PCA3 mRNA/ACPP mRNA RT-PCR檢測(cè)引物及檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是指一種PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR檢測(cè)引物 及檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] ACPP (前列腺酸性磷酸酶，）是編碼非特異性酪氨酸磷酸酶，在酸性（PH4-6)條件 下，此酶對(duì)多種底物具有去磷酸化作用。ACPP底物包括烷基，芳基和?；恼姿釂熙ズ土?酸化蛋白質(zhì)。在雄性激素的調(diào)控下前列腺上皮細(xì)胞合成ACPP，并分泌到精液中。在前列腺 中ACPP mRNA的表達(dá)量是任何其他組織的100倍以上。利用ACPP抗體進(jìn)行IHC染色顯示 在前列腺組織中細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間均出現(xiàn)很明顯的免疫組化染色反應(yīng)，證明ACPP是一種前 列腺特異基因。ACPP蛋白能在血清中被檢測(cè)出來(lái)。在病理狀態(tài)下，前列腺上皮細(xì)胞會(huì)脫落 進(jìn)入血液和尿液中。受損的前列腺上皮細(xì)胞將釋放出ACPP mRNA和蛋白質(zhì)成分。自1940 年以來(lái)，血清ACPP -直被作為前列腺癌的診斷標(biāo)志物。但是，ACPP在前列腺癌變，特別是早 期癌變中變化不大，八十年代，ACPP檢測(cè)被PSA (Prostate Cancer membrane Antigen，又 稱(chēng)KLK3)檢測(cè)取代了。前列腺癌特異性基因（如PCA3mRNA)的表達(dá)已被用于前列腺癌的診 斷。然而，單個(gè)基因的定量檢測(cè)可能受到多方面的干擾，如：樣品中前列腺上皮細(xì)胞的RNA 總量以及RNA百分含量等。一些持家基因如GAPDH和肌動(dòng)蛋白已被證明可用作內(nèi)控。然而， 他們都存在的缺陷。在前列腺癌的發(fā)展過(guò)程中GAPDH mRNA表達(dá)水平會(huì)發(fā)生變化，而肌動(dòng) 蛋白和TBP可在其他組織中表達(dá)，降低分析的準(zhǔn)確性。這些問(wèn)題對(duì)僅能獲得少量樣本的惡 性腫瘤的早期檢測(cè)或篩查影響很大。ACPP mRNA作為定量?jī)?nèi)控遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于上述提到的那些內(nèi) 控：第一，ACPP mRNA在前列腺中有很高的表達(dá)，并能夠容易且可靠地檢測(cè)出來(lái)。第二，ACPP mRNA僅在前列腺上皮細(xì)胞中表達(dá)，特異性強(qiáng)。第三，在正常前列腺上皮細(xì)胞與前列腺腫瘤細(xì) 胞中ACPP mRNA表達(dá)水平基本一致。因此，ACPP mRNA水平是一個(gè)非常好的細(xì)胞定量的內(nèi) 控（內(nèi)參）基因，提供樣品中前列腺上皮細(xì)胞含量的信息。前列腺特異性基因 ACPP mRNA的 定量分析提供了一個(gè)敏感的方法，可用于生物活檢標(biāo)本或循環(huán)系統(tǒng)的前列腺癌細(xì)胞樣本中 前列腺上皮細(xì)胞的定量檢測(cè)。它可以被用來(lái)監(jiān)測(cè)前列腺癌擴(kuò)散到循環(huán)系統(tǒng)和其他器官的情 況。當(dāng)與其他標(biāo)記物相結(jié)合時(shí)，它也可以用于前列腺癌的高度準(zhǔn)確的篩查。
