鮑曼不動(dòng)桿菌實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種鮑曼不動(dòng)桿菌實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒，其試劑盒中含有二條外側(cè)引物、二條內(nèi)測引物及一條環(huán)引物，通過使用試劑盒中特異性引物，利用實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增靶序列的特定區(qū)域，在一系列質(zhì)控和陰性、陽性對照的輔助下，從分子水平上對鮑曼不動(dòng)桿菌核酸進(jìn)行檢測。本發(fā)明的試劑盒具有簡便、快速、靈敏度高和特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】鮑曼不動(dòng)桿菌實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種鮑曼不動(dòng)桿菌實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌在全世界范圍醫(yī)院內(nèi)廣泛傳播流行，成為醫(yī)院獲得性感染的重要致病菌。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不動(dòng)桿菌屬至少有33個(gè)基因種，其中鮑曼不動(dòng)桿菌是引起醫(yī)院獲得性感染的最重要的基因種。另外，醋酸鈣不動(dòng)桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、不動(dòng)桿菌基因種3和不動(dòng)桿菌基因種13TU在遺傳和表型方面都十分相似，傳統(tǒng)的生化鑒定方法很難區(qū)分這4種不動(dòng)桿菌，故臨床上常常把它們統(tǒng)稱為醋酸鈣一鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合群。然而，這4種不動(dòng)桿菌的流行病學(xué)和臨床特征存在著一定的差異。因此，快速鑒定鮑曼不動(dòng)桿菌并正確區(qū)分醋酸鈣一鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合群，對預(yù)防鮑曼不動(dòng)桿菌爆發(fā)流行和指導(dǎo)臨床治療具有重要的意義。
[0003]目前，臨床上鑒定鮑曼不動(dòng)桿菌主要依靠細(xì)菌培養(yǎng)和一系列的生化反應(yīng)檢測。雖然廣泛使用于臨床，但存在多種缺陷:⑴繁瑣耗時(shí)，一般需要48-72h，如果做藥敏試驗(yàn)，所需的時(shí)間更長；⑵要求送檢快，否則細(xì)菌易出現(xiàn)死亡或被空氣污染導(dǎo)致假陰性或假陽性；⑶難以區(qū)分醋酸鈣一鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合群。
[0004]隨著分子生物學(xué)和基因診斷技術(shù)的迅速發(fā)展，尤其是作為生物技術(shù)里程碑的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)的出現(xiàn)以及細(xì)菌核酸測序技術(shù)的不斷完善，在基因水平診斷細(xì)菌，已成為病原菌診斷的新的研究方向。用于鮑曼不動(dòng)桿菌鑒定的分子生物學(xué)方法已有一些研究報(bào)道，以PCR為基礎(chǔ)的鑒定方法如多重PCR，實(shí)時(shí)定量PCR具有敏感、快速等優(yōu)點(diǎn)，但存在許多不足:⑴需要昂貴的儀器和試劑；(2)對檢測人員有較高的技術(shù)要求；⑶容易引起交叉污染，出現(xiàn)假陽性等。另外，還有DNA-DNA雜交、16S rRNA基因限制性酶切分析、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性指紋圖譜、16與23S間區(qū)直接測序分析等，但這些方法相對于臨床實(shí)驗(yàn)室而言，有的費(fèi)用過于昂貴，有的操作過于繁瑣，難以推廣應(yīng)用。
[0005]實(shí)時(shí)突光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Real-time fluorescence loop mediatedisothermal amplification, RealAmp)則使床邊病原體檢測成為可能。我們利用一臺(tái)擴(kuò)增單元與熒光檢測單元相結(jié)合的小型便攜式儀器即可完成鮑曼不動(dòng)桿菌的檢測。RealAmp除具有LAMP的特點(diǎn)外，還有以下優(yōu)點(diǎn):⑴在儀器液晶顯示屏上可直接判讀結(jié)果，或者在電腦上實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)；(2) DNA模板無需純化等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種鮑曼不動(dòng)桿菌實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒，其使床邊病原體檢測成為可能。
