一種制備雌二醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物細(xì)胞工程領(lǐng)域，涉及一種制備雌二醇的方法，具體涉及使用誘導(dǎo)后哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)制備雌二醇的方法。本發(fā)明的方法中，采用由哺乳動(dòng)物細(xì)胞通過體外的特殊誘導(dǎo)所產(chǎn)生的細(xì)胞群，在體外特定的條件下培養(yǎng)，能源源不斷地分泌雌激素；所述體系中雌激素的分泌完全模擬體內(nèi)的合成過程，生成雌二醇過程中的副產(chǎn)品少、方法簡單、條件溫和，對(duì)環(huán)境幾乎不構(gòu)成危害；與現(xiàn)有技術(shù)的制備手段相比具有不可取代的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明方法在體外經(jīng)過特殊條件誘導(dǎo)后哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞具有產(chǎn)生雌二醇的能力，該方法為獲得雌二醇提供了一條新的途徑。
【專利說明】一種制備雌二醇的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物細(xì)胞工程領(lǐng)域，涉及制備雌二醇的方法，具體涉及一種使用誘導(dǎo)后哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)制備雌二醇的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有技術(shù)公開了人體生理性存在的雌激素主要有三種:雌二醇、雌酮和雌三醇，其主要由卵巢、濾泡、黃體及妊娠胎盤生成，對(duì)于維持女性第二性征意義重大，缺乏雌激素會(huì)引起女性身體多個(gè)器官功能減退。據(jù)資料顯示，女性進(jìn)入更年期，雌激素急劇降低，僅僅在美國，女性更年期的雌激素類藥物進(jìn)行替代治療的產(chǎn)值已近20億美金。
[0003]目前，用于補(bǔ)充雌激素的最主要藥物有兩類，一類為來源于馬尿的雌酮；另一類為化學(xué)合成的雌二醇。馬尿雌酮是最早應(yīng)用的雌激素替代物，被全世界廣泛應(yīng)用達(dá)數(shù)十年之久，幾乎成為雌激素的代名詞，其制備和純化的方法已相當(dāng)成熟。但研究顯示，人體真正需要的雌激素為雌二醇，而孕馬尿中的雌激素成分主要是雌酮、馬烯雌酮、馬奈雌酮等；所述雌酮為雌二醇的代謝產(chǎn)物，活性不足雌二醇的十分之一，且有提高心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)、肝損傷、乳腺癌等毒副作用；因此由于雌酮具有高度的副作用，而通常被俗認(rèn)為是壞雌激素。
[0004]雌二醇主要來源于化學(xué)合成，由于化學(xué)合成雌二醇具有合成路徑很長、副產(chǎn)物多及污染環(huán)境的問題，排放到環(huán)境中的雌激素類似物產(chǎn)生的生態(tài)環(huán)境問題也日趨受到重視。作為類固醇激素，雌激素與蛋白質(zhì)激素不同，無法循傳統(tǒng)的“DNA——mRNA——蛋白質(zhì)”這一傳統(tǒng)的生物工程路徑進(jìn)行，而只能利用膽固醇為原料由細(xì)胞內(nèi)的酶系進(jìn)行合成。在生理狀況下雌激素主要來源于卵泡內(nèi)膜細(xì)胞和卵泡顆粒細(xì)胞；在卵泡發(fā)育過程中，先經(jīng)促黃體生成素(LH)刺激卵泡內(nèi)膜分泌睪酮，再經(jīng)顆粒細(xì)胞在卵泡刺激素(FSH)刺激下轉(zhuǎn)化為雌二醇并進(jìn)一步代謝生成其他雌激素成分。雌激素的生成涉及多種細(xì)胞和激素的協(xié)同作用，由于各種細(xì)胞間、激素間調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜，為細(xì)胞工程制備雌激素帶來了困難。，迄今為止，尚未見有關(guān)細(xì)胞工程制備雌激素的報(bào)道。
[0005]本申請(qǐng)的發(fā)明人擬提供一種通過基因工程或細(xì)胞工程制備雌二醇的方法。
[0006]與本發(fā)明有關(guān)的參考文獻(xiàn):
1.Beral V; Mill1n Women Study Collaborators, Bull D，Green J，Reeves