[0003] 通過(guò)Northern blot法分析正常前列腺、良性前列腺增生和前列腺癌細(xì)胞及其轉(zhuǎn) 移灶，PCA3基因特異性地高度表達(dá)于人類(lèi)前列腺癌細(xì)胞，正常前列腺、良性前列腺增生細(xì)胞 中僅少量表達(dá)。Bussemakers在56例前列腺癌患者中就發(fā)現(xiàn)有53例的PCA3基因強(qiáng)陽(yáng)性， 腫瘤組織與癌旁組織相比，其表達(dá)量上調(diào)10-100倍，但是腫瘤組織PSA mRNA的表達(dá)與前列 腺增生組織相比沒(méi)有明顯差別，因此認(rèn)為與PSA相比，PCA3基因是一個(gè)前列腺癌特異性很 強(qiáng)的基因。這表明PCA3mRNA可以作為診斷前列腺癌或者判斷預(yù)后的有價(jià)值的腫瘤標(biāo)記物。 使PCA3表達(dá)具有前列腺癌特異性的基因啟動(dòng)子可以為前列腺癌的基因治療提供新的分子 生物學(xué)工具。Bussemakers在前列腺癌組織中均觀察到PCA3基因的表達(dá)，這表明PCA3可 能是前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的早期事件，其表達(dá)的上調(diào)可能提示腫瘤的發(fā)生，或者提示PCA3 基因在前列腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著一定的作用。PCA3基因的表達(dá)量隨著腫瘤細(xì)胞惡性 程度的增加有逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，提示PCA3基因?qū)τ谇傲邢侔┑呐R床分期及病理分級(jí)有潛 在價(jià)值。運(yùn)用高靈敏度的RT-PCR技術(shù)，在正常人動(dòng)脈、大腦、乳腺、膀胱、結(jié)腸、十二指腸、 心臟、肝臟、肺、睪丸、胰腺、胎盤(pán)、精囊、肌肉、皮膚、脾臟、卵巢等中均未見(jiàn)PCA3表達(dá)，來(lái)源 于乳腺、十二指腸、睪丸、卵巢的腫瘤組織中也未見(jiàn)PCA3基因表達(dá)。分析前列腺癌的八種細(xì) 胞系，分別是 ALVA-31、DU-145、JCA-1、LNCaP、PC-3、PPC-1 和 TSU-pr 1，發(fā)現(xiàn) PCA3 基因僅在 LNCaP細(xì)胞系中表達(dá)，LNCaP細(xì)胞為雄激素依賴細(xì)胞系，PC-3、DU-145等為雄激素非依賴細(xì) 胞系，PCA3基因在PC-3、DU-145中表達(dá)缺失可能提示PCA3基因前列腺癌細(xì)胞在由激素依 賴向非依賴的轉(zhuǎn)變過(guò)程中起著一定作用，研究PCA3基因的功能可能會(huì)給前列腺癌由激素 依賴向非依賴轉(zhuǎn)變的機(jī)制提供新的思路。PCA3基因多表達(dá)于前列腺癌上皮細(xì)胞，而不是基 質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)RISH(RNA原位雜交）法可以證實(shí)。
[0004] 同樣，de Kok等研究發(fā)現(xiàn)PCA3是診斷前列腺癌的特異性、高靈敏性的工具。運(yùn)用 實(shí)時(shí)定量的RT-PCR技術(shù)，能準(zhǔn)確量化地檢測(cè)PCA3。它具有診斷前列腺癌和判斷其預(yù)后的價(jià) 值。de Kok等運(yùn)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)，絕對(duì)定量正常前列腺、前列腺增生組織、前列腺癌 組織中PCA3拷貝數(shù)，同時(shí)定量各樣本中rRNA拷貝數(shù)，取其比值來(lái)減少樣本間差異。為了比 較PCA3作為診斷前列腺癌工具的有效性，有學(xué)者把PCA3在上述組織中的表達(dá)與其它敏感 的前列腺癌瘤標(biāo)比較，如人端粒末端轉(zhuǎn)移酶反轉(zhuǎn)錄酶基因（hTERTgene)，hTERT是通過(guò)端粒 末端轉(zhuǎn)移酶的活性來(lái)表達(dá)的，端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性被認(rèn)為是一個(gè)有前景的前列腺癌相關(guān)腫 瘤標(biāo)記物，在90%以上的前列腺癌中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)，在正常和良性前列腺增生組織中表達(dá)很 低或不表達(dá)。de Kok等通過(guò)分析11例正常前列腺、5例BHP和31例前列腺腺癌樣本發(fā)現(xiàn)， PCA3和hTERT在前兩種標(biāo)本中含量都很少，PCA3(均值為1. 7,范圍0~5. 2)和hTERT (均 值為174,范圍0~593)，兩者之間沒(méi)有明顯的差別。