[0007]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種鮑曼不動(dòng)桿菌實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒，其試劑盒中含有二條外側(cè)引物、二條內(nèi)測引物及一條環(huán)引物，這五條特異引物分別為:[0008]外側(cè)引物為:
[0009]F3:5’-CTTCTGTTAATAGGTCTAAGCG-3’
[0010]B3:5’-TTAAATACCCCTGCTCATCA-3’
[0011]內(nèi)測引物為:
[0012]FIP: 5’-CGGCGATCATCCCCATGAAAGCTCATTTTAATTTTATGGGCAA-3’
[0013]BIP:5’-GCTCCGAATAGCTCTGTTGAGTGCTGAGACTTTTGTAATTCTGAT-3’
[0014]環(huán)引物為:
[0015]LB:5’-CTGGCCTCACAGTTTATGGTCA-3’
[0016]本發(fā)明最大的優(yōu)點(diǎn)為該試劑盒使床邊病原體檢測成為可能，還具有如下優(yōu)點(diǎn):適合于實(shí)驗(yàn)室快速檢測鮑曼不動(dòng)桿菌且特異性強(qiáng)、等溫高效、敏感性高及操作簡便。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是表示實(shí)時(shí)突光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Real-time fluorescence loopmediated isothermal amplification, RealAmp)試劑盒的擴(kuò)增時(shí)間和祀DNA數(shù)量之間的關(guān)系圖。圖中X軸表示反應(yīng)時(shí)間，Y軸表示熒光強(qiáng)度；1:100ng/yL ；2:10ng/yL；3:lng/yL ；4:100pg/yL ；5:10pg/yL ；6:lpg/yL ；PC:陽性對照；NC:陰性對照。
[0018]圖2是表示RealAmp試劑盒和PCR檢測鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606的敏感性比較圖。(A)RealAmp試劑盒檢測鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606的敏感性。圖中X軸表示反應(yīng)時(shí)間，Y 軸表示熒光強(qiáng)度；1:lX107CFU/mL ；2:lX106CFU/mL ；3:lX105CFU/mL ；4:1 X IO4CFU/mL ;5:1 X 103CFU/mL ;6:1 X 102CFU/mL ;7:1 X 11CFUAiL ；NC:陰性對照；(B) PCR 檢測鮑曼不動(dòng)桿菌 ATCC19606 的敏感性。1:lX107CFU/mL ；2:lX106CFU/mL ；3:lX105CFU/mL ；4:I X 104CFU/mL ;5:1 X 103CFU/mL ;6:1 X 102CFU/mL ;7:1 X IO1CFUZmL ；NC:陰性對照。
[0019]圖3是表示RealAmp試劑盒檢測醋酸鈣一鮑曼不動(dòng)桿菌復(fù)合群圖。圖中X軸表示反應(yīng)時(shí)間，Y軸表示熒光強(qiáng)度；1:鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606 ；2:不動(dòng)桿菌基因種13TU;3:不動(dòng)桿菌基因種3 ；4:醋酸鈣不動(dòng)桿菌；PC:陽性對照；NC:陰性對照。
【具體實(shí)施方式】
[0020]一種鮑曼不動(dòng)桿菌實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒，其試劑盒中含有二條外側(cè)引物、二條內(nèi)測引物及一條環(huán)引物，這五條特異引物分別為:
[0021]外側(cè)引物為: [0022]F3:5’-CTTCTGTTAATAGGTCTAAGCG-3’
[0023]B3:5’-TTAAATACCCCTGCTCATCA-3’
[0024]內(nèi)測引物為:
[0025]FIP:5’-CGGCGATCATCCCCATGAAAGCTCATTTTAATTTTATGGGCAA-3’
[0026]BIP:5’-GCTCCGAATAGCTCTGTTGAGTGCTGAGACTTTTGTAATTCTGAT-3’
[0027]環(huán)引物為:
[0028]LB:5’-CTGGCCTCACAGTTTATGGTCA-3’
[0029]試劑盒中的五條引物是通過以下方式制得:
[0030]一:在線軟件設(shè)計(jì)試劑盒中的五條引物[0031]以鮑曼不動(dòng)桿菌中編碼聚-P-(1-6)-乙酰氨基葡萄糖(poly-0-(1-6)-N_acetylglucosamine, PGA)的 pgaD 基因(GeneBank 登錄號:FJ866500, CP003856, CP003500,CP001937, CP002522, CP001921, CP000863, CP001172, CP001182, CU459141, CP000521, NZ_GG704572)的保守序列為目的片段，通過計(jì)算機(jī)上的在線軟件Primer Explorer (http://Primer Explorer, jp/e/v4_manual/Index.html)設(shè)計(jì) 5 條特異引物，分別為外側(cè)引物(F3和B3)、內(nèi)側(cè)引物(FIP和BIP)及環(huán)引物L(fēng)B (見表1)。具體過程如下:
