_l 進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化，將酶活提高至26U/mL(高林.磷脂酶C高產(chǎn)菌株的篩選、鑒定和培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)的碩士學(xué)位論 文，2007) ;2010年詹逸舒篩選到一株Bacillus cereusZ-13，用卵黃瓊脂杯碟法測定該菌株所產(chǎn)生的PLC的沉淀圈(乳白色沉淀圈)，其直徑可達(dá)30mm，酶活達(dá)到23.31U/ml (詹逸舒.產(chǎn)磷脂酶C菌株的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)的研究.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)的碩士學(xué)位論文，2010)。
[0005]與動植物來源的PLC相比，上述微生物來源的PLC具有更短的生產(chǎn)周期，但仍存在如下弊端:如野生菌株分離純化耗資大，大多數(shù)具有潛在病原性，在食品安全性方面存在一定隱患；基因工程菌株其構(gòu)建和產(chǎn)酶工藝較為復(fù)雜，產(chǎn)酶量還有待提高。
[0006]在植物油脂精煉中，需要將毛油中的磷脂除去(即脫膠)，如果不進(jìn)行脫膠，油脂在加熱到一定溫度時(shí)就會發(fā)黑并產(chǎn)生黑煙，傳統(tǒng)的脫膠工藝是采用堿化學(xué)的方法，即在毛油中加入NaOH，把磷脂轉(zhuǎn)化成脂肪酸鈉，在通過離心除去，此法油脂損耗和能耗較大、且產(chǎn)生的廢水和皂角污染環(huán)境。而將磷脂酶C應(yīng)用于植物油脂精煉，利用磷脂酶C將油脂中的磷脂轉(zhuǎn)化成易于溶解在水中的磷酸酯和溶于油中的甘油二酯，再經(jīng)過離心即可除去油脂中的磷酸脂，達(dá)到脫膠的目的，不產(chǎn)生含堿廢水和皂角。酶法脫膠技術(shù)以其良好的經(jīng)濟(jì)效益、卓越的環(huán)保優(yōu)勢和簡單的生產(chǎn)工藝已成為油脂精煉工藝的發(fā)展趨勢。[0007]酶法脫膠工藝也隨著磷脂酶制劑研究的不斷深入而得到越來越廣泛的應(yīng)用，酶法脫膠技術(shù)相繼在美國邦吉公司、德國邦吉曼海姆公司等油脂企業(yè)進(jìn)行工業(yè)化應(yīng)用。南海油脂工業(yè)有限公司是國內(nèi)首個(gè)進(jìn)行酶法脫膠工藝中試研究的企業(yè)。華南理工大學(xué)和諾維信公司進(jìn)行合作，用酶法脫膠進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證明酶法脫膠對不同質(zhì)量的毛油具有相當(dāng)強(qiáng)的適應(yīng)性，對大豆油、菜籽油、葵花籽油、玉米油、米糠油等都適用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]鑒于上述和/或現(xiàn)有酶基因工程和酶工程領(lǐng)域中存在的問題，提出了本發(fā)明。
[0009]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一株產(chǎn)磷脂酶C的重組大腸桿菌及用其制備磷脂酶C的方法。利用該菌株通過液體發(fā)酵來生產(chǎn)磷脂酶C，產(chǎn)酶量和酶活性高，安全性好，制酶工藝簡單，成本低。
[0010]本發(fā)明還有一個(gè)目的是在于提供了一種產(chǎn)磷脂酶C的大腸桿菌在植物油脂(大豆油、菜籽油、米糠油等)脫膠中的應(yīng)用。利用大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的磷脂酶C與卵磷脂(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)發(fā)生反應(yīng)，生成甘油二酯和水溶性磷酸酯，從而減少最終工序中的乳化情況。這樣在離心分離過程中可以將膠質(zhì)分離得更干凈，同時(shí)也減少了中性油的損失。此外，磷脂酶C脫膠過程中生成的甘油二酯(DG)也是一種意外收獲的油產(chǎn)物，在整個(gè)精煉工藝過程中都始終存在。水溶性磷酸酯經(jīng)水化脫膠很容易除去，使油脂中的磷含量(10--!11(相當(dāng)于磷脂含量低于0.26%。)。與現(xiàn)有的化學(xué)法相比，具有環(huán)保、節(jié)能、出油率高的優(yōu)點(diǎn)。
[0011]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0012]一種產(chǎn)磷脂酶 C 的重組大腸桿菌(Eschierichia coil)BL21 (DE3)-pET-P.f-PLC,保藏編號為CCTCC N0.M2013299。所述產(chǎn)磷脂酶C的重組大腸桿菌Eschierichia coilBL21 (DE3) -pET-P.f-PLC, CCTCC N0.M2013299,由下述方法制得:
