專利名稱：：水稻抗褐飛虱基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種水稻抗褐飛虱基因萬/7W么同時(shí)還涉及該基因在水稻及水稻種子抗褐飛虱中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：水稻是一種重要的糧食作物，世界上有超過一半的人以其為主食。同時(shí),由于水稻基因組精細(xì)遺傳圖和物理圖譜已完成，其轉(zhuǎn)基因技術(shù)相對(duì)容易，并且與其它禾本科作物基因組具有共線性，因而被視做模式植物。隨著包括水稻在內(nèi)的多種生物基因組測(cè)序的完成，人類開始進(jìn)入后基因組時(shí)代。全面開展功能基因組研究已成為生命科學(xué)的前沿領(lǐng)域。因此水稻功能基因的研究對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生物學(xué)研究具有重大意義。糧食安全問題，是全世界人民面臨的挑戰(zhàn)。50、60年代的矮化育種和70年代的雜交水稻培育兩次科技革命使水稻產(chǎn)量大幅度提高。但近幾十年來水稻受到大面積的病蟲為害，使水稻生產(chǎn)受到威脅。褐飛虱是我國水稻生產(chǎn)中的主要害蟲，其成蟲和若蟲以口針刺吸水稻汁液，引起黃葉或枯死，導(dǎo)致減產(chǎn)或絕收。據(jù)中國農(nóng)業(yè)年鑒記載，1966、1969、1973、1977、1983和2003年全國性大發(fā)生，1987、1991、2005、2006和2007年全國性特大發(fā)生，褐飛虱危害面積達(dá)到水稻總面積的50%以上，給我國水稻生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的損失。由于褐飛虱的危害多發(fā)生在水稻成熟灌漿期，此時(shí)大量使用殺蟲劑，對(duì)稻谷的污染也是非常嚴(yán)重的問題。利用抗褐飛虱基因培育抗蟲水稻品種是褐飛虱綜合防治中最為經(jīng)濟(jì)有效的方法。國際水稻研究所(IRRI)的研究結(jié)果和東南亞的水稻生產(chǎn)實(shí)踐證明，即使是只有中等抗性水平的水稻品種，也足以將褐飛虱的群體控制在造成危害的水平以下，不至于對(duì)水稻造成實(shí)際的危害和產(chǎn)量損失。因此，挖掘水稻抗褐飛虱基因并在水稻育種項(xiàng)目中應(yīng)用是防治水稻褐飛虱的根本措施。3水稻抗褐飛虱基因的研究始于上世紀(jì)70年代初。至今已命名了19個(gè)主效抗蟲基因(具體綜述見YangHY等，2004High-resolutiongeneticmappingattheBphl5locusforbrownplanthopperresistanceinrice.TheorApplGenet.110:182-191)。其中，Mudgo、C022和MTU15三份材料的抗性受到一個(gè)顯性基因的控制，該基因被命名為^pW，而另一個(gè)與萬p/z/緊密連鎖的隱性基因控制著ASD7的抗性。Lakshminarayana和Khush在對(duì)28個(gè)品種的遺傳學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)RathuHeenati攜帶一個(gè)顯性抗褐飛虱基因^^3，這一基因獨(dú)立于5/W遺傳，此外Babawee中有一個(gè)隱性基因6//^,這個(gè)基因也獨(dú)立于6;/^遺傳。Sidhu和Khush發(fā)現(xiàn)5//3與6p/^是緊密連鎖的，^W還與半矮化基因W-7連鎖。Khush等對(duì)ARC10550的遺傳分析證明它含有隱性基因6/^5。Kabir和Khush在對(duì)17份抗生物型4但對(duì)其它三種生物型敏感的材料的研究中發(fā)現(xiàn)，Swamalata、T12分別含一個(gè)抗蟲基因，命名為5pM和6p/7。6;M、5;妙的發(fā)現(xiàn)與其它幾個(gè)基因類似，隱性基因6;/2S與^;2、*/^不等位，顯性基因5;妙與^/3、5/W不等位。上述抗褐飛虱基因中，6/7/25、Sp/z6、6/^7褐飛虱抗生物型4，而對(duì)生物型1、2、3均表現(xiàn)為敏感。野生稻資源中有大量的抗褐飛虱材料。1994年Ishii等從澳洲野生稻(a"z^ra"m^)的一個(gè)轉(zhuǎn)育系IR65482-4-136-2-2中鑒定出一個(gè)新的顯性抗褐飛虱基因這個(gè)基因抗褐飛虱生物型1、2、3。從O.e/c/H'"gw中鑒定出紛7力U。帶有褐飛虱基因的水稻能抑制褐飛虱的取食、生長發(fā)育和繁殖，從而達(dá)到抗蟲的目的(HaoPY等，2008Herbivore-inducedcallosedepositiononthesieveplatesofrice:animportantmechanismforhostresistance.PlantPhysiology146:1810-1820)。但是，至今尚未克隆到水稻的抗褐飛虱基因。圖位克隆(map-basedcloning)又稱為定位克隆(positionalcloning),是隨著分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜的發(fā)展而發(fā)展起來的一種基因克隆技術(shù)。圖位克隆法步驟包括對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行遺傳定位、物理定位、序列分析及遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證功能。從理論上講，任何一個(gè)能定位的基因都可用圖位克隆法分離。