不同抗性水稻品種上褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種不同抗性水稻品種上褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的檢測(cè)方法。選取不同抗性水稻上的褐飛虱，以體內(nèi)的類酵母共生菌為研究對(duì)象，結(jié)合變性梯度凝膠電泳(DGGE)與熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)。三種抗性水稻品種分別為：ASD7(bph2)、RH(Bph3)、Mudgo(Bph1)。檢測(cè)的類酵母共生菌為Noda菌(Hypomyceschrysospermus)、季也蒙畢赤酵母(Pichiaguilliermondii)、假絲酵母(Candidaquercitrusa)。本發(fā)明利用DGGE和qPCR技術(shù)檢測(cè)了褐飛虱體內(nèi)三種類酵母共生菌在不同抗性水稻品種上的變化規(guī)律，為明確褐飛虱在適應(yīng)抗性品種過(guò)程中其體內(nèi)共生菌的變化規(guī)律提供了新的技術(shù)手段，對(duì)探明飛虱防治的新途徑起到了至關(guān)重要的作用。
【專利說(shuō)明】不同抗性水稻品種上褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明通過(guò)結(jié)合變性梯度凝膠電泳與熒光定量PCR技術(shù)對(duì)不同抗性水稻品種上褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的變化規(guī)律進(jìn)行研究，屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]褐飛虱是我國(guó)及東南亞水稻上最主要的害蟲(chóng)之一，該蟲(chóng)為單食性害蟲(chóng)，不僅通過(guò)產(chǎn)卵或者刺吸水稻韌皮部汁液造成直接傷害，而且通過(guò)傳播病毒病造成間接傷害，培育和推廣抗性品種是遏制褐飛虱肆意繁殖和危害的優(yōu)先策略；但是長(zhǎng)期種植抗性水稻品種導(dǎo)致飛虱產(chǎn)生新的致害性，而把已經(jīng)產(chǎn)生新致害性的飛虱轉(zhuǎn)移到其他品種的水稻上強(qiáng)迫飼養(yǎng)數(shù)代后，飛虱的致害性即發(fā)生變化。
[0003]有研究推測(cè)褐飛虱致害性的轉(zhuǎn)變可能與飛虱體內(nèi)的共生菌有關(guān)，褐飛虱體內(nèi)存在著類酵母共生菌(Yeast-like Symbiotes, YLS),是飛風(fēng)體內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌群。YLS主要聚集在腹部脂肪體和卵中，并隨卵傳遞給下一代。YLS還參與氮素循環(huán)，為寄主提供氨基酸、固醇類物質(zhì)以及蛋白質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分，并對(duì)稻飛虱生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、致害性變化等方面起到重要作用。
[0004]研究發(fā)現(xiàn)，取食抗性水稻品種后飛虱體內(nèi)共生菌的數(shù)量急劇下降，特別是在適應(yīng)抗性品種過(guò)程中的第二代，是此過(guò)程的關(guān)鍵世代，體內(nèi)共生菌的數(shù)量達(dá)到最低，到第三代時(shí)，共生菌的數(shù)量開(kāi)始回升。在正常情況下，取食感蟲(chóng)品種TN1的生物型1雌成蟲(chóng)的體重、生長(zhǎng)速度和產(chǎn)卵量均顯著高于取食抗性水稻品種的雌成蟲(chóng)。因此明確褐飛虱在適應(yīng)抗性品種過(guò)程中其體內(nèi)共生菌的變化規(guī)律對(duì)飛虱致害性的變異至關(guān)重要。
[0005]然而，褐飛虱體內(nèi)的類酵母共生菌由于生存環(huán)境較為特殊，難以進(jìn)行體外培養(yǎng)。傳統(tǒng)研究褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的變化規(guī)律的手段主要是基于顯微觀察法，但這種方法效率低且準(zhǔn)確性差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種不同抗性水稻上褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的檢測(cè)方法。
[0007]褐飛虱是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)。研究發(fā)現(xiàn)褐飛虱對(duì)不同品種抗性水稻的適應(yīng)性與其體內(nèi)的類酵母共生菌有密切的聯(lián)系，明確褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的變化規(guī)律對(duì)飛虱的防治起了至關(guān)重要的作用。尚未見(jiàn)有關(guān)利用分子生物學(xué)技術(shù)分析不同抗性水稻品種上褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌變化的研究報(bào)道。