[0013](I)以保藏編號為CC TCC N0.M2013298的熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)的基因組為模板，克隆得到磷脂酶C基因，其堿基序列如SEQ IDNO:1所示；
[0014](2)將步驟(1)所得磷脂酶C基因克隆到表達(dá)載體pET_28a ( + )上，得到重組載體；
[0015](3)將步驟(2)所得重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建得到重組大腸桿菌。
[0016]本發(fā)明還提供了一種用上述產(chǎn)磷脂酶C的重組大腸桿菌(Eschierichia coil)BL21 (DE3) -pET-P.f-PLC，CCTCC N0.M2013299制備磷脂酶C的方法，是以該重組大腸桿菌為發(fā)酵菌株進(jìn)行液體發(fā)酵，制備磷脂酶C。
[0017]其具體步驟如下:
[0018](I)種子培養(yǎng):將所述產(chǎn)磷脂酶C的重組大腸桿菌BL21(DE3)-pET-P.f-PLC, CCTCCN0.M2013299接種于種子培養(yǎng)基中，于30~37°C振蕩培養(yǎng)8~12h，搖床轉(zhuǎn)速150~200r/min ；
[0019](2)液體發(fā)酵培養(yǎng):將經(jīng)過步驟(1)培養(yǎng)所得活化種子液按體積百分比3~10%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，于30~37°C振蕩培養(yǎng)4~6h小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速150~200r/min ;再添加乳糖，于20~30°C振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)14~22h，搖床轉(zhuǎn)速150~200r/min ;最后添加Triton X-100，于相同條件下繼續(xù)振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)18~36h，發(fā)酵完畢，得到發(fā)酵液；[0020](3)粗酶液的提取:將步驟(2)所得發(fā)酵液離心；收集上清液，即為胞外粗酶液；收集菌體細(xì)胞沉淀并超聲破碎，將所得超聲破碎液離心，取上清，即為胞內(nèi)粗酶液。
[0021]其進(jìn)一步的技術(shù)方案為:
[0022]步驟(1)所述種子培養(yǎng)基成分按克/升計(jì)為:蛋白胨9~llg，酵母粉4~6g，NaC19~Ilg，其余成分為水。
[0023]步驟(2)所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分按克/升計(jì)為:蛋白胨9~llg，酵母粉5~24g，甘油 O ~5g，其余成分為 0.25mol/L Tris-HCl (ρΗ7.2)。
[0024]步驟(2)所述乳糖的添加量為每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基O~5g。
[0025]步驟(2)所述Triton X-100的添加量為每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基O~10g。
[0026]本發(fā)明所提供的大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21 (DE3)-pET-P.f-PLC,已于2013年6月28日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號:CCTCCN0.M2013299,地址:中國，武漢，武漢大學(xué)。該菌株以下簡稱:大腸桿菌Escherichia coliBL21 (DE3)-pET-P.f-PLC, CCTCC N0.M2013299。
[0027]本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于:
[0028]與現(xiàn)有產(chǎn)磷脂酶C的野生分離菌株以及基因工程菌株相比，本發(fā)明構(gòu)建了一株目的基因來源于突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens),可高產(chǎn)磷脂酶C的基因工程重組大腸桿菌 Eschierichia coil BL21 (DE3)-pET-P.f-PLC, CCTCC N0.M2013299，利用該菌株通過液體發(fā)酵來生產(chǎn)磷脂酶C，產(chǎn)酶量高，其酶活性最高可達(dá)408.5U/ml，且安全性好；該制酶方法生產(chǎn)工藝簡單、成本低、易于工藝放大，在油脂精煉、磷脂改性、醫(yī)療等領(lǐng)域具有一定的應(yīng)用前景。
[0029]磷脂酶C酶活的測定方法如下:
[0030](I)硼砂卵黃平板法性測定酶活。將發(fā)酵液進(jìn)行超聲破碎，取100~200 μ L破碎后的上清液加入等距放置在硼砂卵黃瓊脂平板上的牛津杯中，于37° C溫育12~24h，以生成的分解圈(透明圈或渾濁圈)的大小分別代表酶活的高低。