G.0varian cancer and hormone replacement therapy in the Mill1n Women Study.Lancet.2007; 369:1703—1710.2.Scarabin PYj Hemker HCj Clement C， Soisson V， Alhenc-Gelas M.1ncreasedthrombin generat1n among postmenopausal women using hormone therapy:1mportance of the route of estrogen administrat1n and progestogens.Menopause.2011; 18:873-9.3.Renoux C， Suissa S.Hormone therapy administrat1n in postmenopausalwomen and risk of stroke.Womens Health (Lond Engl).2011; 7:355-61.4.Liu Cj Xu Sj Ma Z，Zeng Y，Chen Z，Lu Y.Generat1n of pluripotentcancer-1nitiating cells from transformed bone marrow-derived cells.CancerLett.2011; 303(2):140-9.5.Nicholas CR， Chavez SLj Baker VLj Reijo Pera RA.1nstructing an embryonicstem cell-derived oocyte fate: lessons from endogenous oogenesis.Endocr Rev2009; 30: 264 - 283.。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種制備雌二醇的方法，具體涉及一種通過基因工程或細(xì)胞工程制備雌二醇的方法，尤其涉及使用誘導(dǎo)后哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)制備雌二醇的方法；該方法通過利用誘導(dǎo)后哺乳動(dòng)物細(xì)胞，建立體外細(xì)胞工程，制備雌二醇。
[0008]本發(fā)明所述方法中，所采用的細(xì)胞群由哺乳動(dòng)物細(xì)胞通過特殊的誘導(dǎo)方式，包括化合物處理、基因?qū)?、天然物質(zhì)誘導(dǎo)、病毒感染、輻射誘導(dǎo)、體外長期培養(yǎng)等方法誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的哺乳細(xì)胞后，使具有產(chǎn)生雌二醇的能力；由于上述體系中雌二醇的分泌模擬了體內(nèi)的生物合成過程，因此產(chǎn)生的雌激素具有與起始細(xì)胞具有完全的物種同源性，生成雌二醇過程中的副產(chǎn)品少，條件溫和；對(duì)環(huán)境幾乎不構(gòu)成危害。
[0009]具體的，本發(fā)明的制備雌二醇的方法，其特征在于，其包括步驟:
(O離體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞使用現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行原代培養(yǎng)；
(2)誘導(dǎo)處理上述哺乳動(dòng)物細(xì)胞,得到誘導(dǎo)后哺乳動(dòng)物細(xì)胞；
(3)檢測(cè)、分析上述誘導(dǎo)后哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生雌二醇的能力；
(4)按現(xiàn)有方法分離、純化，制得純的雌二醇。
[0010]更具體的，本發(fā)明的制備雌二醇的方法，其特征在于，包括步驟:
(O離體哺乳動(dòng)物細(xì)胞采用現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行原代培養(yǎng)制備，制備的細(xì)胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37°C，5%C02，直至15個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)瓶；
(2)培養(yǎng)基中加入MCA，使其終濃度為lug/ml，并每周更換含MCA的培養(yǎng)基2次;MCA處理I周后結(jié)束；細(xì)胞在37°C，5%C02環(huán)境中，持續(xù)常規(guī)培養(yǎng)；