圖位克隆法一般適合于基因組比較小的物種，如單子葉模式植物水稻，具有基因組小、基因組物理距離與遺傳距離之比小而且標(biāo)記豐富的特點(diǎn)。水稻作為禾本科模式植物，其基因組是麥、高梁等七種禾本科植物基因組組成的同心圓的圓心，是最適合應(yīng)用圖位克隆法分離目的基因的作物之一。水稻中已經(jīng)克隆的多個(gè)基因都是通過圖位克隆法克隆的，如抗白葉枯病基因義a-2/(SongWY等1995，AReceptorKinase-LikeProteinEncodedbytheRiceDiseaseResistanceGene，^x2入5We"ce,270:1804-1806)、^7-/(Yoshimura等1998,ExpressionofXa-l，abacterialblight-resistancegeneinrice,isinducedbybacterialinoculation.iWJ51，95:1663-1668)和(Sun等2004，X<x26ageneconferringresistanceto^3涵o膨wospv.oryzaeinrice,encodesanLRRreceptorkinase-likeprotein._P/a"f/owrwa/，37:517-527)，抗稻瘟病基因尸"(Wang等1999,ThePi-bgeneforriceblastresistancebelongstothenucleotidebindingandleucine-richrepeatclassofplantdiseaseresistancegenes.尸/awfJow7a/，1999，19:55-64)和(Bryan等2000，Asingleaminoaciddifferencedistinguishesresistantandsusceptibleallelesofthericeblastresistancegene尸/awfCe〃,12:20332046)，以及我國科學(xué)家克隆的分蘗基因(Li等2003,Controloftilleringinrice.A^we422:618-621)、耐鹽基因(Ren等2005，Aricequantitativetraitlocusforsalttoleranceencodesasodiumtransporter.7Vaft^eGewerics37(10):1141-1146)和高產(chǎn)基因(WeiyaXue等2008,NaturalvariationinG7zd7isanimportantregulatorofheadingdateandyieldpotentialinrice.7Vart^eG^w幼'cs40，761誦767)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種水稻抗褐飛虱的基因^pW4，其具有SEQ.ID.No.l所示的核苷酸序列。本發(fā)明另一目的是提供一種抗褐飛虱基因BpW4在水稻選育中的應(yīng)用。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一種抗褐飛虱基因5pW4在提高水稻抗褐飛虱抗性中的應(yīng)用。本發(fā)明釆用遺傳學(xué)的方法，構(gòu)建水稻抗褐飛虱的分離群體，利用圖位克隆的方法，分離到水稻抗褐飛虱基因萬pW(通過共分離標(biāo)記檢測(cè)表明該基因與抗褐飛虱性能是共分離的，通過遺傳轉(zhuǎn)化BpW4基因，使感性水稻出現(xiàn)抗褐飛虱的表型，證實(shí)了該基因的功能。本發(fā)明^W4基因的核苷酸序列如SEQIDNO.l所示，該基因全長9921bp,具有l(wèi)個(gè)內(nèi)含子和2個(gè)外顯子，其CDS分別為區(qū)段分別為3387-7289和7936-8004，cDNA全長3972bp，編碼1323個(gè)氨基酸，其蛋白序列如序列表SEQIDN0.3所示。該蛋白屬于NBS-LRR家族，活性中心180-464區(qū)段為保守的NB-ARC區(qū)，包括保守的P-loop,ATP結(jié)合區(qū)，激酶la等。應(yīng)當(dāng)理解，在不影響B(tài)phl4蛋白活性的前提下(即不在蛋白的活性中心)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)SEQIDNO.3所示的氨基酸序列進(jìn)行各種取代、添加和/或缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸獲得具有同等功能的氨基酸序列。此外，考慮到密碼子的簡并性，例如可在其編碼區(qū)，在不改變氨基酸序列的條件下，或在其非編碼區(qū)在不影響蛋白表達(dá)的條件下，對(duì)編碼上述蛋白的基因序列進(jìn)行修改。因此，本發(fā)明還包含對(duì)編碼上述蛋白的基因序列進(jìn)行的替換、添加和/或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸，具有與上述編碼基因具有相同功能的核苷酸序列。本發(fā)明還包括基于所述基因的正義序列或反義序列，包括含有所述核苷酸序列或其片段的克隆載體或表達(dá)載體、含有所述載體的宿主細(xì)胞、含有所述核苷酸序列或其片段的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)能理解，根據(jù)本發(fā)明公開的序列來設(shè)計(jì)或產(chǎn)生分子標(biāo)記可用于抗褐飛虱水稻的選育工作。本發(fā)明通過如下步驟克隆得到5pW4基因1.創(chuàng)建定位群體利用抗褐飛虱水稻RB5與普通水稻品種TN1雜交，F(xiàn),代自交獲得F2群體，作為抗褐飛虱基因定位群體。2.