[0032]1、從 http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nucleotide/ 中下載鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC17978的pgaD基因全序列，保存為FASTA格式。
[0033]2、上傳pgaD基因全序列:(1)點(diǎn)擊計(jì)算機(jī)上的在線軟件Primer Explorer V4上的“Browser”按鈕,上傳鮑曼不動(dòng)桿菌的pgaD基因全序列到在線軟件Primer Explorer V4啟動(dòng)窗口 ；⑵選擇“Normal”選項(xiàng)！⑶點(diǎn)擊“Primer Design”按鈕進(jìn)行引物設(shè)計(jì)；
[0034]3、設(shè)計(jì)外側(cè)引物(F3和B3)和內(nèi)側(cè)引物(FIP和BIP):⑴點(diǎn)擊“Detail Settings”按鈕，選擇“Parameter Condition”下拉菜單中的“AT rich”選項(xiàng)，同時(shí)選擇“Ignore range”按鈕！⑵點(diǎn)擊“Generate”按鈕,生成1000套引物；⑶在“Sorting Rule”的下拉菜單中選擇“Easy”，點(diǎn)擊“Display”按鈕，顯示12套引物列表；
[0035]4、顯示結(jié)果:引物列表窗口顯示每一套引物的ID，二聚體形成的自由能及引物F2、F3、Flc, Blc、B2和B3所對應(yīng)的位置；
[0036]5、選擇最佳的外側(cè)引物(F3和B3)和內(nèi)側(cè)引物(FIP和BIP):根據(jù)BLAST比對引物特異性、F2和B2的3’末端及Flc和Blc的5’末端的穩(wěn)定性、二聚體發(fā)生的趨勢、Tm值和GC含量等來選擇最佳外側(cè)引物和內(nèi)側(cè)引物；
[0037]6、設(shè)計(jì)LB環(huán)引物:⑴點(diǎn)擊“Primer Information”按鈕,保存最佳外側(cè)引物(F3和B3)和內(nèi)側(cè)引物(FIP和BIP)信息用于設(shè)計(jì)環(huán)引物；⑵在計(jì)算機(jī)在線軟件Primer ExplorerV4啟動(dòng)窗口上傳先前保存的“Primer Information”文件，然后點(diǎn)擊“Primer Design”按鈕保持參數(shù)為默認(rèn)值，點(diǎn)擊“Generate”按鈕，生成42條LB環(huán)引物，未生成LF環(huán)引物；⑷點(diǎn)擊“Display”按鈕，顯示環(huán)引物列表；
[0038]7、選擇最佳LB環(huán)引物:根據(jù)環(huán)引物3’末端的穩(wěn)定性來選擇最佳LB環(huán)引物。
[0039]二、確定RealAmp試劑盒的特異性和敏感性
[0040] (一)標(biāo)準(zhǔn)菌株及源自臨床痰標(biāo)本的分離株
[0041]鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所惠贈(zèng)。醋酸鈣不動(dòng)桿菌、不動(dòng)桿菌基因種3和不動(dòng)桿菌基因種13TU各I株由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院呼吸科惠贈(zèng)。所有菌株生長在LB培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)。使用TaKaRa MiniBEST細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606的基因組DNA。為了評估擴(kuò)增時(shí)間和DNA數(shù)量之間的關(guān)系，用滅菌蒸餾水10倍梯度稀釋鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606的基因組DNA，使其濃度分別為 IOOng/ V- L、10ng/ u L、lng/ u L> IOOpg/ u L、10pg/ u L 和 lpg/ u L。
[0042](二)痰標(biāo)本處理及DNA提取
[0043]1、在痰液中加入3倍體積4%NaOH旋緊瓶蓋強(qiáng)烈震蕩，室溫放置40min后輕柔混勻，吸取Iml液化后的痰液至注明編號的1.5ml Ep管中，蓋緊蓋子，12000rpm離心lOmin，收集沉淀。
[0044]2、用Imll XTE緩沖液洗滌沉淀一次，12000rpm離心lOmin，收集沉淀。[0045]3、加入40ul滅菌蒸餾水于沉淀中，并混勻。
[0046]4、將上述Ep管置于金屬干浴鍋中，100°C煮沸15min后立即置于冰上lOmin。
[0047]5、12000rpm 離心 IOmin,取上清用于 RealAmp 和 PCR 檢測。
[0048](三)確定RealAmp試劑盒的特異性
