一種檢測(cè)食品中馬肉成分的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)食品中馬肉成分的方法。本發(fā)明提供了用于檢測(cè)食品中馬肉成分的6對(duì)不同目的片段的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、NO.2、NO.3、NO.4、NO.5、NO.6、NO.7、NO.8、NO.9、NO.10、NO.11、NO.12所示。本發(fā)明還提供了含有上述引物組的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒可以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)肉制品中是否摻雜馬肉，其中對(duì)于檢測(cè)深加工肉制品效果尤為明顯。本發(fā)明還可為食品檢驗(yàn)人員在對(duì)比檢測(cè)其他肉源時(shí)提供靈活多變的目的片段，進(jìn)而提高檢測(cè)效率，另外本發(fā)明提供的引物也可作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物，對(duì)食品中摻雜的馬肉成分進(jìn)行定量，更好的應(yīng)用于食品檢測(cè)領(lǐng)域。
【專利說明】-種檢測(cè)食品中馬肉成分的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品檢測(cè)領(lǐng)域和分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來說，涉及一種利用PCR 技術(shù)檢測(cè)食品中馬肉成分的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 2013年1月中旬英國(guó)和愛爾蘭發(fā)現(xiàn)部分超市出售的牛肉漢堡中摻雜了馬肉和其 他肉類，其中在被檢測(cè)的27種漢堡中，有10種含有馬肉。此后，"掛牛頭賣馬肉"的事件持 續(xù)擴(kuò)大，多個(gè)歐洲國(guó)家卷入丑聞中，消費(fèi)者對(duì)食品工業(yè)的信任遭受了嚴(yán)重的打擊，歐盟也為 此對(duì)成員國(guó)的加工牛肉展開"DNA檢測(cè)"以消除"馬肉風(fēng)波"憂慮，恢復(fù)消費(fèi)者信心。
[0003] 在我國(guó)，近年來食品安全問題群眾反映強(qiáng)烈、社會(huì)關(guān)注度高。一些食品生產(chǎn)商為一 己私利，投機(jī)取巧、以次充好、偷工減料，在損害消費(fèi)者利益的同時(shí)，嚴(yán)重危害人們的生命健 康。此外，我國(guó)還沒有健全統(tǒng)一的熟肉制品快速檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。通常對(duì)于生肉制品我們可以通 過味道、色澤、肌肉紋理等進(jìn)行檢測(cè)，但對(duì)于經(jīng)過加工的熟肉制品我們很難用這種傳統(tǒng)的理 化方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0004] PCR技術(shù)（Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應(yīng)）作為一種快速而又靈敏 度高、特異性強(qiáng)的分子生物學(xué)檢測(cè)手段，已廣泛應(yīng)用于諸多檢測(cè)領(lǐng)域。同時(shí)由于線粒體DNA 為核外遺傳物質(zhì)，種內(nèi)高度保守，同時(shí)與核DNA相比，具有分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、母性遺傳方式遺 傳、進(jìn)化速度快等特點(diǎn)，大量存在于組織細(xì)胞中，具有抗腐蝕性，使用少量樣品即可進(jìn)行PCR 反應(yīng)。本發(fā)明利用PCR技術(shù)，擴(kuò)增馬的線粒體DNA (mtDNA)達(dá)到檢測(cè)目的。檢測(cè)手段不僅簡(jiǎn) 便易行，而且時(shí)間周期短、效率高、適用于食品快速檢測(cè)領(lǐng)域。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于，提供一組優(yōu)選后的檢測(cè)食品中馬肉成分的PCR引物對(duì)。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種含有上述引物組，用于檢測(cè)食品中馬肉成分的試 劑盒。
[0007] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是為食品檢驗(yàn)人員對(duì)比檢測(cè)其他肉源提供靈活多變的選擇， 進(jìn)而提高檢測(cè)效率，更好的應(yīng)用于食品檢測(cè)領(lǐng)域。
[0008] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是為進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)食品中摻雜馬肉成分的含 量提供引物對(duì)。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：