(3)培養(yǎng)至3個(gè)月，培養(yǎng)物中見細(xì)胞中出現(xiàn)生殖細(xì)胞樣細(xì)胞；該生殖細(xì)胞樣細(xì)胞表達(dá)生殖細(xì)胞的標(biāo)志物:0ct4、Nanos3、c-Kit、DAZL、Vasa ；
本發(fā)明中，培養(yǎng)液中檢測(cè)到雌二醇的持續(xù)表達(dá)，與未經(jīng)誘導(dǎo)處理hBMDCs(E2=65±14.8pmol/L，n=6)相比，MCA 誘導(dǎo)后 hBMDCs 中(E2=3243±947 pmol/L, n=6)雌二醇的濃度高達(dá)50倍(p〈0.01)差異有顯著性；重新傳代后，觀察到隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，雌二醇濃度進(jìn)行性增加，傳代培養(yǎng)至10天左右達(dá)到高峰，高達(dá)4500pmol/L，隨后逐步下降，最終維持到較高水平；
體內(nèi)雌二醇是由卵巢中卵泡合成，本發(fā)明中，在體外培養(yǎng)的誘導(dǎo)后hBMDCs中，觀察到卵泡樣結(jié)構(gòu)的形成；卵母細(xì)胞的發(fā)育需雌二醇的促進(jìn)，若缺乏雌二醇，卵母細(xì)胞的最大只能長到25微米；而本發(fā)明誘導(dǎo)后hBMDCs中的卵母細(xì)胞樣細(xì)胞體積達(dá)到40-50微米；免疫熒光證實(shí)上述大細(xì)胞為卵母細(xì)胞；
本發(fā)明涉及的卵泡相關(guān)基因，包括雌二醇合成的關(guān)鍵性基因:STAR、p450arom、p450cl7,以及卵泡發(fā)育相關(guān)基因⑶F9在培養(yǎng)物中表達(dá)； 本發(fā)明經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)條件，能增加雌二醇產(chǎn)生的能力，并降低培養(yǎng)液中血清的濃度；上述生殖細(xì)胞樣細(xì)胞可進(jìn)一步增大產(chǎn)生早期卵泡樣結(jié)構(gòu)和卵母細(xì)胞樣細(xì)胞；
(4)按現(xiàn)有方法分離、純化，制得雌二醇。
[0011]本發(fā)明中，所述細(xì)胞系可通過誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物正常細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的方式制備，誘導(dǎo)方式可包括化合物誘導(dǎo)、天然物質(zhì)處理、基因?qū)?、輻射誘導(dǎo)、病毒誘導(dǎo)或長時(shí)間傳代等方式進(jìn)行；所述的誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞在較高的細(xì)胞密度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，可自發(fā)的增殖和分化成為包括多能干細(xì)胞樣細(xì)胞、顆粒細(xì)胞樣細(xì)胞、原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞、卵母細(xì)胞樣細(xì)胞的細(xì)胞群，繼續(xù)培養(yǎng)上述細(xì)胞可進(jìn)一步自組織產(chǎn)生濾泡樣結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生的雌激素分泌在培養(yǎng)液中，可使用現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行富集和純化，制得雌二醇。
[0012]本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)有:
本發(fā)明通過細(xì)胞工程手段制備雌二醇，其中所采用的細(xì)胞群由哺乳動(dòng)物細(xì)胞通過體外的特殊誘導(dǎo)所產(chǎn)生；所述細(xì)胞群可在體外特定的條件下培養(yǎng)，源源不斷地分泌雌激素；所述體系中雌激素的分泌完全模擬了體內(nèi)的合成過程，生成雌二醇過程中的副產(chǎn)品少、方法簡單、條件溫和，對(duì)環(huán)境幾乎不構(gòu)成危害；與現(xiàn)有技術(shù)的制備手段相比具有不可取代的優(yōu)勢(shì)。
