用于檢測建蘭花葉病毒的引物、試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于檢測建蘭花葉病毒的引物、試劑盒及檢測方法，引物包括：正向外引物F3：5'-CAGTTTTGCGCTTACTACGC-3'；反向外引物B3：5'-GGCGCCGTACTTCCCTAT-3'；正向內(nèi)引物FIP：5'-ACCAGCCTTGGCCCAGTTG-AGTGGTGTGGAATCTGATGC-3'；反向內(nèi)引物BIP：5'-TCGATGCCGTTGATTCCACTGC-CACGTTCACGGTCAGTAGG-3'；試劑盒及檢測方法包含上述引物，利用該引物及檢測方法檢測建蘭花葉病毒快速、簡便、高效、準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)、靈敏性高。
【專利說明】用于檢測建蘭花葉病毒的引物、試劑盒及檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于檢測建蘭花葉病毒的引物、試劑盒及檢測方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]蘭花是享譽(yù)全球的花卉，深受全世界人民的喜愛，我國每年都有數(shù)以億計的蘭花苗進(jìn)出境，然而由于蘭花非常容易攜帶病毒，特別是最容易攜帶的劍蘭花葉病毒Cymbidiummosaic virus (CymMV)和齒蘭環(huán)斑病毒 Odontoglossum ringspot virus (ORSV),且脫毒目前還非常困難，嚴(yán)重制約了我國蘭花產(chǎn)業(yè)可持續(xù)的健康發(fā)展和國外的技術(shù)壁壘的制約，因此，唯有切實(shí)加強(qiáng)進(jìn)出境植物病毒的檢疫，不斷研究和開發(fā)新的檢測方法，不斷提高對進(jìn)出境蘭花種苗攜帶的病毒進(jìn)行高精準(zhǔn)的檢測能力，及早將病毒植株淘汰出去，方能從根本上保證無毒苗的大量生產(chǎn)，才能進(jìn)一步促進(jìn)我國蘭花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
[0003]植物病毒病的診斷和病原鑒定，是認(rèn)識病毒病害、防治病毒病的基礎(chǔ)，也是植物病毒分類學(xué)研究的一個重要內(nèi)容，植物病毒檢測的基本內(nèi)容包括病毒的生物學(xué)特性、形態(tài)學(xué)特征、理化特性、基因組結(jié)構(gòu)、抗原特性等幾個方面，涉及到生物學(xué)測定、血清學(xué)測定、生理生化測定、電鏡技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)等多種手段。目前，我國出入境植物檢疫所采用的檢測技術(shù)的主要手段主要是:口岸現(xiàn)場檢疫、生長季隔離檢疫、指示植物檢驗(yàn)、血清學(xué)檢驗(yàn)、分子生物學(xué)檢驗(yàn)。這些手段存在的主要問題為:1:檢測周期長，不符合國務(wù)院提出的“加快通關(guān)速度”的精神；2:容易出現(xiàn)假陽性反應(yīng)；3:檢測方法繁瑣復(fù)雜，不利于基層單位實(shí)際應(yīng)用；4:主要檢測試劑或產(chǎn)品來源于國外公司，不僅購買價格高，而且定購時間長，這些都不能適應(yīng)我國經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展的需要。因此，建立新的快速有效的檢驗(yàn)檢疫技術(shù)手段已經(jīng)迫在眉睫。
[0004]目前對病毒的主要技術(shù)檢測方法是酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測。ELI SA可以定性、定量測定樣品中的病毒，是實(shí)現(xiàn)目前鑒定病毒的最好手段之一。但是，血清學(xué)反應(yīng)的必須具備高效的抗血清，另外血清學(xué)檢測對一些病毒含量低和含有干擾測定物質(zhì)的樣品則不能做出準(zhǔn)確的測定，容易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，并且存在檢測時間長的問題，不能滿足目前口岸快速檢測的要求；RT-PCR技術(shù)是應(yīng)用最廣泛的分子生物學(xué)新技術(shù)之一，利用RT-PCR技術(shù)對病毒的檢測相比ELISA檢測具有靈敏度高的特點(diǎn)，可檢測的最低病毒含量達(dá)到fg水平。目前在RT-PCR技術(shù)基礎(chǔ)上不斷衍生出許多新的技術(shù)，例如實(shí)時熒光RT-PCR技術(shù)，基因芯片技術(shù)等，使其應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，特異性和敏感性也不斷提高，但是這些分子生物學(xué)技術(shù)存在RNA抽提繁瑣并且容易降解，PCR反應(yīng)容易受寄主中多酚、多糖物質(zhì)的干擾，限制了植物病毒病害樣品的快速、簡便、高效檢測。