[0049]為了確定試劑盒的特異性，我們提取臨床常見的銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等22株菌的DNA為模板進(jìn)行檢測(見表2)。RealAmp反應(yīng)體系如下:各
0.2 μ M的F3和Β3外側(cè)引物，各1.6 μ M的FIP和BIP內(nèi)側(cè)引物，0.8 μ M的LB環(huán)引物，8U 的 Bst DNA 聚合酶(New England Biolabs, Ipswich, MA), 0.5 μ L 的 1:100 倍稀釋的 SYBR green I (Invitrogen), 2x 反應(yīng)液(含 40mM Tris-HCl pH8.8>20mM KCl、16mMMgS04、20mM(NH4)2S04、0.2%Tween-20、0.8M Betaine 和 2.8mM dNTPs)和 2yL 提取的模板DNA，反應(yīng)終體積為25yL，反應(yīng)在0.2mL PCR管中進(jìn)行。RealAmp反應(yīng)條件如下:
0.2mL PCR 管置于小型便攜式儀器 ESE-Quant Tube Scanner (QIAGEN Lake ConstanceGmbH, Stockach，Germany)的反應(yīng)孔中，設(shè)置參數(shù)為:每隔30s收集一次熒光信號，63°C反應(yīng)60min。該儀器重約lkg,大小為74mmX 178mmX 188mm。帶有鋰離子可充電電源,無需外部電源即可使用。RealAmp的反應(yīng)產(chǎn)物檢測和結(jié)果判讀:無需電泳，在小型便攜式儀器的液晶顯示屏上即可直接判讀結(jié)果，或者將儀器與電腦連接，可在電腦上實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)曲線，并判讀結(jié)果。
[0050](四)確定RealAmp試劑盒的敏感性
[0051]為了確定試劑盒的敏感性并比較RealAmp和PCR的敏感性，用LB培養(yǎng)基10倍梯度稀釋過夜培養(yǎng)液從 I X 107CFU/mL tolC^CFU/mL。CFU (colony formingunit)是經(jīng)培養(yǎng)所得菌落形成單位的英文縮寫。RealAmp反應(yīng)體系如下:各0.2 μ M的F3和B3外側(cè)引物，各
1.6μ M的FIP和BIP內(nèi)側(cè)引物，0.8μΜ的LB環(huán)引物jU的Bst DNA聚合酶(New EnglandBiolabs, Ipswich, MA), 0.5 μ L 的 1:100 倍稀釋的 SYBR green I (Invitrogen), 2x 反應(yīng)液(含 40mM Tris-HCl ρΗ8.8、20mM KCl、16mM MgS04、20mM(NH4)2S04、0.2%Tween_20、0.8MBetaine和1.8mM dNTPs)和2 μ L提取的模板DNA，反應(yīng)終體積為25 μ L,反應(yīng)在0.2mL PCR管中進(jìn)行。RealAmp反應(yīng)條件如下:0.2mL PCR管置于小型便攜式儀器ESE-Quant TubeScanner (QIAGEN Lake Constance GmbH, Stockach, Germany)的反應(yīng)孔中，設(shè)置參數(shù)為:每隔30s收集一次熒光信號，63°C反應(yīng)60min。PCR反應(yīng)體系如下=IXPCR緩沖液(IOmMTris-HCl pH8.3, 50mM KCl) ,0.2mMdNTPs, 1.5mM MgCl2，各 400nM 的 F3 和 B3 外側(cè)引物，0.5U的Taq聚合酶(Takara C0.Ltd., Japan),和2 μ L的DNA模板。PCR反應(yīng)條件如下:94°C預(yù)變性5min, 94°C變性30s, 52°C退火30s, 72°C延伸45s,共計(jì)30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。RealAmp的反應(yīng)產(chǎn)物檢測和結(jié)果判讀:無需電泳，在小型便攜式儀器的液晶顯示屏上即可直接判讀結(jié)果，或者將儀器與電腦連接，可在電腦上實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)曲線，并判讀結(jié)果。另外，取5 μ L PCR產(chǎn)物用于2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。
[0052](五)RealAmp測定臨床痰標(biāo)本分離的菌株驗(yàn)證試劑盒的敏感性和特異性
[0053]為了驗(yàn)證試劑盒的敏感性和特異性，我們收集2012年8月~2012年10月由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院和廣州醫(yī)科大學(xué)呼吸疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離的臨床痰標(biāo)本162份。所有痰標(biāo)本必須進(jìn)行涂片革蘭染色鏡檢，評價(jià)痰標(biāo)本質(zhì)量，并記錄所見細(xì)菌等病原體情況。2h內(nèi)經(jīng)鏡檢白細(xì)胞數(shù)>10 /低倍鏡和鱗狀上皮細(xì)胞數(shù)〈25 /低倍鏡判定為合格標(biāo)本。這162份痰標(biāo)本經(jīng)VITEK-2自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定到種，其中90份痰標(biāo)本有鮑曼不動(dòng)桿菌生長，72份痰標(biāo)本沒有鮑曼不動(dòng)桿菌生長，痰標(biāo)本中的細(xì)菌含量在IX IO3-1X 108CFU/mL (見附表