[0010] 一種檢測(cè)食品中馬肉成分的PCR引物組，由1號(hào)引物對(duì)、2號(hào)引物對(duì)、3號(hào)引物對(duì)、4 號(hào)引物對(duì)、5號(hào)引物對(duì)、6號(hào)引物對(duì)組成，所述1號(hào)引物對(duì)的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 1 和2所示，所述2號(hào)引物對(duì)的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 3和4所示，所述3號(hào)引物對(duì) 的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 5和6所不，所述4號(hào)引物對(duì)的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 7和8所示，所述5號(hào)引物對(duì)的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 9和10所示，所述6號(hào)引 物對(duì)的核苷酸序列分另如SEQ ID NO. 11和12所示。
[0011] 一種檢測(cè)食品中馬肉成分的試劑盒，包括引物組、PCR管、DNA聚合酶、PCR緩沖液、 dNTPs，所述引物組由1號(hào)引物對(duì)、2號(hào)引物對(duì)、3號(hào)引物對(duì)、4號(hào)引物對(duì)、5號(hào)引物對(duì)、6號(hào)引物 對(duì)組成，所述1號(hào)引物對(duì)的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 1和2所示，所述2號(hào)引物對(duì)的核 苷酸序列分別如SEQ ID NO. 3和4所示，所述3號(hào)引物對(duì)的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 5 和6所示，所述4號(hào)引物對(duì)的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 7和8所示，所述5號(hào)引物對(duì)的 核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 9和10所示，所述6號(hào)引物對(duì)的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 11和12所示。
[0012] 本發(fā)明的引物組擴(kuò)增的目的片段大小如下，1號(hào)引物對(duì)：183bp ;2號(hào)引物對(duì)： 202bp ;3號(hào)引物對(duì)：231bp ;4號(hào)引物對(duì)：266bp ;5號(hào)引物對(duì)：268bp ;6號(hào)引物對(duì)：300bp。
[0013] 本發(fā)明的試劑盒可以快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)肉制品中的馬肉成分。特別是針對(duì)線 粒體DNA降解嚴(yán)重的深加工肉制品，因提供引物的目的片段均為小片段，可以很好的進(jìn)行 檢測(cè)，進(jìn)而克服了目的片段過大，在實(shí)際檢測(cè)中無法針對(duì)熟肉制品進(jìn)行檢測(cè)的情況。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1-圖6分別為本發(fā)明中涉及的6對(duì)引物，S卩1號(hào)引物對(duì)、2號(hào)引物對(duì)、3號(hào)引物 對(duì)、4號(hào)引物對(duì)、5號(hào)引物對(duì)、6號(hào)引物對(duì)，分別對(duì)8個(gè)物種的肉制品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增 的結(jié)果，M 為 DL2000DNA Ma rker (從下往上，100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp); 1-8分別為豬、牛、羊、雞、鴨、馬、鹿、狗的基因組DNA。
[0015] 圖7為本發(fā)明中涉及的6對(duì)引物對(duì)經(jīng)深加工的市售馬肉制品基因組DNA的PCR擴(kuò) 增結(jié)果，]?為01^20000嫩1&^1?51'(從下往上，10(^口、25(^口、50(^口、75(^口、100(^口、200(^口） ； 1、2、3、4、5、6分別為1號(hào)引物對(duì)、2號(hào)引物對(duì)、3號(hào)引物對(duì)、4號(hào)引物對(duì)、5號(hào)引物對(duì)、6號(hào)引物 對(duì)。

【具體實(shí)施方式】
[0016] 以下通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。