[0005]納米生物技術(shù)是運(yùn)用納米技術(shù)的理論與方法，在傳統(tǒng)生物學(xué)和現(xiàn)代分子生物技術(shù)的基礎(chǔ)上，開展生物學(xué)研究。納米磁珠在生物樣品的分離分析中有著重要應(yīng)用價值:(I)高效富集:納米磁珠比表面積大，顯著增加反應(yīng)界面能夠高效富集生物樣品；(2)可操縱性:納米磁珠具有超順磁效應(yīng)，外加磁場能夠快速對其進(jìn)行移動和分離；(3)標(biāo)記性質(zhì):生物分子標(biāo)記方法簡單、可靠；(4)人體安全:對人體無毒、可生物代謝、可生物降解、生物相容性好?？傊判陨锓蛛x兼具磁性載體的超順磁性和親和配基的生物特異性特點(diǎn)，集磁性分離的快速簡便和親和分離的高選擇性雙重優(yōu)勢于一體，在核酸的分離純化，RNA、DNA分子的富集，蛋白的純化，病毒、細(xì)胞的分離等方面有應(yīng)用。
[0006]關(guān)于納米磁珠(magnetic nano particles,MNP)的合成，國外在80年代末開始超順磁性氧化鐵超微顆粒的研究，基于納米磁珠的生物分離材料國外已經(jīng)有市場化產(chǎn)品，最近納米磁珠在動物病毒檢測得到應(yīng)用，抗體標(biāo)記的納米磁珠從液相中捕獲目標(biāo)病毒，可以高靈敏度地檢測動物病毒。
[0007]而環(huán)介導(dǎo)核酸等溫擴(kuò)增即Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)技術(shù)是最近幾年才發(fā)展起來的病毒檢測新方法，為快速基因檢測提供了一種新的技術(shù)途徑，已具有成功應(yīng)用的現(xiàn)實(shí)性，在食品安全檢測、流行性病毒檢測、臨床診斷，以及水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域的應(yīng)用及研究已有文獻(xiàn)報道。它不需要昂貴的檢測設(shè)備，只需要一臺溫箱即可，而且其檢測靈敏度比普通PCR檢測方法還要高，而且檢測時間不超過一小時，結(jié)果直接目測即可，特別適合口岸一線檢測。
[0008]環(huán)媒等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)利用4種特異引物依靠一種高活性鏈置換DNA聚合酶使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環(huán)，LAMP擴(kuò)增分兩個階段。
[0009]第I階段為起始結(jié)構(gòu)形成:任何一個引物向雙鏈DNA的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離，變成 單鏈。上游內(nèi)部引物FIP的F2序列首先與模板F2c結(jié)合，在鏈置換型DNA聚合酶的作用下向前延伸啟動鏈置換合成。外部引物F3與模板F3c結(jié)合并延伸，置換出完整的FIP連接的互補(bǔ)單鏈。FIP上的Flc與此單鏈上的Fl為互補(bǔ)結(jié)構(gòu)。自我堿基配對形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。以此鏈為模板。下游引物BIP與B3先后啟動類似于FIP和F3的合成，形成啞鈴狀結(jié)構(gòu)的單鏈。迅速以3’末端的Fl區(qū)段為起點(diǎn)。以自身為模板，進(jìn)行DNA合成延伸形成莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)。