[0031](2) p-NPPC法定量測定酶活。P-NPPC是卵磷脂的一種底物結(jié)構(gòu)類似物，磷脂酶C可水解p-NPPC生成對硝基苯酹,對硝基苯酹是一種黃色物質(zhì)，在410nm處有最大吸收峰,利用分光光度法測定發(fā)酵液在410nm處的吸光值，可反映磷脂酶C水解p-NPPC產(chǎn)生對硝基苯酚的量，根據(jù)對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線可定量計(jì)算出相應(yīng)酶活力大??；以IL反應(yīng)液體系計(jì)，其組成如下:10mmolp-NPPC、0.25mol/L Tris-HCl (ρΗ7.2)，ImL 反應(yīng)體系中加入 100 μ L 的發(fā)酵液，于37° C反應(yīng)30min;酶活力單位定義如下:在ρΗ7.2，溫度為37° C的條件下，每分鐘水解P-NPPC產(chǎn)生Inmol對硝基苯酚所需的酶的量為I個(gè)酶活力單位(U)。
[0032]上述測定方法中，所述硼砂卵黃培養(yǎng)基成分如下:NaC16.6g/L，硼酸10.9g/L，硼砂1.9g/L，瓊脂10g/L，卵黃液10g/L，其余成分為水，pH7.2~7.4，于I X IO5Pa高壓滅菌20min。搖勻后傾注平板，即得。
[0033]一種產(chǎn)磷脂酶C的工程菌在除去植物毛油(大豆油、菜籽油、米糠油)中磷脂中的應(yīng)用，包括，植物毛油的預(yù)熱和酸預(yù)處理；加入如權(quán)利要求3所述的磷脂酶C進(jìn)行反應(yīng)?’滅酶，離心分離完成脫膠。
[0034]作為本發(fā)明所述應(yīng)用的一種優(yōu)選方案，其中:所述預(yù)熱為預(yù)熱到80°C;所述酸預(yù)處理為加入檸檬酸均質(zhì)；所述加入如權(quán)利要求3所述的磷脂酶C進(jìn)行反應(yīng)為45°C條件下反應(yīng)2小時(shí)；所述離心分離為5000rpm條件下離心5分鐘取上層油相。
[0035]取植物油毛油100g(磷含量400-600ppm)，預(yù)熱至80°C，加入2.5mol/L檸檬酸
0.125ml,均質(zhì)Imin,于該溫度維持30min。冷卻至40~45°C,加入4mol/LNaOH溶液和2~3%的蒸餾水混合均勻，再加入0.5ml的重組大腸桿菌發(fā)酵液(即磷脂酶C酶液)，40~45°C反應(yīng)2~3小時(shí)。取樣,測定含磷含量。
[0036]采用這種方法可將植物油中的磷含量降到10ppm(相當(dāng)于磷脂含量低于0.26% )以下，滿足物理精煉的要求。
【具體實(shí)施方式】
[0037]在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明，但是本發(fā)明還可以采用其他不同于在此描述的其它方式來實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似推廣，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施例的限制。
[0038]下述實(shí)施例中所使用實(shí)驗(yàn)材料如下:大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coli JM109和E.coli BL21(DE3)為實(shí)驗(yàn)室保存；熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)為本實(shí)驗(yàn)室篩選，保藏編號為:CCTCC N0.M2013298 ；pMD18T-simple Vector、T4DNA連接酶和 10XT4連接酶Buffer購自寶生物工程(大連)有限公司；pET_28a(+)購自Novagen ;限制性內(nèi)切酶EcoR 1、Not I 以及共有 Buffer 購自 New England Biolabs。
[0039]實(shí)施例1憐脂酶C基因的克隆
[0040]根據(jù)NCBI 上提供的 Pseudomonas fluorescens A506 的憐脂酶 C 基因(NC_017911.1)的序列設(shè)計(jì)引物，其中，
[0041]上游引物5’ CGGAATTCATGTCAGGTCTTGAACTCGC3'，(下劃線為 EcoRI 酶切位點(diǎn));下游引物 5’ TTGCGGCCGCTTAGT TGGCGGGTTGGTTTGGC3’ ,(下劃線為 Not I 酶切位點(diǎn))。
[0042]以保藏編號為CCTCC N0.M2013298 的突光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)的基因組DNA為模板，運(yùn)用PCR的方法克隆得到磷脂酶C基因，并與載體pMD18T-Simple連接構(gòu)建克隆載體pMD-plc，將該克隆載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coli JM109，挑選陽性克隆，測序驗(yàn)證，其堿基序列如SEQ IDNO:1所示，結(jié)果表明磷脂酶C基因克隆成功。Blast序列比對分析顯示，該基因序列與已有磷脂酶C基因序列的同源性較低，最高為89%，拓寬了磷脂酶C的基因來源。