[0013]本發(fā)明的制備雌激素的細(xì)胞工程方法，在體外經(jīng)過特殊條件誘導(dǎo)后哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞具有產(chǎn)生雌二醇的能力，該方法為獲得雌二醇提供了一條新的途徑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為MCA誘導(dǎo)后，hBMDCs產(chǎn)生生殖細(xì)胞樣細(xì)胞，其中，
A =MCA誘導(dǎo)后，hBMDCs中出現(xiàn)生殖細(xì)胞樣細(xì)胞；
B:生殖細(xì)胞樣細(xì)胞表達(dá)生殖細(xì)胞相關(guān)蛋白:0ct4、Nanos3、c-Kit、DAZL、Vasa。
[0015]圖2顯示了誘導(dǎo)前后雌二醇濃度變化，其中，與未經(jīng)誘導(dǎo)處理hBMDCs(E2=65±14.8pmol/L，n=6)相比，MCA 誘導(dǎo)后 hBMDCs 中(E2=3243±947 pmol/L, n=6)雌二醇的濃度高達(dá)50倍(p〈0.01)。
[0016]圖3為培養(yǎng)物中雌二醇濃度變化曲線。，其中，MCA誘導(dǎo)后，培養(yǎng)的hBMDCs上清中出現(xiàn)雌二醇(E2);傳代初期，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長雌二醇進(jìn)行性增加，然后逐步降低。
[0017]圖4為MCA誘導(dǎo)的hBMDCs中出現(xiàn)早期卵泡樣結(jié)構(gòu)及卵母細(xì)胞樣細(xì)胞，其中，
(A-B)早期卵泡樣結(jié)構(gòu)；(C-D)早期卵泡樣結(jié)構(gòu)中，體積較大的細(xì)胞表達(dá)生殖細(xì)胞的標(biāo)志0ct4，而周圍細(xì)胞不表達(dá)；(1-G)卵母細(xì)胞樣細(xì)胞；(H-M)卵母細(xì)胞樣細(xì)胞表達(dá)卵母細(xì)胞相關(guān)的標(biāo)志，Vasa、SCP3、DAZL、⑶F9 ;標(biāo)尺:20微米。
[0018]圖5為誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)卵泡相關(guān)的基因其中，雌二醇合成的關(guān)鍵性基因:STAR、p450arom,p450cl7 ;以及卵泡發(fā)育相關(guān)基因⑶F9在培養(yǎng)物中表達(dá)。
[0019]圖6為本發(fā)明所述制備方法的流程圖。
[0020]

【具體實(shí)施方式】
[0021]本發(fā)明的實(shí)施過程將通過下面的非限制性實(shí)例予以說明。
[0022]實(shí)施例1 采用人骨髓來源細(xì)胞使用化合物三甲基膽蒽(MCA)誘導(dǎo)產(chǎn)生并篩選出本發(fā)明所述的細(xì)胞，并使用該細(xì)胞在體外合成性雌二醇；所述細(xì)胞已由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào) CCTCC C2012173 ；
制備步驟為:
(1)人骨髓來源細(xì)胞(HMBDCS，主要成分為人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞)采用現(xiàn)有技術(shù)(本實(shí)施例采用骨髓沖洗、貼壁法)進(jìn)行原代培養(yǎng)制備，制備的細(xì)胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37°C，5%C02，直至15個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)瓶；
(2)培養(yǎng)基中加入MCA，使其終濃度為lug/ml，并每星期更換含MCA的培養(yǎng)基2次;MCA處理I周后結(jié)束；細(xì)胞在37°C，5%C02環(huán)境中，持續(xù)常規(guī)培養(yǎng)；
(3)培養(yǎng)至3個(gè)月，培養(yǎng)物中可見細(xì)胞中出現(xiàn)生殖細(xì)胞樣細(xì)胞(如圖1A所示)；上述生殖細(xì)胞樣細(xì)胞表達(dá)生殖細(xì)胞的標(biāo)志物:Oct4、Nanos3、c-Kit、DAZUVasa(如圖1B所示)；
