一種干酪乳桿菌中肌醇代謝基因簇的快速定性檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種干酪乳桿菌中肌醇代謝基因簇的快速定性檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法應(yīng)用基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR），通過(guò)對(duì)干酪乳桿菌肌醇代謝基因簇側(cè)翼保守區(qū)域的擴(kuò)增和凝膠電泳圖譜的分析來(lái)確定該代謝途徑的有無(wú)，從而能夠在一個(gè)工作日內(nèi)快速完成對(duì)干酪乳桿菌中肌醇代謝基因簇分布規(guī)律的檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】一種干酪乳桿菌中肌醇代謝基因簇的快速定性檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是干酪乳桿菌中肌醇代謝基因簇的快速定性檢測(cè)。所述檢測(cè)方法運(yùn)用基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)對(duì)干酪乳桿菌群中肌醇代謝基因簇進(jìn)行快速、定性檢測(cè)。檢測(cè)工作可在一個(gè)工作日內(nèi)完成。
【背景技術(shù)】
[0002]酸馬奶是以新鮮馬奶為原料，經(jīng)乳酸菌和酵母菌等微生物共同自然發(fā)酵形成的酸性、低酒精含量的乳飲料。制作和飲用酸馬奶盛行于我國(guó)的內(nèi)蒙古、新疆等地區(qū)的蒙古族、維吾爾族、哈薩克族等游牧民族中。肌醇是酸馬奶的重要組成成分之一，屬于B族維生素類營(yíng)養(yǎng)元素。對(duì)人體來(lái)講，它是肝臟、骨髓生長(zhǎng)的必須物質(zhì)；對(duì)脂肪有親和性，可促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生卵磷脂，降膽固醇，抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，抗氧化，保護(hù)心肌細(xì)胞等。作為酸馬奶中的“生物活素”，肌醇一方面是酵母的代謝中間產(chǎn)物，另一方面又可作為乳酸菌特別是干酪乳桿菌生長(zhǎng)繁殖的重要碳源。在這種情況下，了解和掌握酸馬奶中乳酸菌代謝肌醇的能力對(duì)其品質(zhì)的控制就顯得尤為重要。
[0003]傳統(tǒng)方法中，對(duì)不同乳酸菌肌醇代謝能力的定性檢測(cè)仍然采用基于生理生化反應(yīng)的方法。這種方法易受培養(yǎng)條件、菌種特性等因素影響，檢測(cè)效率有限，而且受外界環(huán)境因素和培養(yǎng)基性能的影響大，檢測(cè)結(jié)果缺乏穩(wěn)定性和可靠性，且耗時(shí)耗力。PCR技術(shù)一經(jīng)出現(xiàn)就被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和微生物學(xué)領(lǐng)域，避免了傳統(tǒng)生化方法鑒定中交叉污染的問(wèn)題。具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為分子生物學(xué)和微生物學(xué)領(lǐng)域定性檢測(cè)的重要方法。
[0004]綜上所述，采用基于乳桿菌屬特異性引物的PCR技術(shù)，建立簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的酸馬奶中干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)肌醇代謝基因簇的定性測(cè)定方法,可以簡(jiǎn)化肌醇代謝能力的檢測(cè)程序、提高檢測(cè)效率。本發(fā)明針對(duì)干酪乳桿菌群中編碼的肌醇代謝基因簇，依據(jù)參考文獻(xiàn)自行設(shè)計(jì)了一種基于PCR技術(shù)的快速、定性檢測(cè)方法，通過(guò)對(duì)電泳圖譜的分析來(lái)確定干酪乳桿菌中肌醇代謝基因簇的分布規(guī)律。這一方法的建立無(wú)疑將有助于傳統(tǒng)酸馬奶加工工藝的改進(jìn)，也可為我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌重要代謝途徑的研究和開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction, PCR)技術(shù),通過(guò)對(duì)酸馬奶源干酪乳桿菌肌醇代謝基因簇側(cè)翼保守區(qū)域的擴(kuò)增和對(duì)凝膠電泳圖譜的分析來(lái)確定肌醇代謝基因簇的有無(wú)，從而完成對(duì)干酪乳桿菌群中肌醇代謝基因簇分布規(guī)律的檢測(cè)。