[0043]實(shí)施例2質(zhì)粒pET-P.f-PLC的構(gòu)建
[0044]用EcoR I和Not I對重組載體pMD-plc和表達(dá)載體pET_28a (+)進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)體系為 10 μ L:pET-28a(+) μ L、EcoR I 和 Not I 各 0.5 μ L、EcoR I 和 Not I 共用Bufferl μ L。回收目的基因和載體DNA，并用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系10 μ L:目的基因5μ L、載體DNA3y L、10XT4連接酶Bufferl μ L、T4DNA連接酶I μ L，于16°C反應(yīng)12h。
[0045]將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coli JM109，轉(zhuǎn)化方法如下:
[0046](I)取 E.coli JM109100 μ L 置于無菌 1.5ml EP 管中；
[0047](2)加入上述連接產(chǎn)物并輕輕混勻；
[0048](3)將上述EP管置于42°C恒溫水浴，計(jì)時(shí)1.5min,勿搖動EP管；
[0049](4)轉(zhuǎn)移EP管于冰浴中，冷卻2min ；[0050](5)每管加入無菌SOB培養(yǎng)基800 μ L，置于37°C培養(yǎng)箱復(fù)蘇Ih ；
[0051](6)以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心2min，吸去800 μ L上清培養(yǎng)基，用移液槍輕輕吹吸剩余培養(yǎng)基和細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至含終濃度100 μ g/ml卡那霉素的LB固體平板，涂勻并于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)16~24h ；
[0052](7)挑取陽性克隆，并經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切驗(yàn)證。
[0053]實(shí)施例3 重組大腸桿菌 Eschierichia coil BL21 (DE3) -pET-P.f-PLC, CCTCCN0.M2013299 的構(gòu)建
[0054]將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET-plc轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，轉(zhuǎn)化方法如下:
[0055](I)取 E.coli BL21 (DE3) 100 μ L 置于無菌 1.5ml 的 EP 管中；
[0056](2)加入上述重組質(zhì)粒pET-plc并輕輕混勻；
[0057](3)將上述EP管置于42°C恒溫水浴，精確計(jì)時(shí)1.5min,勿搖動EP管；
[0058](4)轉(zhuǎn)移EP管于冰浴中，冷卻2min ；
[0059](5)每管加入無菌LB培養(yǎng)基800 μ L，置于37°C培養(yǎng)箱復(fù)蘇Ih ；
[0060](6)以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心2min，吸去800 μ L上清培養(yǎng)基，用移液槍輕輕吹吸剩余培養(yǎng)基和細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至終濃度100 μ g/ml卡那霉素的LB固體平板，涂勻并于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)16~24小時(shí)；
[0061](7)挑取轉(zhuǎn)化子，酶切驗(yàn)證重組大腸桿菌BL21 (DE3) -pET-plc構(gòu)建成功，與等體積的體積分?jǐn)?shù)為30%的甘油 混勻，于_70°C保藏。
[0062]用重組大腸桿菌Eschierichia coil BL21 (DE3)-pET-P.f-PLC, CCTCCN0.M2013299制備磷脂酶C
[0063]實(shí)施例4
[0064](I)種子培養(yǎng):取50 μ L上述保藏的重組大腸桿菌EschierichiacoilBL21 (DE3)-pET-P.f-PLC, CCTCC N0.M2013299接種于種子培養(yǎng)基中，在回旋式搖床上于37°C振蕩培養(yǎng)10h，搖床轉(zhuǎn)速150r/min ;上述種子培養(yǎng)基成分按克/升計(jì)為:蛋白胨10g，酵母粉5g, NaCllOg,其余成分為水,于I X 105Pa高壓下滅菌20min。