(4)培養(yǎng)液中檢測(cè)到雌二醇的持續(xù)表達(dá)，與未經(jīng)誘導(dǎo)處理hBMDCs(E2=65±14.8pmol/L, n=6)相比，MCA 誘導(dǎo)后 hBMDCs 中(E2=3243±947 pmol/L，n=6)雌二醇的濃度高達(dá) 50倍(p〈0.01)差異有顯著性(如圖2所示);重新傳代后，觀察到隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，雌二醇濃度進(jìn)行性增加，傳代培養(yǎng)至10天左右達(dá)到高峰，高達(dá)4500pmol/L，隨后逐步下降，最終維持到較高水平(如圖3所示)；
(5)體內(nèi)雌二醇是由卵巢中卵泡合成，在體外培養(yǎng)的誘導(dǎo)后hBMDCs中，觀察到卵泡樣結(jié)構(gòu)的形成(如圖4A-E所示，為誘導(dǎo)后hBMDCs中產(chǎn)生雌激素提供細(xì)胞支持);卵母細(xì)胞的發(fā)育需雌二醇的促進(jìn)，若缺乏雌二醇，卵母細(xì)胞的最大只能長到25微米；而誘導(dǎo)后hBMDCs中的卵母細(xì)胞樣細(xì)胞體積達(dá)到40-50微米(如圖41-G所示);免疫熒光證實(shí)上述大細(xì)胞為卵母細(xì)胞(如圖4H-M所示)；
(6)卵泡相關(guān)基因，包括雌二醇合成的關(guān)鍵性基因:STAR、p450arom、p450cl7，以及卵泡發(fā)育相關(guān)基因GDF9在培養(yǎng)物中表達(dá)(如圖5所示，進(jìn)一步支持誘導(dǎo)后hBMDCs具有合成雌二醇的能力)；
(7)優(yōu)化培養(yǎng)條件，增加雌二醇產(chǎn)生的能力，并降低培養(yǎng)液中血清的濃度(有利于雌二醇的進(jìn)一步分離純化)；上述生殖細(xì)胞樣細(xì)胞可進(jìn)一步增大產(chǎn)生早期卵泡樣結(jié)構(gòu)和卵母細(xì)胞樣細(xì)胞；
(8)按現(xiàn)有方法分離、純化，制得雌二醇。
[0023]實(shí)施例2
采用小鼠骨髓來源細(xì)胞(mBMDCs)經(jīng)體外長期培養(yǎng)誘導(dǎo)后，產(chǎn)生并篩選出本發(fā)明所述的細(xì)胞，并使用該細(xì)胞在體外合成性雌二醇；其具體步驟為:
Cl)分離純化小鼠骨髓來源細(xì)胞(mBMDCs)，在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)，傳約20代后或連續(xù)培養(yǎng)約6個(gè)后，誘導(dǎo)后的mBMDCs具有產(chǎn)生雌二醇的能力；
(2)所述誘導(dǎo)后細(xì)胞產(chǎn)生雌二醇的濃度，最高可達(dá)5000pmol/L。
[0024]實(shí)施例3
采用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，經(jīng)體外導(dǎo)入多能性基因0ct4、Sox2、Nanog、c_KIT誘導(dǎo)后，產(chǎn)生并篩選出本發(fā)明所述的細(xì)胞，并使用該細(xì)胞在體外合成性雌二醇；步驟為:
(O分離培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞；
(2)采用基因?qū)氲姆椒?，轉(zhuǎn)入多能性基因0ct4、SOX2、NanOg、c-KIT，篩選獲得的所述細(xì)胞，選出能產(chǎn)生較高濃度雌二醇的細(xì)胞，增殖培養(yǎng)；
(3)上述誘導(dǎo)后細(xì)胞產(chǎn)生雌二醇的濃度，可達(dá)約3000pmol/L。
[0025]實(shí)施例4
采用豬胚胎皮膚細(xì)胞，經(jīng)X線誘導(dǎo)后，產(chǎn)生并篩選出本發(fā)明所述的細(xì)胞，并使用該細(xì)胞在體外合成性雌二醇；步驟為:
(1)分離豬胚胎皮膚細(xì)胞；
(2)采用X線誘導(dǎo)處理豬胚胎皮膚細(xì)胞；篩選獲得的細(xì)胞，選出能產(chǎn)生較高濃度雌二醇的細(xì)胞，增殖培養(yǎng)；
(3)上述誘導(dǎo)后細(xì)胞產(chǎn)生雌二醇的濃度，可達(dá)約2500pmol/L。
[0026]實(shí)施例5
采用大鼠胚胎干細(xì)胞，經(jīng)分化誘導(dǎo)后，產(chǎn)生并篩選出本發(fā)明所述的細(xì)胞，并使用該細(xì)胞在體外合成性雌二醇；步驟為:
(1)分離大鼠胚胎干細(xì)胞；
(2)將獲得的大鼠胚胎干細(xì)胞去除支持細(xì)胞和LIF因子，使其自發(fā)或在維甲酸的作用下，發(fā)生分化；篩選獲得的細(xì)胞，選出能產(chǎn)生較高濃度雌二醇的細(xì)胞，增殖培養(yǎng)；