[0006]所述干酪乳桿菌群中肌醇代謝基因簇的快速定性檢測(cè)方法具體操作步驟包括:
[0007]從干酪乳桿菌中提取DNA，
[0008]應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增干酪乳桿菌肌醇代謝基因簇側(cè)翼區(qū)域，
[0009]將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，通過(guò)對(duì)干酪乳桿菌肌醇代謝基因簇側(cè)翼區(qū)域的擴(kuò)增和凝膠電泳圖譜的分析來(lái)確定該代謝途徑的有無(wú)，從而完成對(duì)干酪乳桿菌群中肌醇代謝基因簇分布規(guī)律的定性檢測(cè)，其中擴(kuò)增引物對(duì)為
[0010]F:5，-ATTTAACCAAATTGACCGACACA-3，；
[0011]R: 5 ’ -ATTCAGGAGAGGACAAAGATGCC-3，。
[0012]更具體地，其操作步驟如下:
[0013]a.干酪乳桿菌DNA的提??；
[0014]細(xì)菌培養(yǎng)液5ml，10，OOOrpm離心I分鐘，棄上清加入適量溶菌酶溶液，使其最終濃度為20mg/ml，徹底懸浮，37°C處理30-60分鐘；加入20 μ I的20mg/ml蛋白酶K溶液，混勻；加220 μ I緩沖溶液GB，振蕩15秒；70°C放置30分鐘；加入220 μ I無(wú)水乙醇，充分振蕩15秒;將溶液加入吸附柱中，12，OOOrpm離心30秒;加500 μ I去蛋白液⑶，12，OOOrpm離心30秒，棄廢液；加700 μ I漂洗液Gff, 12，OOOrpm離心30秒，棄廢液；加500 μ I漂洗液Gff,12，OOOrpm離心30秒，棄掉廢液；再次12，OOOrpm離心2分鐘，將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘；將吸附柱轉(zhuǎn)入干凈的離心 管中，加50-200 μ I洗脫緩沖液TE，室溫置2-5分鐘，12，OOOrpm離心30秒；離心得到的溶液再次加入吸附柱中，室溫放置2分鐘，12，OOOrpm離心2分鐘，即得到干酪乳桿菌基因組DNA。
[0015]b.肌醇代謝基因簇側(cè)翼區(qū)域的擴(kuò)增
[0016]擴(kuò)增體系:
[0017]PCR 擴(kuò)增體系:0.2 μ ITaq 聚合酶，2.5 μ 110 X PCR 緩沖液，2.5mMdNTP 各2 μ 1，25mMMgCl22 μ 1，I μ I 上游引物，I μ I 下游引物，I μ I 基因組 DNA 和 10.3 μ IddH20.[0018]PCR擴(kuò)增條件:
[0019]94°C 變性 5min ；94°C 30s, 58.5 °C 30s, 72 °C 40s，如此進(jìn)行 45 次循環(huán)；72°C 延伸IOmin,4°C IOmin ；
[0020]c.瓊脂糖凝膠電泳
[0021]將PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中以5V/cm的電壓，電泳20_30min，EB染色，紫外拍照，檢測(cè)擴(kuò)增效果，通過(guò)與對(duì)照菌株條帶對(duì)比得出結(jié)果。
[0022]其中，干酪乳桿菌Lactobacillus caseiAG8-3，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)為CGMCCN0.7966，保藏日2013年07月25日，保藏地址為100101北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1:肌醇代謝基因簇示意圖，其中引物用黑色方框表示；
[0024]圖2:擴(kuò)增2株干酪乳桿菌肌醇代謝基因簇側(cè)翼區(qū)域電泳圖.M = DNAmarker;泳道I =Zhang ;泳道2:AG8_3。其中，不編碼肌醇代謝基因簇的菌株才可得到1.5Kb的PCR產(chǎn)物。
【具體實(shí)施方式】
[0025]干酪乳桿菌群中肌醇代謝基因簇的快速檢測(cè):
[0026]1、實(shí)驗(yàn)方法
[0027]1.1PCR引物設(shè)計(jì)與合成