抗褐飛虱鑒定應(yīng)用苗期集團(tuán)法鑒定定位群體的抗褐飛虱性能。從F2代植株上收獲F3種子，每份F2代植株收獲的F3種子于秧盤中播種20棵苗(稱為l個(gè)家系)。2葉l心期，放入2-4齡的褐飛虱若蟲(10頭/株)，記錄各家系的受害情況,每份材料重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。根據(jù)抗蟲鑒定結(jié)果，對(duì)定位群體家系的進(jìn)行了抗蟲級(jí)別的劃分。3.抗褐飛虱基因定位用PCR(polymerasechainreaction)和聚丙烯酰胺凝膠電泳，以及RFLP標(biāo)記和Southern雜交的方法，檢測(cè)F2各個(gè)單株的SSR和RFLP分子標(biāo)記的分離情況，結(jié)合相應(yīng)各家系的抗蟲級(jí)別，應(yīng)用JoinMap3.0和MapQTL5.0軟件，構(gòu)建水稻第3染色體的分子標(biāo)記遺傳連鎖圖，將^pW4定位在分子標(biāo)記R1925和G1318之間。4.加密目標(biāo)區(qū)段分子標(biāo)記與精細(xì)定位根據(jù)國際水稻基因組計(jì)劃公布的水稻基因組序列，設(shè)計(jì)第3染色體5;W4所在目標(biāo)區(qū)段的SSR標(biāo)記和STS標(biāo)記的引物，用PCR和聚丙烯酰胺凝膠電泳方法檢測(cè)標(biāo)記在F2大群體中的分離，通過篩選得到的重組單株的表型與基因型的關(guān)系，將抗褐飛虱基因BpW4定位在分子標(biāo)記SM1和G1318之間。5.候選基因確定應(yīng)用高密度膜Southern雜交方法篩選抗褐飛虱水稻B5的基因組文庫，獲得陽性克隆，以雙脫氧終止法(Sanger法)進(jìn)行大片段測(cè)序，得到5;^W所在區(qū)段的基因組序列，應(yīng)用RiceGAAS軟件預(yù)測(cè)基因，并通過與日本晴和9311序列作對(duì)比分析，確定^pW4的候選基因。6.根據(jù)序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)一步做共分離檢測(cè)根據(jù)5pW4候選基因序列設(shè)計(jì)引物，用PCR和聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法對(duì)F4的大群體進(jìn)行檢測(cè)，這些引物對(duì)應(yīng)的標(biāo)記與抗褐飛虱的表現(xiàn)型共分離，篩選得到了抗褐飛虱的水稻株系。7.全長cDNA克隆根據(jù)預(yù)測(cè)的cDNA序列，以3'末端的序列設(shè)計(jì)引物，從抗褐飛虱水稻B5的cDNA中擴(kuò)得探針，篩選cDNA全長文庫，最終獲得^p/z"的全長cDNA。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)本發(fā)明公開的^pW4的核苷酸序列，通過設(shè)計(jì)恰當(dāng)?shù)腜CR引物，即可從抗褐飛虱水稻基因組中擴(kuò)增得到5/W4基因。例如，弓l物5'ctccctgactgaagaagagaagag3,，5'tgctagctgtgattctcttatgatg3，，釆用長片段PCR擴(kuò)增試劑盒，擴(kuò)增抗褐飛虱水稻或野生稻的基因組DNA即可得到該序列。8.遺傳轉(zhuǎn)化5pW4基因來驗(yàn)證其功能根據(jù)5;W4基因所在BAC克隆的序列，用和K/7"I雙酶切9921bp的片段連入pCAMBIA1301,釆用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將基因組載體導(dǎo)入正常秈稻品種Kasalath中，最后獲得B;W4陽性植株14株。用丁2代純合的5pW4陽性植株進(jìn)行了抗蟲鑒定。苗期釆用集團(tuán)法鑒定，對(duì)照水稻Kasalath全部死亡，轉(zhuǎn)基因陽性植株存活，抗蟲級(jí)別為3-5級(jí)；成熟期的水稻植株按每個(gè)分蘗80頭褐飛虱接入3-4齡褐飛虱，14天后Kasalath死亡，轉(zhuǎn)基因陽性植株存活。取食電位儀(EPG)和蜜露法檢測(cè)褐飛虱的取食行為，褐飛虱在轉(zhuǎn)基因陽性植株上的取食明顯減少。這些結(jié)果說明萬/W4基因具有抗褐飛虱的功能。因此，抗褐飛虱基因5pW4可以在水稻中應(yīng)用也可以在水稻種子中應(yīng)用，培育具有抗褐飛虱性能的水稻品種。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果1.本基因的成功克隆進(jìn)一步證實(shí)了圖位克隆法法克隆水稻重要基因的可靠性，該方法克隆的基因其功能明確、效果好。2.水稻中多個(gè)編碼具有NBS結(jié)構(gòu)蛋白的基因雖已被克隆，但大多與抗病性有關(guān)，本發(fā)明克隆的5/W4基因具有明顯的抗褐飛虱性能，這對(duì)全面理解該類基因的生物學(xué)功能有重要意義。3.國際上尚未克隆到水稻的抗褐飛虱基因，對(duì)水稻抗褐飛虱的分子機(jī)理仍不清楚。而本發(fā)明克隆的5pW4基因能夠提高水稻對(duì)褐飛虱的抗性，這對(duì)水稻抗褐飛虱的分子機(jī)理研究將有極大的推動(dòng)作用。4.萬/7/2^使水稻抗褐飛虱性能大大提高，通過遺傳轉(zhuǎn)化或雜交將5pW4應(yīng)用于水稻育種中，可以改善水稻品種的抗褐飛虱性，從而減輕褐飛虱的為害，達(dá)到增產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)的目的。5.