[0065](2)液體發(fā)酵培養(yǎng):將經(jīng)過步驟⑴培養(yǎng)所得活化種子液按體積百分比5%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基裝于250ml三角瓶，裝液量為50ml，在回旋式搖床上于37°C振蕩培養(yǎng)4h小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速200r/min ;添加乳糖至終濃度為0.lg/L，在回旋式搖床上于18°C振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)30h，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min ;發(fā)酵完畢，得到發(fā)酵液；上述發(fā)酵培養(yǎng)基成分按克/升計(jì)為:蛋白胨10g，酵母粉5g，其余成分為0.25mol/LTris-HCl (pH7.2)，于I X 105Pa高壓下滅菌20min。
[0066](3)粗酶液的提取:將步驟(2)所得發(fā)酵液于4°C離心IOmin,轉(zhuǎn)速8000r/min ；收集菌體細(xì)胞沉淀，用50mmol/LTriS-HCl(pH7.2)重懸菌體，置于超聲破碎儀中超聲破碎lOmin，將所得超聲破碎液離心，取上清，即為胞內(nèi)粗酶液。利用p-NPPC法定量測得胞內(nèi)粗酶液的酶活達(dá)到360U/ml。
[0067]實(shí)施例5
[0068](I)種子培養(yǎng):取50 μ L上述保藏的重組大腸桿菌Eschierichia coilBL21(DE3)-pET-P.f-PLC, CCTCC N0.M2013299接種于種子培養(yǎng)基中，在回旋式搖床上于37°C振蕩培養(yǎng)10h，搖床轉(zhuǎn)速150r/min ;上述種子培養(yǎng)基成分按克/升計(jì)為:蛋白胨10g，酵母粉5g, NaCl IOg,其余成分為水,于I X 105Pa高壓下滅菌20min。
[0069](2)液體發(fā)酵培養(yǎng):將經(jīng)過步驟(1)培養(yǎng)所得活化種子液按體積百分比5%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基裝于250ml三角瓶，裝液量為50ml，在回旋式搖床上于37°C振蕩培養(yǎng)4h小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速200r/min ;添加乳糖至終濃度為0.lg/L，在回旋式搖床上于18°C振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)16h，搖床轉(zhuǎn)速為150r/min ；;再添加Triton X-100至終濃度為5g/L，同樣條件繼續(xù)發(fā)酵20h發(fā)酵完畢，得到發(fā)酵液；上述發(fā)酵培養(yǎng)基成分按克/升計(jì)為:蛋白胨10g，酵母粉 5g，其余成分為 0.25mol/L Tris-HCl(pH7.2)，于 I X 105Pa 高壓下滅菌 20min。
[0070](3)粗酶液的提取:將步驟(2)所得發(fā)酵液于4°C離心lOmin，轉(zhuǎn)速8000r/min ；收集菌體細(xì)胞沉淀，用50mmol/L Tris-HCl (pH7.2)重懸菌體，置于超聲破碎儀中超聲破碎lOmin，將所得超聲破碎液離心，取上清，即為胞內(nèi)粗酶液。利用p-NPPC法定量測得胞內(nèi)粗酶液的酶活達(dá)到408.5U/ml。
[0071]實(shí)施例6 —種磷脂酶C在菜籽油脫膠中的應(yīng)用，其步驟是:
[0072]A、取100g菜籽毛油(磷含量為186ppm)，預(yù)熱到80°C ；
[0073]B、加入的 2.5mol/L 朽1 檬酸 0.125ml,均質(zhì) Imin 后,保溫 30min ；
[0074]C、加入5mol/LNaOH0.25mL,蒸餾水3mL，磷脂酶C酶液(大腸桿菌BL21-pET_P.f-PLC)發(fā)酵得到，活力為360U/mL)500y L，2000rpm下均質(zhì)Imin，45°C條件下反應(yīng)I小時(shí)。
[0075]D、5000rpm離心5分鐘，取上層油相，采用GB5537-2008《植物油脂檢驗(yàn)磷脂測定法》測定脫膠處理后油品中的磷含量為5.449ppm，磷含量比脫膠前降低了 97.07%左右，可滿足物理精煉工藝的要求。
[0076]實(shí)施例7 —種磷脂酶C 在大豆油脫膠中的應(yīng)用，其步驟是:
[0077]A、取100g大豆毛油(磷含量為642ppm)，預(yù)熱到80°C ；
[0078]B、加入的 2.5mol/L 朽1 檬酸 0.125ml,均質(zhì) Imin 后,保溫 30min ；
[0079]C、加入5mol/L NaOH0.25mL,蒸餾水3mL，磷脂酶C酶液(大腸桿菌BL21-pET_P.f-PLC)發(fā)酵得到，活力為360U/mL)500y L，2000rpm下均質(zhì)lmin，45°C條件下反應(yīng)I小時(shí)。
[0080]D、5000rpm離心5分鐘，取上層油相，采用GB5537-2008《植物油脂檢驗(yàn)磷脂測定法》測定脫膠處理后油品中的磷含量為11.857ppm，磷含量比脫膠前降低了 98.15%左右，可滿足物理精煉工藝的要求。