但在前列腺腺癌中，PCA3(334~ 39465、均值為 5849, p <0· 0001)和 hTERT (0· 7 ~76. 1、均值為 10. 1，P <0· 0001)均有顯 著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與良性組織相比，前列腺腺癌細(xì)胞中PCA3的含量增加了 34倍，而hTERT 僅為6倍。即使組織中前列腺癌細(xì)胞的含量少10%)，PCA3的表達(dá)量也明顯高于正常或 者增生的前列腺組織。在白細(xì)胞中無(wú) PCA3表達(dá)，但是能檢測(cè)到hTERT mRNA，表明如果通過(guò) 血液、尿液、前列腺按摩液或者精液，hTERT mRNA可能導(dǎo)致假陽(yáng)性，而PCA3mRNA卻能檢測(cè)出 進(jìn)入這些體液的少量癌細(xì)胞。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PCA3的表達(dá)與前列腺癌的臨床分期及病理分級(jí)有 相關(guān)性。通過(guò)接收機(jī)運(yùn)行曲線（Receiver operating curve R0C)分析，曲線下面積（Area under the curve AUC)代表其診斷效率。PCA3的AUC-ROC為0· 98 (95%可信區(qū)間0· 96~ 1. 00)，而hTERT的AUC-ROC為0. 88 (95%可信區(qū)間0. 78~0. 97)，表明PCA3診斷前列腺癌 的特異性和敏感性要好于hTERT。
[0005] PCA3基因是一種非編碼基因，在檢測(cè)方面，無(wú)法使用以蛋白或抗體為基礎(chǔ)的檢測(cè) 方法。RISH法、RT-PCR技術(shù)可在前列腺組織穿刺細(xì)胞學(xué)活檢和體液（如血液、精液、尿液和 前列腺按摩液）檢測(cè)中應(yīng)用。
[0006] ACPP mRNA在前列腺中的高表達(dá)，是一個(gè)前列腺特異基因，是前列腺癌RT-PCR檢 測(cè)中理想的內(nèi)參.與PSA mRNA內(nèi)參的相比，以他們有相似的前列腺的應(yīng)用，在前列腺中的 表達(dá)比其他組織高1000倍以上，而ACPP在人群中表達(dá)的個(gè)體差異不明顯。
[0007] 但是，與正常前列腺組織相比，PSA在前列腺癌中的表達(dá)升高兩倍（p，0. 01);而 ACPP的表達(dá)沒(méi)有變化。
[0008] 前列腺癌（PCa)為老年性疾病，具有病因復(fù)雜、發(fā)病部位隱蔽、潛伏期長(zhǎng)且病理表 現(xiàn)多樣等特點(diǎn)，是歐美國(guó)家男性泌尿生殖道最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在美國(guó)男性 腫瘤中占第二位，約占男性腫瘤的17%，死亡率占第二位。2003年美國(guó)新發(fā)現(xiàn)前列腺癌患 者220900人，死亡28900人。迄今為止，我國(guó)前列腺癌發(fā)病率雖遠(yuǎn)低于歐美發(fā)達(dá)國(guó)家，但 其增長(zhǎng)較為迅速。由于我國(guó)人口老齡化、飲食結(jié)構(gòu)的改變以及診斷技術(shù)的不斷提高，前列 腺癌的發(fā)病率在不斷上升。顧方六等以北京大學(xué)泌尿外科研究所建所前后50年間泌尿外 科共收治住院病人為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)80年代后前列腺癌在泌尿系腫瘤中所占比例呈直線 上升趨勢(shì)，由3. 3%上升至13. 4%。全國(guó)的發(fā)病率已由50年代的0.2/10萬(wàn)升至90年代的 1. 2-3. 4/10萬(wàn)，依據(jù)2012年中國(guó)腫瘤登記年報(bào)顯示，前列腺癌為中國(guó)男性癌癥發(fā)病率的第 6位，中國(guó)邏輯性癌癥死亡率的第9位，雖然與歐美國(guó)家的102/10萬(wàn)相比要低得多，但也有 逐年增高的趨勢(shì)。因此前列腺癌的早期診斷有重要的臨床意義。