[0017] 實(shí)施例1
[0018] 本發(fā)明所提供的6對(duì)引物，經(jīng)PCR反應(yīng)擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度如下，1號(hào)引物對(duì)： 183bp ;2號(hào)引物對(duì)：202bp ;3號(hào)引物對(duì)：231bp ;4號(hào)引物對(duì)：266bp ;5號(hào)引物對(duì)：268bp ;6號(hào) 引物對(duì)：300bp。
[0019] 1.肉制品的基因組DNA提取
[0020] 將樣品處理成肉末狀，取30mg加入1.5mlEP管中；加入500μ 1裂解液（1M tris-Hcl ΡΗ8. 0 ;0· 5Μ EDTA ΡΗ8. 0 ;5M Nacl ;0· 5 % N-Lanroyl SarcOsine ;蛋白酶 K ; RNaseA)70°C消化0. 5-lh或50°C過夜消化，離心（12000r/min，5-15min)，取上清；加等體 積的酚、氯仿與異戊醇（25 : 24 : 1)抽提；取400μ1水相，加 ^ylNacLlml冰乙醇， 冰上放置30min ;離心（12000r/min，5min)，棄上清；用lmUO%無水乙醇洗3次，瞭干；力口 70-100μ 1TE，靜置 30min。
[0021] 所提基因組DNA放置于-20°C冰箱中保存，為以后實(shí)驗(yàn)使用。
[0022] 2.引物設(shè)計(jì)
[0023] 首先從 NCBI (National Center for Biotechnology Information，美國(guó)國(guó)家生物 技術(shù)信息中心）的Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中找到馬與牛的線粒體DNA全序列（馬Equus caballus 登陸號(hào)：NC_001640. 1 ;牛Bos Taurus登陸號(hào)：NC_006853. 1)，進(jìn)行序列比對(duì)。再分別將馬 的線粒體DNA全序列、馬線粒體DNA編碼的十三個(gè)多肽序列和馬線粒體DNA序列分解成3 段、4段、5段、14段后的序列放入Primerf. 0中進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。在設(shè)計(jì)引物的同時(shí)參考馬 (Equus caballus)與牛（Bos Taurus)的序列對(duì)比結(jié)果，保證設(shè)計(jì)出的用于擴(kuò)增馬線粒體 基因組片段的引物序列不與牛線粒體基因組任意序列匹配。同時(shí)考慮到熟肉制品的基因組 DNA降解明顯，因而所設(shè)引物范圍為100bp-400bp。并且為了增強(qiáng)引物的特異性，所設(shè)引物 的TM值均在55°C-62°C之間。根據(jù)以上條件，挑選出數(shù)十對(duì)引物進(jìn)行合成。以豬、牛、羊、 雞、鴨、馬、鹿、狗全基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增檢驗(yàn)引物特異性與產(chǎn)物量，挑選最優(yōu)引物 對(duì)，即本發(fā)明所提供的6對(duì)引物。篩選結(jié)果如下，
[0024] 1號(hào)引物對(duì)：
[0025] F :5' -CCTTCACCACCACATCTCTA-3'（序列表中 SEQ ID NO. 1 所示）
[0026] R :5' -AGATGATTCGGGTACTGTAGAC-3'（序列表中 SEQ ID NO. 2 所示）
[0027] 2號(hào)引物對(duì)：
[0028] F :5' -AACCCCACAAAACTAACAACA-3'（序列表中 SEQ ID NO. 3 所示）
[0029] R :5' -GGGCTGGTAGGTCAATAAAA-3'（序列表中 SEQ ID NO. 4 所示）
[0030] 3號(hào)引物對(duì)：
[0031] F :5' -ACCAAACCCACGCTTACCAC-3'（序列表中 SEQ ID NO. 5 所示）
[0032] R :5' -GGAGTCCCTTTTGAACGATTGA-3'（序列表中 SEQ ID NO. 6 所示）
[0033] 4號(hào)引物對(duì)：
[0034] F :5' -AGACCCCAACAAGCAACGAT-3'（序列表中 SEQ ID NO. 7 所示）
[0035] R :5' -GCAGTATCCTGAGGTATGGGTG-3'（序列表中 SEQ ID NO. 8 所示）
[0036] 5號(hào)引物對(duì)：
[0037] F :5' -CAAGACGCAACATCCCCTATT-3'（序列表中 SEQ ID NO. 9 所示）
[0038] R :5' -TTTTGACTGTGAGGGACGGA-3'（序列表中 SEQ ID NO. 10 所示）
[0039] 6號(hào)引物對(duì)：
[0040] F :5-ACCACAAAGACATCGGCACT-3 (序列表中 SEQ ID NO. 11 所示）
[0041] R :5-GTAGGAATGATGGGGGAAGTAA-3 (序列表中 SEQ ID NO. 12 所示）