刺吸式昆蟲是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的一大類蟲害，5;^"基因克隆和抗褐飛虱功能證實(shí)，對(duì)于其他植物的抗刺吸式昆蟲研究具有重要參考作用。圖1.A:RI35為藥用野生稻與栽培稻雜交后代中選育的抗蟲水稻資源，攜帶有一個(gè)抗褐飛虱基因B^W4;TN1為褐飛虱感蟲品種；RI35和TN1雜交構(gòu)建F2定位群體。B:苗期集團(tuán)法鑒定F2群體中的抗蟲植株和感蟲植株，褐飛虱危害后存活的為抗性植株，死亡的為感蟲植株，左圖為苗期鑒定放蟲前，右圖為放蟲后。圖2.SSR標(biāo)記76B10-2檢測(cè)單株的電泳圖。前兩個(gè)泳道為抗蟲親本RI35和感蟲親本TN1，后面為F2群體單株的基因型。圖3.5pW4的定位。A:5p/zW初步定位結(jié)果。染色體上邊為標(biāo)記名稱，數(shù)值是標(biāo)記間的遺傳距離(cM),QTL掃描結(jié)果在分子標(biāo)記R1925和G1318之間有一個(gè)最大的LOD值49.3。B:精細(xì)定位結(jié)果。分子標(biāo)記之間數(shù)值表示標(biāo)記與^pW4重組單株數(shù)，5;/"與分子標(biāo)記SM1和G1318之間。C:SM1和G1318之間的物理圖譜，位于SM1-G1318間34kb的區(qū)域。圖4.轉(zhuǎn)基因所用載體。圖5.轉(zhuǎn)基因陽性植株鑒定。M為100bp分子量標(biāo)準(zhǔn)，pBphl4K為構(gòu)建的質(zhì)粒，Kasalath為轉(zhuǎn)基因受體植株，用潮霉素和GUS探針鑒定T0代轉(zhuǎn)基因植株(1~14)。圖6.A、C、E:轉(zhuǎn)5/W4基因抗褐飛虱水稻K4-20的鑒定結(jié)果。A:成熟期的抗蟲鑒定，對(duì)照的Kasalath明顯死亡，而K4-20仍然存活；C為EPG記錄的褐飛虱在不同品種取食行為，明顯可以看出褐飛虱在轉(zhuǎn)基因抗褐飛虱水稻K4-20上的取食時(shí)間減少了30%;E為褐飛虱取食不同品種排泄物的量，顏色深淺和面積反應(yīng)了排泄物的多少，顏色越深，面積越大，取食越多，排泄量越大。轉(zhuǎn)基因抗褐飛虱水稻K4-20上顏色面積很小。B、D:不同轉(zhuǎn)基因株系T2代純合植株苗期鑒定。B:放蟲前和放蟲后14天的比較；D:轉(zhuǎn)基因株系的抗蟲級(jí)別(上)和5;/l^基因表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)，Bp/l^基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系均對(duì)褐飛虱有明顯抗性。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例UM^基因的定位克隆1.5/W初步定位結(jié)果將抗褐飛虱水稻材料RB5(HaoPY，LiuCX，WangYY,ChenRZ，TangM,DuB,ZhuLL,HeGC(2008)Herbivore-inducedcallosedepositiononthesieveplatesofrice:animportantmechanismforhostresistance.PlantPhysiology146:1810-1820)與褐飛虱感性水稻品種(臺(tái)中本地1號(hào)，TNl，購自國家水稻種質(zhì)資源庫)雜交構(gòu)建了含5pW4的F2群體。為了鑒定F2定位群體中每個(gè)單株的抗褐飛虱表型，釆用了苗期集團(tuán)法考察群體中各個(gè)單株的抗性表現(xiàn)(見圖1B)。F2單株的抗蟲級(jí)別按對(duì)應(yīng)的Fw家系所有單株的抗蟲級(jí)別的平均值計(jì)算。用PCR(polymerasechainreaction)和聚丙烯酰胺凝膠電泳，以及RFLP探針和Southern雜交的方法(見《分子克隆》第四版)，檢測(cè)F2各個(gè)單株的SSR和RFLP分子標(biāo)記的分離情況。根據(jù)F2的分子標(biāo)記分型，應(yīng)用JoinMap3.0軟件，構(gòu)建水稻染色體的分子標(biāo)記遺傳連鎖圖。對(duì)苗期集團(tuán)法中收集到的數(shù)量化抗褐飛虱表現(xiàn)型數(shù)據(jù)，借助數(shù)量性狀分析軟件MapQTL5.0進(jìn)行區(qū)間作圖定位分析。結(jié)果顯示在第3染色體分子標(biāo)記R1925和G1318之間存在著一個(gè)QTL峰值，LOD值達(dá)到49.3，對(duì)表型方差貢獻(xiàn)率為90.6%。2.5/^24的精細(xì)定位根據(jù)前期結(jié)果，用PCR(polymerasechainreaction)和聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法，以R1925和G1318外側(cè)的兩個(gè)SSR標(biāo)記RM514和SMI篩選F2群體得到了54株重組單株。整合重組單株的分子標(biāo)記，對(duì)分子標(biāo)記相同且抗蟲鑒定的級(jí)別處于同一水平的單株合并(表1)。RT25-RT15這12株單株除SA69這個(gè)單株，表型與分子標(biāo)記SM1完全一致，但在SA69中，表型與G1318相同。因此，將5;/L^定位在SMl和G1318之間。