[0008]一種不同抗性水稻品種上褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的檢測(cè)方法，選取不同抗性水稻品種上的最初8個(gè)世代的褐飛虱，針對(duì)多種類酵母共生菌，結(jié)合變性梯度凝膠電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE)與突光定量 PCR(Real_timeQuantification PCR, qPCR)技術(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)。
[0009]所述的水稻品種中，抗性水稻品種為ASD7(如AJ?) MBph3)、Mudgo (辦力7)，感蟲(chóng)水稻品種為TN1。
[0010]所述的類酵母共生菌為Abt/a菌{Hypomyces chrysospermus)、季也蒙畢赤酵母{Pichia guilliermondii) >{Candida querci trusa) 0 [0011]所述的方法，過(guò)程如下:
1)分別取三種抗性水稻品種及一種感蟲(chóng)水稻品種上的最初8個(gè)世代剛羽化的褐飛虱，對(duì)所述的褐飛虱的脂肪體中的類酵母共生菌進(jìn)行分離純化，提取基因組；
2)根據(jù)多種菌株的ISSrDNA的特征序列設(shè)計(jì)引物，以上述提取的基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
3)利用變性梯度凝膠電泳與熒光定量PCR技術(shù)對(duì)多種菌株的變化規(guī)律定量分析。
[0012]利用結(jié)合DGGE和qPCR技術(shù)明確了三種類酵母共生菌在褐飛虱適應(yīng)抗性品種上最初8代的變化規(guī)律:在適應(yīng)的過(guò)程中三種共生菌的數(shù)量急劇下降，在第二代時(shí)三種共生菌的數(shù)量均達(dá)到最低，到第三代時(shí)，共生菌的數(shù)量開(kāi)始回升，之后共生菌的數(shù)量趨于平緩。三種共生菌的數(shù)量在同一世代不同抗性水稻上的變化不盡相同，Pi chi a gui lli ermondi i和Candida querci trusa在同一世代不同抗性水稻之間的差異不顯著，但是Hypomyceschrysospermus在三種抗性水稻上的差異顯著，特別是在抗性水稻品種Mudgo上,與其他兩種抗性水稻品種相比差異顯著。另外對(duì)三種菌在三種抗性水稻品種的原始拷貝數(shù)分析，發(fā)MiHypomyces chrysospermus 在三種共生菌中數(shù)量最多，其次是gui lli ermondi i,最后是 Candida querci trusa。
[0013]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明利用DGGE和qPCR技術(shù)分別檢測(cè)了三種類酵母共生菌在褐飛虱適應(yīng)三種抗性水稻品種上最初八個(gè)世代的變化規(guī)律，為今后研究類酵母共生菌與褐飛虱對(duì)不同抗性水稻品種適應(yīng)以及探索新的防治途徑提供了有效的技術(shù)手段。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1是辦菌在三種抗性水稻品種上的褐飛風(fēng)體內(nèi)變化規(guī)律的 DGGE 圖；A: Mudgo, B: ASD7、C:RH。
[0015]圖2 ^kPichia gui lli ermondi i菌在三種抗性水稻品種上的褐飛風(fēng)體內(nèi)變化規(guī)律DGGE 圖；A: Mudgo、B: RH、C:ASD7。
[0016]圖3是菌在三種抗性水稻品種上的褐飛風(fēng)體內(nèi)變化規(guī)律DGGE 圖；A: RH、B: Mudgo、C:ASD7。
[0017]圖4A是Hypomyces chrysospermus菌在抗性水稻品種ASD7上特異序列擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0018]圖4B是Hypomyces chrysospermus菌在抗性水稻品種RH上特異序列擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0019]圖4C ^kHypomyces chrysospermus菌在抗性水稻品種Mudgo上特異序列擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0020]圖5A iPichia gui lli ermondi i菌在抗性水稻品種ASD7上特異序列擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0021 ] 圖5B ^kPichia gui lli ermondi i菌在抗性水稻品種RH上特異序列擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0022]圖5C iPichia gui lli ermondi i菌在抗性水稻品種Mudgo上特異序列擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0023]圖6A是Candida querci trusa菌在抗性水稻品種ASD7上特異序列擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0024]圖現(xiàn)是Candi da querci trusa菌在抗性水稻品種RH上特異序列擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0025]圖6C是Candida querci trusa菌在抗性水稻品種Mudgo上特異序列擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0026]圖7A是Hypomyces chrysospermus菌在抗性水稻品種ASD7上特異序列擴(kuò)增的熔解曲線。