[0042] 3.弓丨物特異性驗(yàn)證
[0043] 提取豬、牛、羊、雞、鴨、馬、鹿、狗8個(gè)物種的肉制品中基因組DNA，以此為模板進(jìn)行 PCR反應(yīng)。
[0044] 反應(yīng)體系：20μ 1 (模板：1μ I ;dNTP0· 4μ I ;10XPCR buffer2y 1 ;上下游引物分 別 0· 8 μ I ;rTaq0. 4 μ I ;ddH2014. 6 μ I)。
[0045] 反應(yīng)條件：
[0046] 第一步：94°C 5min ;
[0047] 第二步：94°C 30s，62°C 30s，72°C 30s30 個(gè)循環(huán)
[0048] 第三步：72°C 5min。
[0049] PCR產(chǎn)物-20°C保存，備用。
[0050] 4.瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證
[0051] 首先配制I %瓊脂糖凝膠，在微波爐中加熱致透亮，取出稍微冷卻后加 EB，充分混 勻倒入已插好梳子的板上，靜置30min后即可使用。
[0052] 凝膠后將板取出，放入電泳槽中，每個(gè)點(diǎn)樣孔上樣2μ 1產(chǎn)物+1μ 16Xlodding buffer,上樣后鄰近孔點(diǎn)3 μ IDNA marker。
[0053] 最后，電壓120V，25min進(jìn)行凝膠電泳。PCR擴(kuò)增結(jié)果用凝膠成相系統(tǒng)分析，結(jié)果如 圖1-圖5所示。其中，圖1為1號(hào)引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果；圖2為2號(hào)引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果；圖3為3 號(hào)引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果；圖4為4號(hào)引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果；圖5為5號(hào)引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果；圖6為6號(hào) 引物對(duì)擴(kuò)增結(jié)果；M 為 DL2000DNA Marker (從下往上，IOObp、250bp、500bp、750bp、IOOObp、 2000bp) ;1-8分別為豬、牛、羊、雞、鴨、馬、鹿、狗的基因組DNA。
[0054] 實(shí)施例2
[0055] 對(duì)市售經(jīng)深加工的馬肉制品進(jìn)行驗(yàn)證
[0056] 1.提取馬肉的基因組DNA :方法同實(shí)施例1中提肉制品的基因組DNA。
[0057] 2. PCR 驗(yàn)證：
[0058] 以上述所提的基因組DNA為模板，用本發(fā)明中提供的6對(duì)引物分別進(jìn)行PCR。
[0059] 反應(yīng)體系：20μ 1 (模板：1μ 1 ;(1ΝΤΡ0·4μ I ;10XPCR buffer21y 1 ;上下游引物分 別 0· 8 μ I ;rTaqO. 4 μ I ;ddH2014. 6 μ 1)。
[0060] 反應(yīng)條件：
[0061] 第一步：94°C 5min ;
[0062] 第二步：94°C 30s，62°C 30s，72°C 30s30 個(gè)循環(huán)
[0063] 第三步：72°C 5min。
[0064] 3.瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證
[0065] 配制2%瓊脂糖凝膠，制膠過程同實(shí)施例I中所述。電壓50V，電泳lh，PCR擴(kuò)增結(jié) 果用凝膠成相系統(tǒng)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示。其中，M為DL2000DNA Marker (從下往上， IOObp、250bp、500bp、750bp、IOOObp、2000bp) ; 1、2、3、4、5、6 分別為 1 號(hào)引物對(duì)、2 號(hào)引物對(duì)、 3號(hào)引物對(duì)、4號(hào)引物對(duì)、5號(hào)引物對(duì)、6號(hào)引物對(duì)。
【權(quán)利要求】
1. 用于檢測(cè)食品中馬肉成分的引物組，其特征在于，由1號(hào)引物對(duì)、2號(hào)引物對(duì)、3號(hào)引 物對(duì)、4號(hào)引物對(duì)、5號(hào)引物對(duì)、6號(hào)引物對(duì)組成，所述1號(hào)引物對(duì)的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 1和2所示，所述2號(hào)引物對(duì)的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 3和4所示，所述3號(hào) 引物對(duì)的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 5和6所示，所述4號(hào)引物對(duì)的核苷酸序列分別如 SEQ ID NO. 7和8所示，所述5號(hào)引物對(duì)的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 9和10所示，所述 6號(hào)引物對(duì)的核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 11和12所示。