[0010]第2階段是反應(yīng)擴(kuò)增循環(huán):以莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)為模板，F(xiàn)IP與莖環(huán)的F2c區(qū)結(jié)合。開始鏈置換合成，解離出的單鏈核酸上也會形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。迅速以3’末端的BI區(qū)段為起點(diǎn)，以自身為模板。進(jìn)行DNA合成延伸及鏈置換.形成長短不一的2條新莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA，BIP引物上的B2與其雜交。啟動新一輪擴(kuò)增。且產(chǎn)物DNA長度增加一倍。在反應(yīng)體系中添加2條環(huán)狀引物L(fēng)F和LB，它們也分別與莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)結(jié)合啟動鏈置換合成，周而復(fù)始。擴(kuò)增的最后產(chǎn)物是具有不同個數(shù)莖環(huán)結(jié)構(gòu)、不同長度DNA的混合物。且產(chǎn)物DNA為擴(kuò)增靶序列的交替反向重復(fù)序列。
[0011]環(huán)媒等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)，是分子生物學(xué)領(lǐng)域中的一個新概念，它可以在等溫(60°C-65°C )條件下，30min-60min內(nèi)將只有幾個拷貝的靶核酸擴(kuò)增到IO9水平。該方法的一大特色是，可以通過反應(yīng)副產(chǎn)物——白色焦磷酸鎂沉淀的產(chǎn)生與否判斷靶基因的存在。由于環(huán)媒等溫核酸擴(kuò)增的擴(kuò)增過程依賴識別靶序列六個獨(dú)立區(qū)域，所以對于微生物的鑒定具有高效率、高特異性、高敏感性等特點(diǎn)。此外，環(huán)媒等溫核酸擴(kuò)增的核酸擴(kuò)增過程是在等溫條件下進(jìn)行，普通水浴鍋或有穩(wěn)定熱源的設(shè)備就能滿足反應(yīng)要求，使檢測成本大大降低，而PCR則需要昂貴的PCR儀進(jìn)行一定溫度程序的核酸擴(kuò)增，因而，環(huán)媒等溫核酸擴(kuò)增比PCR對儀器設(shè)備要求低、檢測成本也較低，更具推廣性，可望作為常規(guī)檢測工具。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種用于檢測建蘭花葉病毒的引物以及包含該引物的試劑盒及檢測方法，利用該引物及檢測方法檢測建蘭花葉病毒快速、簡便、高效、準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)、靈敏性高。
[0013]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下方案:
[0014]一種用于檢測建蘭花葉病毒的引物，其特征在于:
[0015]正向外引物F3:5’-CAGTTTTGCGCTTACTACGC-3’ ；
[0016]反向外引物B3:5’-GGCGCCGTACTTCCCTAT-3’ ；
[0017]正向內(nèi)引物FIP和反向內(nèi)引物BIP ;
[0018]其中所述正向內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)lc和F2序列:
[0019]5’-ACCAGCCTTGGCCCAGTTG-AGTGGTGTGGAATCTGATGC-3’ ；
[0020]其中Flc:5，-AACCAGCCTTGGCCCAGTTG-3，；
[0021]F2:5’-AGTGGTGTGGAATCTGATGC-3’ ；
[0022]所述反向內(nèi)引物BIP包括含Blc和B2序列:
[0023]5’-TCGATGCCGTTGATTCCACTGC-CACGTTCACGGTCAGTAGG-3’ ；
[0024]其中Blc:5，-TCGATGCCGTTGATTCCACTGC-3，；
[0025]B2:5’-CACGTTCACGGTCAGTAGG-3’ 。
[0026]一種檢測建蘭花葉病毒的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括有:
[0027]
反應(yīng)液緩沖液0.6mL
引物250 μ L
熒光染料50 μ L
酶溶液50 μ L
陽性對照50 P L
[0028]所述的引物包括:
[0029]正向外引物F3:5’-CAGTTTTGCGCTTACTACGC-3’ ；
[0030]反向外引物B3:5’-GGCGCCGTACTTCCCTAT-3’ ；
[0031]正向內(nèi)引物FIP和反向內(nèi)引物BIP ;