I)。所有從痰標(biāo)本中分離到的鮑曼不動(dòng)桿菌經(jīng)16S rRNA基因測序確定，然后用常規(guī)PCR和RealAmp進(jìn)行檢測。
[0054]三、結(jié)果
[0055](一)RealAmp試劑盒的擴(kuò)增時(shí)間和靶DNA數(shù)量之間的關(guān)系
[0056]結(jié)果顯示隨著祀DNA數(shù)量的減少，RealAmp擴(kuò)增時(shí)間延長(見圖1)。
[0057](二)試劑盒的敏感性
[0058]用RealAmp檢測鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC19606，結(jié)果顯示試劑盒的檢測下限為lX103CFU/mL，而PCR的檢測下限為lX104CFU/mL (見圖2)，說明該試劑盒的靈敏度好。RealAmp的擴(kuò)增時(shí)間在15_60min之間。臨床痰樣本的細(xì)菌含量越低，RealAmp的擴(kuò)增時(shí)間越長。
[0059](三)試劑盒的特異性
[0060]我們選擇8株屬于不動(dòng)桿菌屬的菌株和18株屬于其他非不動(dòng)桿菌屬的菌株(見表2)。結(jié)果表明，用RealAmp檢測方法可以從18株屬于其他非不動(dòng)桿菌屬的菌株中區(qū)分鮑曼不動(dòng)桿菌(見表2)，說明該試劑盒的特異性強(qiáng)。此外，RealAmp試劑盒還可以區(qū)分鮑曼不動(dòng)桿菌、醋酸鈣不動(dòng)桿菌和不動(dòng)桿菌基因種3 (見圖3)。
[0061](四)RealAmp測定臨床痰標(biāo)本分離的菌株驗(yàn)證試劑盒的敏感性和特異性
[0062]RealAmp與VITEK2自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀和常規(guī)PCR的敏感性和特異性比較的結(jié)果見表
3。在VITEK2自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定的90個(gè)陽性標(biāo)本中，RealAmp檢測結(jié)果顯示89個(gè)為陽性( + )，PCR檢測結(jié)果顯示84個(gè)為陽性(+ );在VITEK2自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定的72個(gè)陰性標(biāo)本中，RealAmp檢測結(jié)果顯示54個(gè)為陰性(_)，PCR檢測結(jié)果顯示60個(gè)為陰性(_)。與VITEK2自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀相比，RealAmp試劑盒的敏感性和特異性分別為98.9% (95%C1:94.0-99.8%)和75.0%(95%C1:63.9 - 83.6%);與PCR相比，RealAmp試劑盒的敏感性和特異性分別為 100% (95%C1:95.6 - 100%)和 90.0%(95%C1:79.9-95.3%)。
[0063]四、結(jié)論
[0064]上述試驗(yàn)證明鮑曼不動(dòng)桿菌的RealAmp試劑盒具有敏感性高、特異性強(qiáng)、快速簡單和操作容易等特點(diǎn)，適合于實(shí)驗(yàn)室和床邊快速檢測鮑曼不動(dòng)桿菌。
[0065]表1 =RealAmp試劑盒中的外側(cè)引物、內(nèi)側(cè)引物及環(huán)引物的序列
[0066]TablelSequences of primers F3，B3，F(xiàn)IP，BIP and LB used in the kit ofRealAmp assay.
【權(quán)利要求】
1.一種鮑曼不動(dòng)桿菌實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒，其特征在于該試劑盒中含有二條外側(cè)引物、二條內(nèi)測引物及一條環(huán)引物，這五條特異引物分別為: 外側(cè)引物為:
F3:5’-CTTCTGTTAATAGGTCTAAGCG-3’
B3:5’-TTAAATACCCCTGCTCATCA-3’ 內(nèi)測引物為:
FIP:5’-CGGCGATCATCCCCATGAAAGCTCATTTTAATTTTATGGGCAA-3’
BIP:5’-GCTCCGAATAGCTCTGTTGAGTGCTGAGACTTTTGTAATTCTGAT-3’ 環(huán)引物為:
LB:5’-CTGGCCTCACAGTTTATGGT`CA-3’ 。`
【文檔編號】C12Q1/04GK103525909SQ201310415777
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月12日
【發(fā)明者】周燕斌, 王琴琴 申請人:周燕斌, 王琴琴