2. 用于檢測(cè)食品中馬肉成分的試劑盒，其特征在于，含有如權(quán)利要求1所述引物組，還 包括PCR管、DNA聚合酶、PCR緩沖液、dNTPs。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，含有1號(hào)引物對(duì)可擴(kuò)增183bp，其核苷 酸序列為： 上游引物：5' -CCTTCACCACCACATCTCTA-3'（SEQ ID NO. 1) 下游引物：5' -AGATGATTCGGGTACTGTAGAC-3'（SEQ ID N0.2)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，含有2號(hào)引物對(duì)可擴(kuò)增202bp，其核苷 酸序列為： 上游引物：5'-AACCCCACAAAACTAACAACA-3'（SEQ ID NO. 3) 下游引物：5'-GGGCTGGTAGGTCAATAAAA-3'（SEQ ID N0.4)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，含有3號(hào)引物對(duì)可擴(kuò)增231bp，其核苷 酸序列為： 上游引物：5' -ACCAAACCCACGCTTACCAC-3'（SEQ ID N0.5) 下游引物：5' -GGAGTCCCTTTTGAACGATTGA-3'（SEQ ID N0.6)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，含有4號(hào)引物對(duì)可擴(kuò)增266bp，其核苷 酸序列為： 上游引物：5' -AGACCCCAACAAGCAACGAT-3'（SEQ ID N0.7) 下游引物：5' -GCAGTATCCTGAGGTATGGGTG-3'（SEQ ID NO·8)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，含有5號(hào)引物對(duì)可擴(kuò)增268bp，其核苷 酸序列為： 上游引物：5'-CAAGACGCACATCCCCTATT-3'（SEQ ID N0.9) 下游引物：5' -TTTTGACTGTGAGGGACGGA-3'（SEQ ID NO. 10)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，含有6號(hào)引物對(duì)可擴(kuò)增300bp，其核苷 酸序列為： 上游引物：5' -ACCACAAAGACATCGGCACT-3'（SEQ ID NO. 11) 下游引物：5' -GTAGGAATGATGGGGGAAGTAA-3'（SEQ ID NO. 12)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的6個(gè)引物對(duì)，其特征在于，擴(kuò)增目的片段183bp、202bp、 231bp、266bp、268bp、300bp可用于實(shí)時(shí)熒光定量，對(duì)食品中的馬肉成分進(jìn)行定量。
10. -種檢測(cè)食品中馬肉成分的方法，其特征在于，包括步驟如下： 1)提取肉制品中的基因組DNA: 將樣品處理成肉末狀，取30mg加入1. 5mlEP管中；加入500μ 1裂解液（1M tris-Hcl PH8. 0 ;0· 5M EDTA PH8. 0 ;5M Nacl ;0· 5%N-Lanroyl Sarcosine ;蛋白酶K ;RNaseA)7(TC消 化0. 5-lh或5(TC過夜消化；離心（12000r/min，5-15min)，取上清；加等體積的酚、氯仿與 異戊醇（25 : 24 : 1)抽提；取400μ1水相，加40ylNacl，lml冰乙醇，冰上放置30min; 離心（12000r/min，5min)，棄上清；用lml70%無水乙醇洗3次，晾干；加 70-100μlTE，靜置 30min〇 2) 以所提基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增； 3) 對(duì)PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢驗(yàn)，并使用凝膠成相系統(tǒng)分析。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104293899SQ201310304040
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2013年7月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月19日
【發(fā)明者】聶凌云, 魏迪, 程?hào)|慶, 池振奮, 高敬, 張瑩瑩, 趙永良, 聶凌虎 申請(qǐng)人:聶凌云