表lF2重組單株的抗蟲表現(xiàn)單株編號(hào)RM514SG1R1925SG9SG6RM570SM1G1318表型抗蟲級(jí)別RT1RRRRRRHHH5.6RT5RRRRRHHHH4.74RT16RRHHHHHHH5.83RT2RHHHHHHHH5.49SA50RHHHHHRRR3.93SA74HHHHHHRRR3.96SA55SHHHHRRRR3.86RT18HHHHHRRRR4.04RT83HHHHRRRRR4.56RT82HHHRRRRRR4.1RT10HRRRRRRRR4.43RT25HHHSSSHHH4.88SA51HHSSSHHSH4.48SA66HHSSsHHSH4.78SA69SSSSsHHsS7.38RT84HHHHHHSsS7.23RT24HHHHHSSsS8.55SA60HHHSSSSss7.55RT3HSSSsSSss8.25SA102SSSSssSHs8.32RT8SSsSssHHH5.58RT7SSsssHHHH5.39RT17SSssHHHHH4.35RT15sHHHHHHHH4.963.抗褐飛虱水稻基因組文庫的構(gòu)建ii植物高分子量基因組DNA的制備參照張洪斌等的方法(Zhang等，PreparationofmegabaseDNAfromplantnuclei.PlantJ1995，7,175-184)。提取抗褐飛虱水稻B5(WangBN,HuangZ,ShuiLH,RenX,LiXH,HeGC(2001)Mappingoftwonewbrownplanthopperresistancegenesfromwildrice.ChineseScienceBulletin46:1092-1095)的嫩葉細(xì)胞核，用低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋。將包埋塊加入適量的限制性內(nèi)切酶BamHI進(jìn)行部分酶切，用CHEFMapper脈沖電泳儀進(jìn)行交變脈沖電泳分離所需片段。切下含所需大片段區(qū)域的最濃部分的膠條放入透析袋中，電泳透析回收所需的DNA大片段(Strong等,MarkedimprovementofPACandBACcloningisachievedusingelectroelutionofpulsed-fieldgel-separatedpartialdigestsofgenomicDNA.NucleicAcidsRes.1997,25,3969-3961)。電透析分離的大片段DNA被收集到1.5ml離心管中，按600ng回收的DNA片段(50-250Kb)與200ng的BIBAC2脫磷載體混合在60。C加熱10min冷卻至室溫，加入T4DNA連接酶，在16。C下連接16h。取2^il連接產(chǎn)物和40plDH10B感受態(tài)細(xì)胞用GenePulserSystem進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，37。C培養(yǎng)過夜。挑取上述平板上長出的陽性菌落到含有7(^1培養(yǎng)液的384孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37'C培養(yǎng)30h。文庫構(gòu)建完畢，用GenetixQ-PIX拷貝兩份，-S(TC保存。為了估算插入片段大小和克隆體積的分布情況，從文庫中隨機(jī)挑取30個(gè)BIBAC克隆，按堿裂解法提取質(zhì)粒，用適量的NotI酶切后，脈沖電泳檢測(cè)插入片段的大小(ShiZY，RenX,WengQM,LiXH,HeGC(2003)ConstructionofgenomiclibraryofaBPH-resistantricelinewithbinaryvectorandphysicalmapofQbpllocus.PlantScience1165:879-885)。4.SM1-G1318區(qū)段物理圖譜的構(gòu)建篩選出R1925-G1318區(qū)段所有的BAC克隆，用B";wHI和￡coRI雙酶切后電泳、轉(zhuǎn)膜。再將酶切后的克隆末端用放射性a-"P-dCTP標(biāo)記，與BAC克隆膜進(jìn)行Southern雜交，方法同前，根據(jù)雜交信號(hào)判斷哪些BAC克隆有重疊以及重疊片段的大小，以此構(gòu)建物理圖譜(圖3C)。BAC陽性克隆末端分離參照劉耀光等(LiuandWhittier,ThermalasymmetricinterlacedPCR:automatableamplificationandsequencingofinsertendfragmentsfromPIandYACclonesforchromosomewalking.Genomics25:674—681)發(fā)明的TAIL-PCR方法。篩選以及TAIL-PCR結(jié)果顯示BAC克隆76B10包含了完整的^7/zW基因(圖3C)。5.SM1-G1318區(qū)段候選基因的分析對(duì)5pW4基因所在克隆的全序列進(jìn)行了測(cè)序分析，并以該序列為目標(biāo)序列，搜索NCBI數(shù)據(jù)庫，得到曰本晴基因組在該區(qū)段的同源序列。用RiceGAAS進(jìn)行基因預(yù)測(cè)和注解，同樣用ClustalW進(jìn)行比較分析(表2)。表2Sp力"基因區(qū)段抗蟲水稻預(yù)測(cè)基因與日本晴預(yù)測(cè)基因的比較該區(qū)段日本晴預(yù)測(cè)的基因該區(qū)段抗蟲水稻預(yù)測(cè)的基因相似編號(hào)預(yù)測(cè)功能氨基外顯編預(yù)測(cè)功能氨基外顯度酸數(shù)子數(shù)號(hào)酸數(shù)子數(shù)(%)gl假定的ARPC蛋白752gl假定的ARPC蛋白753100p20p20g2假定的B細(xì)胞受體2173g2假定的B細(xì)胞受體189294.7相關(guān)蛋白31相關(guān)蛋白31g3假定的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座革19974g4丁假定的NO誘導(dǎo)蛋2384g3假定的NO誘導(dǎo)蛋246496.6白畫白NOIg4假定的抗病蛋白1333283.4g5假定的RPM1的互148433.8作蛋白R(shí)IN4g5假定的抗病蛋白13151g6假定的抗病蛋白1121399.6g6未知蛋白152g7假定蛋白1483g7未知蛋白1322g8假定蛋白1153g8假定的RPM1的互1683g9未知蛋白2233作蛋白R(shí)IN4g9未知蛋白492gio假定蛋白872gll假定的抗病蛋白6802gio假定的抗病蛋白680299.7比較兩者預(yù)測(cè)的基因，發(fā)現(xiàn)抗蟲水稻的第4個(gè)基因編碼的抗病蛋白與曰本晴差異較大。