(3)上述誘導(dǎo)后細(xì)胞產(chǎn)生雌二醇的濃度，可達(dá)約4000pmol/L。
【權(quán)利要求】
1.一種制備雌二醇的方法，其特征在于，其包括步驟: (1)離體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)； (2)誘導(dǎo)處理上述哺乳動(dòng)物細(xì)胞,得誘導(dǎo)后哺乳動(dòng)物細(xì)胞； (3)檢測(cè)、分析誘導(dǎo)后哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生雌二醇的能力； (4)分離、純化，制得純的雌二醇。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于， 步驟(I)中，離體哺乳動(dòng)物細(xì)胞原代培養(yǎng)，制備的細(xì)胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37°C，5%C02，至15個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)瓶； 步驟(2)中，培養(yǎng)基中加入MCA，使其終濃度為lug/ml，每周更換含MCA的培養(yǎng)基2次；MCA處理I周；細(xì)胞在37°C，5%C02環(huán)境中，持續(xù)常規(guī)培養(yǎng)； 步驟(3)中，培養(yǎng)至3個(gè)月，培養(yǎng)物中出現(xiàn)生殖細(xì)胞樣細(xì)胞；該生殖細(xì)胞樣細(xì)胞表達(dá)生殖細(xì)胞的標(biāo)志物:0ct4、Nanos3、c_Kit、DAZL> Vasa。
3.按權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，MCA誘導(dǎo)后hBMDCs中雌二醇高濃度表達(dá)；誘導(dǎo)后hBMDCs中有卵泡樣結(jié)構(gòu)形成；和卵泡發(fā)育相關(guān)基因⑶F9在培養(yǎng)物中表達(dá)。
4.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物的誘導(dǎo)方式選自化合物誘導(dǎo)、天然物質(zhì)處理、基因?qū)?、輻射誘導(dǎo)、病毒誘導(dǎo)或傳代方式。
5.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的誘導(dǎo)的細(xì)胞在較高的細(xì)胞密度條件下培養(yǎng)后，增殖和分化成多能干細(xì)胞樣細(xì)胞、顆粒細(xì)胞樣細(xì)胞、原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞或卵母細(xì)胞樣細(xì)胞的細(xì)胞群，繼續(xù)培養(yǎng)所述細(xì)胞產(chǎn)生濾泡樣結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生雌激素。
6.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，原代培養(yǎng)為骨髓沖洗或貼壁法。
7.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的離體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞采用人骨髓來源細(xì)胞(HMBDCs，保藏號(hào)CCTCC C2012173)，小鼠骨髓來源細(xì)胞(mBMDCs)，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，豬胚胎皮膚細(xì)胞，或大鼠胚胎干細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12P33/00GK104293873SQ201310297273
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2013年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月16日
【發(fā)明者】劉春芳, 呂元, 馬展 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院