[0009] 早期前列腺癌可以通過(guò)前列腺癌根治手術(shù)或者放療獲得治愈，如果腫瘤發(fā)生了遠(yuǎn) 處轉(zhuǎn)移或者局部臨近器官的侵犯，臨床治療效果較差。我國(guó)前列腺癌患者在確診時(shí)往往處 于進(jìn)展期，抗雄性激素治療雖然在一定范圍內(nèi)可以抑制腫瘤進(jìn)展，但終究不能根治，該類(lèi)前 列腺癌患者預(yù)后往往較差。目前的臨床檢查方法也不能判斷前列腺癌患者的病情是將保持 穩(wěn)定還是將進(jìn)展為威脅患者生命的侵襲性前列腺癌。目前臨床上把PSA (前列腺特異抗原） 作為篩選前列腺癌的首選標(biāo)記物，PSA具有前列腺組織特異性，無(wú)前列腺癌特異性，前列腺 增生、前列腺炎、急性尿儲(chǔ)留、前列腺的各種手術(shù)操作和有關(guān)前列腺的各種檢查（如DRE)， 即使僅有很輕微的損傷，均可引起血清PSA水平的升高，導(dǎo)致診斷的特異性降低，臨床使用 其篩選前列腺癌時(shí)常常導(dǎo)致不必要的前列腺穿刺。因此，尋找早期發(fā)現(xiàn)前列腺癌的腫瘤標(biāo) 記物成為降低前列腺癌死亡率的關(guān)鍵。目前在前列腺癌腫瘤標(biāo)志物的研究方面已經(jīng)取得了 很大的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了一些前列腺癌特異的基因或者抗原，PSM已被廣泛地運(yùn)用于前列腺癌 的臨床診斷和治療中。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的人血管舒緩素激膚釋放酶2〇1111]^111^1111〇^;[11-2)和 前列腺干細(xì)胞抗原（PSCA)也被證實(shí)為前列腺癌特異性基因，但它們并不能提高前列腺癌 的早期診斷率?；?DD3mRNA (即為PCA3mRNA)高度表達(dá)于前列腺癌細(xì)胞中（> 95%)，對(duì) 于前列腺癌診斷的敏感性和特異性大于90%，作為早期診斷、判斷預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物，顯示 出良好的應(yīng)用前景。
[0010] 從國(guó)內(nèi)外研究成果來(lái)看，PCA3mRNA對(duì)前列腺癌的診斷靈敏度與特異性均好PSA， 將替代PSA檢測(cè)成為前列腺癌一線診斷試劑，其主要用途有：
[0011] 1)臨床前列腺癌的早期篩查與診斷；
[0012] 2)前列腺疾病人群的前列腺癌的排除診斷；
[0013] 3)前列腺癌病人預(yù)后診斷與療效評(píng)價(jià)；
[0014] 4)男性人群的健康體檢篩查。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明提出一種PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR檢測(cè)引物及檢測(cè)試劑盒，解決了現(xiàn) 有技術(shù)中對(duì)前列腺癌的診斷靈敏度與特異性差的問(wèn)題。
[0016] 本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0017] 一種PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR檢測(cè)引物，包括如下序列：
[0018] ACPPmRNA基因的引物設(shè)計(jì)與合成：參照Genebank提供的ACPPmRNA基因序列，應(yīng) 用Genamic expression軟件設(shè)計(jì)5'端及3'端引物：
[0019] 上游引物：5 ' -CTCCTCAACATGAGAGCTGC-3 '
[0020] 下游引物：5 ' -TATATACTCTCCAAGTTCATA-3 '。
[0021] 一種 PCA3mRNA/ACPP mRNA RT-PCR 檢測(cè)試劑盒，包括：
[0022] ACPPmRNA基因的引物設(shè)計(jì)與合成：
[0023] 上游引物：5 ' -CTCCTCAACATGAGAGCTGC-3 '
[0024] 下游引物：5 ' -TATATACTCTCCAAGTTCATA-3 ' ；以及
[0025] PCA3mRNA基因的引物設(shè)計(jì)與合成：參照Genebank提供的PCA3mRNA序列，應(yīng)用 Genamic expression軟件設(shè)計(jì)5'端及3'端引物；共設(shè)計(jì)2對(duì)引物