目前均認(rèn)為刺吸式昆蟲吸食水稻與病原菌對(duì)水稻的侵染過程類似，水稻抗刺吸式昆蟲的機(jī)理就有可能和抗病原菌相同。因此，將該基因確定為為5/7/Z/《136.cDNA文庫的篩選以預(yù)測(cè)基因所對(duì)應(yīng)的EST作探針，對(duì)褐飛虱誘導(dǎo)的抗蟲水稻B5cDNA文庫(WangXL,WengQM,YouAQ,ZhuLL，HeGC(2003)CloningandcharacterizationofriceRH3geneinducedbybrownplanthopper.ChineseScienceBulletin48:1976-1981)進(jìn)行唾菌體原位雜交篩選。經(jīng)過三輪原位雜交，將挑選的單個(gè)噬斑PCR檢測(cè)，再酶切檢測(cè)插入片段的大小，測(cè)序分析得到BpW4的全長cDNA,其核苷酸序列如序列表SEQIDNO.2所示。實(shí)施例2:5;;/^/基因的功能驗(yàn)證和應(yīng)用1.遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建所用載體為pCAMBIA1301(購自澳大利亞CenterfortheApplicationofMolecularBiologytoInternationalAgriculture)。根據(jù)基因組測(cè)序的結(jié)果，設(shè)計(jì)引物(5，cggaattcctccctgactgaagaagagaagag3',5，cggaattctgctagctgtgattctcttatgatg3，)，其包括^^RI的接頭，擴(kuò)增抗蟲水稻B5的基因組(Z.Huang等，Identificationandmappingoftwobrownplanthopperresistancegenesinrice.r/^wJ/^/Ge"W，2001，102:929-934)。PCR反應(yīng)總體積50jlU:1jn1DNA，10xbuffer5m1，10mMdNTP1|a1，10uM引物各3|a1，高保真Taq酶1U;反應(yīng)程序94°C2min，94°C15s，58°C30s,72。C7min30s，共30個(gè)循環(huán)；產(chǎn)物加1/10體積的3mMNaAC和2x體積的無水乙醇純化。所得序列包括5pW4上游1960bp的啟動(dòng)子、4997bp的基因組序列以及下游436bp的3，非翻譯區(qū)。用&o貝酶切，酶切反應(yīng)體系總體積為20jal:PCR產(chǎn)物約5ial(liag)、lx反應(yīng)緩沖液、汝o及IlU,混勾后37。C酶切過夜，1/10體積的3mMNaAC和2x體積的無水乙醇沉淀，回收所需片段。pCAMBIA1301載體酶切體系同上，試劑盒純化回收。連接反應(yīng)基因組片段lml,載體0.5jlU，2UT41igase，5xbuffer2ju1，總10ial體積，4。C連接過夜；連接產(chǎn)物與大腸桿菌DH10B混勻，42。C熱激90s，加400ju1LB，復(fù)蘇45分鐘，取200jul涂于含卡那霉素的LA平板，37°C，過夜。挑單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，抽質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證。挑陽性克隆，把構(gòu)建好的載體電轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌EHA105，抽質(zhì)粒，PCR驗(yàn)證正確，取750^ll含構(gòu)建好載體的農(nóng)桿菌菌液加等體積的50%甘油混勻，-7(TC保存。根據(jù)cDNA全長序列，設(shè)計(jì)引物，包括和^Z)fll的接頭(5，tccccccgggatggcggagctaatggccac3'，5'gctctagactacttcaagcacatcagccta3')。用Invitrogen公司的TRIzol從B5葉鞘中提取總RNA，再用Fermentas公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得B5的cDNA,反應(yīng)體系總RNAl昭，oligo(dT)1^1，5xbuffer4|il，inhibitor1^1,10mMdNTP2|a，逆轉(zhuǎn)錄酶1^1,42。C反應(yīng)1小時(shí)。用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增B5的cDNA,PCR反應(yīng)體系同上，程序72。C延伸4min，即得到5;/2/4的cDNA序列。同時(shí)轉(zhuǎn)錄cDNA序列所需的啟動(dòng)子可以從pCAMBIA1301中存在的35S啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增獲得。