[0032]其中所述正向內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)lc和F2序列:
[0033]5’-ACCAGCCTTGGCCCAGTTG-AGTGGTGTGGAATCTGATGC-3’ ；
[0034]其中Flc:5，-AACCAGCCTTGGCCCAGTTG-3，；
[0035]F2:5’-AGTGGTGTGGAATCTGATGC-3’ ；
[0036]所述反向內(nèi)引物BIP包括含Blc和B2序列:
[0037]5’-TCGATGCCGTTGATTCCACTGC-CACGTTCACGGTCAGTAGG-3’ ；[0038]其中Blc:5’ -TCGATGCCGTTGATTCCACTGC-3’ ；
[0039]B2:5’-CACGTTCACGGTCAGTAGG-3’ 。
[0040]如上所述的一種檢測建蘭花葉病毒的試劑盒，其特征在于所述的反應(yīng)液緩沖液2X由以下組分組成:
[0041]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測建蘭花葉病毒的引物，其特征在于包括: 正向外引物 F3:5’ -CAGTTTTGCGCTTACTACGC-3’ ； 反向外引物 B3:5’ -GGCGCCGTACTTCCCTAT-3’ ； 正向內(nèi)引物FIP和反向內(nèi)引物BIP ； 其中所述正向內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)lc和F2序列:
5’-ACCAGCCTTGGCCCAGTTG-AGTGGTGTGGAATCTGATGC-3’ ；
其中 Flc:5’ -AACCAGCCTTGGCCCAGTTG-3’ ；
F2:5’-AGTGGTGTGGAATCTGATGC-3’ ； 所述反向內(nèi)引物BIP包括含Blc和B2序列:
5’-TCGATGCCGTTGATTCCACTGC-CACGTTCACGGTCAGTAGG-3’ ；
其中 Blc:5’ -TCGATGCCGTTGATTCCACTGC-3’ ；
B2:5’-CACGTTCACGGTCAGTAGG-3’ 。
2.一種檢測建蘭花葉病毒的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括有:反應(yīng)液緩沖液0.6mL引物250 μL熒光染料50 μL酶溶液50 μ L陽性對照50 μ L去離子水1000 μ L 所述的引物包括: 正向外引物 F3:5’ -CAGTTTTGCGCTTACTACGC-3’ ； 反向外引物 Β3:5’ -GGCGCCGTACTTCCCTAT-3’ ； 正向內(nèi)引物FIP和反向內(nèi)引物BIP ； 其中所述正向內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)lc和F2序列:
5’-ACCAGCCTTGGCCCAGTTG-AGTGGTGTGGAATCTGATGC-3’ ；
其中 Flc:5’ -AACCAGCCTTGGCCCAGTTG-3’ ；
F2:5’-AGTGGTGTGGAATCTGATGC-3’ ； 所述反向內(nèi)引物BIP包括含Blc和Β2序列:
5’-TCGATGCCGTTGATTCCACTGC-CACGTTCACGGTCAGTAGG-3’ ；
其中 Blc:5’ -TCGATGCCGTTGATTCCACTGC-3’ ；
Β2:5’-CACGTTCACGGTCAGTAGG-3’ 。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測建蘭花葉病毒的試劑盒，其特征在于所述的反應(yīng)液緩沖液2Χ由以下組分組成:
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種檢測建蘭花葉病毒的試劑盒，其特征在于所述的酶溶液為Bst DNA聚合酶和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶混合液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種檢測建蘭花葉病毒的試劑盒，其特征在于所述的熒光染料含有鈣黃綠素。