[0028]如圖1所示，肌醇代謝基因簇由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(iolR)、肌醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(iolT)、丙二酸半醛脫氫酶(iolA)、假想蛋白(iolB)、2-脫氧-5-D-葡萄糖酸激酶(iolC)、類乙酰乳酸合酶(iolD)、肌醇脫氫酶(iolGl)、肌醇單酮脫水酶(iolE)、果糖-二磷酸鹽醛縮酶(iolj)和丙二酸半醛脫羧酶(iolK)共11個(gè)基因組成，其側(cè)翼區(qū)域編碼基因?yàn)槿┩€原酶(yvgN)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(gntR)基因。為了確保檢測(cè)效率，PCR引物根據(jù)GenBank提供的干酪乳桿菌肌醇代謝基因簇及其側(cè)翼區(qū)域相關(guān)序列(Accession No: CP001084),按照PrimerPrimer5.0軟件的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)引物落在擴(kuò)增效率較高的區(qū)域，由上海桑尼生物科技有限公司合成。
[0029]引物序列:
[0030]F:5，-ATTTAACCAAATTGACCGACACA-3，；
[0031]R:5， -ATTCAGGAGAGGACAAAGATGCC-3，；
[0032]1.2干酪乳桿菌DNA的提取。
[0033]總DNA的提取 參照QIAGEN的細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。
[0034]待檢菌株均分離自酸馬奶，其中干酪乳桿菌Zhang保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心(保藏號(hào)為=CGMCC N0.1697)，干酪乳桿菌AG8-3保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)為CGMCC N0.7966，保藏日2013年07月25日，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。細(xì)菌培養(yǎng)液5ml，10, OOOrpm離心I分鐘，棄上清。加入適量溶菌酶溶液，使其最終濃度為20mg/ml，徹底懸浮，37°C處理30-60分鐘。加入20 μ I蛋白酶K (20mg/ml)溶液，混勻。加220 μ I緩沖溶液GB，振蕩15秒。70°C放置30分鐘。加入220 μ I無(wú)水乙醇，充分振蕩15秒。將溶液加入吸附柱中，12，OOOrpm離心30秒。加500 μ I去蛋白液⑶，12，OOOrpm離心30秒，棄廢液。加700 μ I漂洗液Gff, 12，OOOrpm離心30秒，棄廢液。加500 μ I漂洗液GW，12，OOOrpm離心30秒，棄掉廢液。再次12，OOOrpm離心2分鐘，將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘。將吸附柱轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，加50-200 μ I洗脫緩沖液TE，室溫置2-5分鐘，12，OOOrpm離心30秒。離心得到的溶液再次加入吸附柱中，室溫放置2分鐘，12，OOOrpm離心2分鐘，即得到干酪乳桿菌基因組DNA。
[0035]1.3目的片斷的PCR擴(kuò)增
[0036]PCR 擴(kuò)增體系:0.2ylTaq polymerase (5U / μ I, TakaraTokyo, Japan) , 2.5 μ 110 X PCR Buffer (without Mg2+) , 2 μ IdNTP (2.5mMeach)，2y lMgCl2(25mM)，1μ I 上游引物(50pM)，I μ I 下游引物(50ρΜ)，I μ I 基因組 DNA 和10.3 μ IddH20.[0037]PCR 擴(kuò)增條件:94°C變性 5min ；94°C 30s, 58.5°C 30s, 72°C 40s,如此進(jìn)行 45 次循環(huán)；72°C延伸 IOmin,4。。IOmin0
[0038]1.4瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)