設(shè)計(jì)引物包括五coRI和Xmal的接頭(5'cggaattcatggtggagcacgacactct3，,5'tccccccgggatctcattgccccccgggat3，)，從pCAMBIA1301擴(kuò)增35S的啟動(dòng)子序列。PCR反應(yīng)體系同上，反應(yīng)延伸時(shí)間為lmin。將35S的啟動(dòng)子和pCAMBIA1301載體分別用五coRI和^)wfll酶切回收后連接轉(zhuǎn)化，獲得的陽性克隆再和^pW4的cDNA序列分別用Xmal和^&al酶切，回收，連接轉(zhuǎn)化，構(gòu)建35S:B/W4的載體，并將構(gòu)建好的35S:5//zW的載體電轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌EHA105中，具體過程同上。2.遺傳轉(zhuǎn)化釆用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Hiei等，1994，Efficienttransformationofrice(Ojzasa&vaL.)mediatedbyv4grofeacfe〃.wwandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA.尸/a"fJbwr"a/6:271-282)將上述5pW4基因組轉(zhuǎn)化載體和cDNA轉(zhuǎn)化載體分別導(dǎo)入褐飛虱感性的普通水稻品種Kasalath(購自國家水稻種質(zhì)資源庫或國際水稻研究所)，同時(shí)采用空載體(pCAMBIA1301)作對(duì)照。3.5/;/L^基因表達(dá)的結(jié)果和應(yīng)用兩個(gè)轉(zhuǎn)化載體分別獲得的組培苗14株，對(duì)照4株。田間播種，分別收獲了Tl代后，選擇純合株系(各14個(gè)株系)做抗蟲鑒定。經(jīng)過苗期鑒定以及成熟期植株的抗蟲鑒定，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)褐飛虱的抗性均明顯增強(qiáng)，而對(duì)照株不具有抗褐飛虱抗性。轉(zhuǎn)基因水稻苗期的抗蟲級(jí)別均在3-5級(jí)之間，成熟期的轉(zhuǎn)基因植株放蟲后存活良好，且能正常結(jié)實(shí)。同時(shí)，取食電位儀EPG(PeiyingHaoetal，Herbivore-inducedcallosedepositiononthesieveplatesofrice:animportantmechanismforhostresistance.PlantPhysiol,2008,146:1810-1820)檢測(cè)褐飛虱取食轉(zhuǎn)基因植株時(shí)，軔皮部的取食時(shí)間明顯減少；蜜露量(P.Paguia,HoneydewexcretionmeasurementtechniquesfordeterminingdifferentialfeedingactivityofbiotypeofM/a/"rv"to/wge"jonricevarieties.J.Econ.Entomol，1980,73:35-40)的檢測(cè)證實(shí)了褐飛虱取食轉(zhuǎn)基因植株時(shí)的排泄量減少。因此，克隆得到的5pW4能使水稻對(duì)褐飛虱的取食產(chǎn)生抗性。實(shí)施例3:分子標(biāo)記輔助選擇帶有5/^W基因的抗褐飛虱水稻根據(jù)5/W4基因的基因組序列和cDNA序列，可設(shè)計(jì)多對(duì)SSR標(biāo)記或STS標(biāo)記的引物。本例中釆用引物對(duì)5'ctgctgctgctctcgtattg3，，5'cagggaagctccaagaacag3，，作為標(biāo)記引物，來選育具有抗蟲功能的水稻，其擴(kuò)增片段長度為172bp。提取抗蟲水稻，感蟲品種以及其雜交、回交后代植株的基因組DNA,應(yīng)用^W4基因序列設(shè)計(jì)的引物PCR擴(kuò)增后，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法，進(jìn)行分子標(biāo)記檢測(cè)。雜交后代植株中與抗蟲水稻PCR帶型一致者(擴(kuò)增產(chǎn)物中含有172bp的片段)，即為選擇出來的含有5;W4基因的植株(如圖2)。這些植株的抗蟲性通過苗期集團(tuán)法鑒定和成熟期鑒定確認(rèn)(如圖1),通過自交和農(nóng)藝性狀選擇，培育成抗褐飛虱的水稻。序列表說明SEQIDNo.1是^/z"基因的核苷酸序列，SEQIDNo.2是其cDNA序列，SEQIDNo.3是其編碼的蛋白序列；SEQIDNo.4&5以及SEQIDNo.6&7是用于從B5基因組中擴(kuò)增5pW4基因的引物對(duì)；SEQIDNo.8&9是用于擴(kuò)增5pW4基因的cDNA的引物對(duì)；SEQIDNo.lO&ll是用于從pCAMBIA1301中擴(kuò)增35S啟動(dòng)子的引物對(duì);SEQIDNo.l2&13是，"基因的標(biāo)記引物。