6.一種建蘭花葉病毒的檢測方法，其特征在于包括以下步驟: A、采用納米磁珠提取待測樣品的RNA； B、在冰上，按比例取反應(yīng)液緩沖液、引物、熒光染料、酶溶液、陽性對照、去離子水放入滅菌管中配制預(yù)混液； C、將適量待測樣品的RNA加入步驟B中的滅菌管中； D、將步驟C中的試管放置在恒溫器中，在63°C下保持恒溫I小時，然后在80°C下保持恒溫5分鐘使酶滅活以終止反應(yīng)； E、使用紫外線照射裝置從試管底部向上進(jìn)行照射，佩戴紫外防護(hù)眼鏡從試管側(cè)面進(jìn)行觀查，如果與陽性對照一樣發(fā)出綠光，則判定為陽性，如果與陰性對照一樣沒有發(fā)出熒光，而判定為陰性； 其中所述的引物包括: 正向外引物 F3:5’-CAGTTTTGCGCTTACTACGC-3’ ； 反向外引物 B3:5’ -GGCGCCGTACTTCCCTAT-3’ ； 正向內(nèi)引物FIP和反向內(nèi)引物BIP ； 其中所述正向內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)lc和F2序列:
5’-ACCAGCCTTGGCCCAGTTG-AGTGGTGTGGAATCTGATGC-3’ ；
其中 Flc:5’ -AACCAGCCTTGGCCCAGTTG-3’ ；
F2:5’-AGTGGTGTGGAATCTGATGC-3’ ； 所述反向內(nèi)引物BIP包括含Blc和B2序列:
5’-TCGATGCCGTTGATTCCACTGC-CACGTTCACGGTCAGTAGG-3’ ；
其中 Blc:5’ -TCGATGCCGTTGATTCCACTGC-3’ ；
B2:5’-CACGTTCACGGTCAGTAGG-3’ 。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種建蘭花葉病毒的檢測方法，其特征在于步驟A中采用納米磁珠提取待測樣品RNA的具體步驟: a、制樣:取0.1g的帶毒組織加入ImL抽提緩沖液進(jìn)行研磨； b、清洗納米磁珠:取出免疫納米磁珠到PCR管中，用ddH20反復(fù)清洗納米磁珠3次，在磁鐵的作用下吸去ddH20 ； C、結(jié)合:加入100 μ L的樣品到PCR管中，用移液槍吸吐混勻樣品和納米磁珠，室溫下吸附； d、清洗:在磁鐵的作用下移去上清，納米磁珠清洗3次； e、裂解:加入50μ L ddH20到PCR管中，用移液槍吸吐混勻納米磁珠后，95°C，IOmin ； f取樣:用磁鐵吸附納米磁珠，待PCR管內(nèi)溶液澄清后，上清即為待測樣品RNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求 7所述的一種建蘭花葉病毒的檢測方法，其特征在于所述的免疫納米磁珠通過以下工藝制作: ①納米磁珠的制備
分別取 5.2g FeCl3.6Η20、2.7g FeSO4.7Η20、0.85mL12.1moL/L 的濃鹽酸溶解于 200mL水中，超聲脫氧，后將以上溶液滴入250mL、0.75moL/L NaOH溶液；在80°C下攪拌，反應(yīng)結(jié)束后，利用磁分離器將所得沉淀從反應(yīng)介質(zhì)中分離出來，再用去離子水清洗3次，無水乙醇清洗2次,并配成5g/mL的Fe3O4磁性納米粒子無水乙醇溶液；取25mLFe304磁性納米粒子無水乙醇溶液，再用無水乙醇稀釋到150mL，超聲振蕩30min ;滴加0.4mL APTES，室溫下攪拌7h ；反應(yīng)完畢，用磁分離器將APTES修飾的Fe3O4磁性納米粒子從反應(yīng)介質(zhì)中分離，并用無水乙醇溶液清洗3次,最后配成10.5mg/mL的氨基化Fe3O4納米磁珠無水乙醇溶液； ②免疫磁珠的制備 取0.5mL氨基化Fe3O4納米磁珠無水乙醇溶液，用ImL PBS清洗3次，磁分離器棄上清液；加入5%(V/V)戊二醛溶液2mL，室溫振蕩交聯(lián)2h，磁分離，棄上清液；用PBS洗滌3次并棄上清液后，分別采用0.5mL病毒抗體包被氨基化Fe3O4納米粒子，室溫下振蕩固定2h ;磁分離，用PBS和超純水分別洗滌3次，再用PBS定容，4°C冰箱保存?zhèn)溆茫玫矫庖叽胖椤?br> 9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種建蘭花葉病毒的檢測方法，其特征在于所述紫外線照射裝置的波長為 240-260nm，350-370nm。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種建蘭花葉病毒的檢測方法，其特征在于所述的反應(yīng)液緩沖液2X由以下組分組成:

【文檔編號】C12Q1/68GK103451316SQ201310344666
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月8日
【發(fā)明者】陳定虎, 陳祖華, 王宏, 曹小茂, 楊雷亮, 彭志民, 劉恭源, 王勇, 朱春紅 申請人:陳定虎