[0027]圖7B良Hypomyces chrysospermus菌在抗性水稻品種RH上特異序列擴(kuò)增的熔解曲線。
[0028]圖^kHypomyces菌在抗性水稻品種Mudgo上特異序列擴(kuò)增的熔解曲線。
[0029]圖8A ^kPichia gui lli ermondi i菌在抗性水稻品種ASD7上特異序列擴(kuò)增的熔解曲線。
[0030]圖8B ^kPichia guilliermondii菌在抗性水稻品種RH上特異序列擴(kuò)增的熔解曲線。
[0031]圖8C ^kPichia gui `lli ermondi i菌在抗性水稻品種Mudgo上特異序列擴(kuò)增的熔解曲線。
[0032]圖9A是Candida querci trusa菌在抗性水稻品種ASD7上特異序列擴(kuò)增的熔解曲線。
[0033]圖視是Candi da querci trusa菌在抗性水稻品種RH上特異序列擴(kuò)增的熔解曲線。
[0034]圖9C是Candida querci trusa菌在抗性水稻品種Mudgo上特異序列擴(kuò)增的熔解曲線。
[0035]具體實(shí)施方法
以下結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0036]實(shí)施例1:用DGGE技術(shù)分別對(duì)三種抗性水稻品種(ASD7、RH、Mudgo)上褐飛虱三種舊 Qiypomyces chrysospermus 鬼、Pichia guilliermondii |if> Candida querci trusa 舊、的半定量分析。
[0037]取在感蟲(chóng)品種TN1，抗性品種ASD7 (8個(gè)世代)、RH (8個(gè)世代)、Mudgo (8個(gè)世代)上剛羽化的雌成蟲(chóng)各100頭，75%酒精表面消毒3次，每次3min，無(wú)菌水漂洗3次，每次3min。對(duì)其脂肪體中的類酵母共生菌進(jìn)行分離純化，并提取基因組。以上述提取的基因組為模板，擴(kuò)增所用引物為依據(jù)利用DGGE實(shí)驗(yàn)中獲得的3種菌18SrDNA序列設(shè)計(jì)的引物310F/310R(Hypomyces chrysospermus), 305F/305R {Pichia guilliermondii ), 248F/248R {Candidaquerci trusa),為了崔i高DGGE的檢測(cè)效率，在三對(duì)上游引物的5’端添加約40個(gè)堿基的GC夾子(表1)。
[0038]表1三種菌的引物序列
【權(quán)利要求】
1.一種不同抗性水稻品種上褐飛虱體內(nèi)類酵母共生菌的檢測(cè)方法，其特征在于，選取不同抗性水稻品種上的最初8個(gè)世代的褐飛虱，針對(duì)多種類酵母共生菌，結(jié)合變性梯度凝膠電泳與熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行定量檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的水稻品種中，抗性水稻品種為ASD7 {bph2)、RH {Bph3)、Mudgo {Bphl)，感蟲(chóng)水稻品種為 TN1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的類酵母共生菌為艙山菌Qiypomyces chrysospermus)、季也蒙畢赤酵母 ipichia gui Hi ermondi i)、假絲酵母{Candida quercitrusa) 0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，過(guò)程如下: 1)分別取三種抗性水稻品種及一種感蟲(chóng)水稻品種上的最初8個(gè)世代剛羽化的褐飛虱，對(duì)所述的褐飛虱的脂肪體中的類酵母共生菌進(jìn)行分離純化，提取基因組； 2)根據(jù)多種菌株的ISSrDNA的特征序列設(shè)計(jì)引物，以上述提取的基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 3)利用變性梯度凝`膠電泳與熒光定量PCR技術(shù)對(duì)多種菌株的變化規(guī)律定量分析。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103555821SQ201310358301
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年8月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月17日
【發(fā)明者】俞曉平, 馬正, 曹偉, 侯云, 邊亞琳, 郝培應(yīng), 許益鵬, 申屠旭萍 申請(qǐng)人:中國(guó)計(jì)量學(xué)院