[0081]應(yīng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)磷脂酶 C 的重組大腸桿菌(Eschierichia coil) BL21 (DE3)-pET-P.f-PLC，保藏編號為 CCTCC N0.M2013299o
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)磷脂酶C的重組大腸桿菌，其特征在于:由以下方法制的: (1)以保藏編號為CCTCCN0.M2013298的熒光假單胞菌的基因組為模版，克隆得到磷脂酶C基因，其喊基序列如SEQ ID NO: I所不所不； (2)將步驟(1)所得溶血性磷脂酶C基因克隆到表達(dá)載體pET-28a(+)上，得到重組載體； (3)將步驟(2)所得重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建得到重組大腸桿菌。
3.用權(quán)利要求1或2所述產(chǎn)磷脂酶C的重組大腸桿菌制備磷脂酶C的方法，其特征在于:以該產(chǎn)磷脂酶C的重組大腸桿菌為發(fā)酵菌株進(jìn)行液體發(fā)酵，制備磷脂酶C。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述制備磷脂酶C的方法，其特征在于:具體步驟如下: (1)種子培養(yǎng):將所述產(chǎn)磷脂酶C的重組大腸桿菌BL21(DE3) -pET-P.f-PLC, CCTCCN0.M2013299接種于種子培養(yǎng)基中，于30~37°C振蕩培養(yǎng)8~12h，搖床轉(zhuǎn)速150~200r/min ； (2)液體發(fā)酵培養(yǎng):將經(jīng)過步驟(1)培養(yǎng)所得活化種子液按體積百分比3~10%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，于30~37°C振蕩培養(yǎng)4~6h小時(shí)，搖床轉(zhuǎn)速150~200r/min ;再添加乳糖，于20~30°C振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)14~22h，搖床轉(zhuǎn)速150~200r/min ;最后添加TritonX-100，于相同條件下繼續(xù)振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)18~36h，發(fā)酵完畢，得到發(fā)酵液； (3)粗酶液的提取:將步驟(2)所 得發(fā)酵液離心；收集上清液，即為胞外粗酶液；收集菌體細(xì)胞沉淀并超聲破碎，將所得超聲破碎液離心，取上清，即為胞內(nèi)粗酶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備磷脂酶C的方法，其特征在于:步驟(1)所述種子培養(yǎng)基成分按克/升計(jì)為:蛋白胨9~Ilg,酵母粉4~6g, NaC19~llg，其余成分為水。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備磷脂酶C的方法，其特征在于:步驟(2)所述發(fā)酵培養(yǎng)基成分按克/升計(jì)為:蛋白胨9~Ilg,酵母粉5~24g,甘油O~5g,其余成分為0.25mol/LTris-HCl0
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備磷脂酶C的方法，其特征在于:步驟(2)所述乳糖的添加量為每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基O~5g。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述制備溶血性磷脂酶C的方法，其特征在于:步驟(2)所述Tritonx-100的添加量為每升所述發(fā)酵培養(yǎng)基O~10g。
9.一種植物毛油脫膠的方法，其特征在于:包括， 植物毛油的預(yù)熱和酸預(yù)處理； 加入如權(quán)利要求3所述的磷脂酶C進(jìn)行反應(yīng)； 滅酶，離心分離完成脫膠。
10.根據(jù)權(quán)利要求10所述植物毛油脫膠的方法，其特征在于:所述預(yù)熱為預(yù)熱到80°C;所述酸預(yù)處理為加入檸檬酸均質(zhì)；所述加入如權(quán)利要求3所述的磷脂酶C進(jìn)行反應(yīng)為45°C條件下反應(yīng)I小時(shí)；所述離心分離為5000rpm條件下離心5分鐘取上層油相。
【文檔編號】C12N9/16GK103509748SQ201310283434
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年7月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月7日
【發(fā)明者】常明, 梁麗, 劉睿杰, 金青哲, 王興國, 劉元法 申請人:江南大學(xué)