[0039]取PCR產(chǎn)物5 μ 1，同I μ I上樣緩沖液混合均勻，點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠孔中，在另一孔中加入5 μ lDL2000Marker, 120V/cm電壓下電泳30min。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)⑶S_8000System(UVP Biomaging Systems)上留取照片，通過(guò)與對(duì)照菌株條帶對(duì)比得出結(jié)
果O
[0040]因?yàn)樵诰幋a肌醇代謝基因簇的情況下，擴(kuò)增產(chǎn)物大于14kb。所以可以認(rèn)為在普通PCR條件下，只有不編碼肌醇代謝基因簇的菌株才可得到1.5Kb的PCR產(chǎn)物。以具備肌醇代謝能力的干酪乳桿菌Zhang以及不具備肌醇代謝能力的干酪乳桿菌AG8-3為待檢樣本對(duì)引物進(jìn)行測(cè)試。如圖2所示，檢測(cè)效果良好，這也說(shuō)明該引物可以用于肌醇代謝基因簇分布規(guī)律 的檢測(cè)。
【權(quán)利要求】
1.一種干酪乳桿菌中肌醇代謝基因簇的快速定性檢測(cè)方法，其特征在于具體操作步驟包括: 從干酪乳桿菌中提取DNA， 應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增干酪乳桿菌肌醇代謝基因簇側(cè)翼區(qū)域， 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，通過(guò)對(duì)干酪乳桿菌肌醇代謝基因簇側(cè)翼區(qū)域的擴(kuò)增和凝膠電泳圖譜的分析來(lái)確定該代謝途徑的有無(wú)，從而完成對(duì)干酪乳桿菌中肌醇代謝基因簇分布規(guī)律的定性檢測(cè)，其中擴(kuò)增引物對(duì)為
F:5’ -ATTTAACCAAATTGACCGACACA-3’ ；
R:5，-ATTCAGGAGAGGACAAAGATGCC-3，。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的干酪乳桿菌群中肌醇代謝基因簇的快速定性檢測(cè)方法，其具體操作步驟如下: a.干釀乳桿菌DNA的提?。? 細(xì)菌培養(yǎng)液5ml，10, OOOrpm離心I分鐘，棄上清加入適量溶菌酶溶液，使其最終濃度為20mg/ml，徹底懸浮，37°C處理30-60分鐘；加入20 μ I的20mg/ml蛋白酶K溶液，混勻；加220 μ I緩沖溶液GB，振蕩15秒；70°C放置30分鐘；加入220 μ I無(wú)水乙醇，充分振蕩15秒；將溶液加入吸附柱中，12，OOOrpm離心30秒；加500 μ I去蛋白液⑶，12，OOOrpm離心30秒，棄廢液；加700 μ I漂洗液Gff, 12，OOOrpm離心30秒，棄廢液；加500 μ I漂洗液Gff,12，OOOrpm離心30秒，棄掉廢液；再次12，OOOrpm離心2分鐘，將吸附柱置于室溫?cái)?shù)分鐘；將吸附柱轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，加50-200 μ I洗脫緩沖液TE，室溫置2-5分鐘，12，OOOrpm離心30秒；離心得到的溶液再次加入吸附吸附柱中，室溫放置2分鐘，12，OOOrpm離心2分鐘，即得到干酪乳桿菌基因組DNA ； b.肌醇代謝基因簇側(cè)翼區(qū)域的擴(kuò)增 擴(kuò)增體系: PCR 擴(kuò)增體系:0.2 μ ITaq 聚合酶，2.5 μ 110XPCR 緩沖液，2.5mMdNTP 各2 μ 1，25mMMgCl22y Ι,?μ I 上游引物，1μ I 下游引物，1μ I 基因組 DNA 和 10.3 μ IddH2O ；PCR擴(kuò)增條件:
94°C變性 5min ；94°C 30s, 58.5°C 30s, 72°C 40s,如此進(jìn)行 45 次循環(huán)；72°C延伸 IOmin,4°C IOmin ； c.瓊脂糖凝膠電泳 將PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中以5V/cm的電壓，電泳20_30min，EB染色，紫外拍照，檢測(cè)擴(kuò)增效果，通過(guò)與對(duì)照菌株條帶對(duì)比得出結(jié)果。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103451293SQ201310396346
【公開(kāi)日】2013年12月18日 申請(qǐng)日期:2013年9月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月4日
【發(fā)明者】張文羿, 張和平 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)