序歹U表〈110>武漢大學(xué)<120〉水稻抗褐飛虱基因及其應(yīng)用<130〉KHP08113283.6<勝13〈170>Patentlnversion3.5<210>1〈211>9600<212>DNA〈213>0ryzasativa〈400〉1cccgggcctttctccagtatctccatgatgattgtttggattaacagacctccctggaga60tttacccttgcgggcattttcgaaatactgtgtgtag鄉(xiāng)tgttcaccacggtcttcatc120ctcccagcttccaaatttaggaacttgtttatgctggtagagattaacaa180tttgcgttaggcagacagcatatgctgattgctgaatctactacacgggcttgttgcctt240gtcagttgtcatctttcatatgt犯cagga幼tagtatataattctagcc300ttccatccgtatatttctagattcattagctactagaatg360acttac3ttgt犯aacagagaaagtatgattatct肌actctcagatagtctattgtaat420cattgt3tgccttgtgtcaaagctgcagctttgttggatc480tactagttctaaaaaaaacagaatttacttagatcctgctgaaagacttcgggccaatta540gaagcccagtatttggccca犯actggtgt犯3Ct3C3ggcccataatsga^犯t犯gttc6003Ctggaiggtcccccaacttaacaccgagatttttttg鄉(xiāng)tcccttaacc660犯tgcgtacccctaaactatgt犯aaccgtaaggtcccgaggcagtatag720Ugctcggtttcgctgacgtggcatcctagtcagcaaaaaaaatatgtgg780ggcccacatgt犯gtg柳ga犯atggtgtgggccccacatttctcctttcttttctttt840tctcttctcttctctcccgattttctcgagtgggcgcggcggcagagggg900ccggcggtggagcgggggtggtggg卿ggggggctggcgcgacgtcggcggcgggag犯960卿g柳ggaggcggctggcgcgacggcgagctcggacggcaacggcgggaggaggagga1020gg柳gg3ggcagtcggcgctgtaa犯cgcgcatgggatgcggcggatgatgtcgagcgg1080gacggtgtcctcatcaccatcttcctcatcgtcatcgcagtctgcgggtgccgggcggag1140cggtttgggagggagggggaggcggccsgcgagcccgttcgagctcgcccggcctgcgcg1200cgagctcgcccctcccatagcttggtgtgctggggacgacgscgagg犯aggggg卿犯1260ggaattgacggccgatgatagc犯tggcgggcgagcgcggcgccgggctgctcatgctcg1320ccgaccaggcccccggcttcgccgcactcgtccgccgtgctcgcccacgcactcgccgac1380ctccgctccacccgccgctcctgcccgctgcccgctgcccgccggcctccctgactgaag1440agaaaaaaag1500atgtgtagctgacatgtgggccccatgtacuuttatntttttgctgactagaatgcc1560acgtcagcgagL3CC3CCC3tatatactgtcataggaccttgagtgcatagtttgtgtgag1620tttagggatacacatttctcgttttgtagttaagggacctCgt犯3犯tCtcgctgttaa1680gttg卿gacccctccggtgaacttattcccccaaatetttttctccatgctctgggctc31740aacgcactcttggatgggccgtgtaa/tctacaccatttctggcccaatccaacgaaggta1800gctccagactcctaactccgccgccgcatgcccaatcctcgccggccgccgctgccatct1860cccttcccccaccgccaccgtcgccttctccgttcccccaacaaaggctcagtagc兆ca1920gccgcggcgcgg卿gc卿ggccttggagggcctgcagaggagcgcccgcgtcgacgaa1980gacgacatcagcaggcagtggacatggcgactgcgaatgctatcgccgacgtgggagctt2040C3ggCg娜3tgcgtggccttcatcag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。8、含有權(quán)利要求7所述載體的宿主。9、權(quán)利要求1~3任一所述基因或權(quán)利要求5所述分子標(biāo)記在水稻選育中的應(yīng)用。10、權(quán)利要求13任一所述基因在提高水稻抗褐飛虱抗性中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了水稻抗褐飛虱基因Bph14，其具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列，其cDNA序列如SEQIDNo.2所示，本發(fā)明Bph14基因?qū)儆贑C-NBS-LRR基因家族，編碼的蛋白質(zhì)與植物抗病性相關(guān)。Bph14基因具有抗褐飛虱的功能，通過遺傳轉(zhuǎn)化和雜交，將Bph14基因轉(zhuǎn)入普通水稻品種，能夠提高水稻對(duì)褐飛虱的抗性，從而減輕褐飛虱產(chǎn)生的危害，達(dá)到增產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)的目的。文檔編號(hào)C12N15/29GK101463354SQ20091007651公開日2009年6月24日申請(qǐng)日期2009年1月6日優(yōu)先權(quán)日2009年1月6日發(fā)明者何光存,張維林,波杜,祝莉莉,陳榮智申請(qǐng)人:武漢大學(xué)