專利名稱：一株不動(dòng)桿菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體涉及ー株不動(dòng)桿菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水體富營(yíng)養(yǎng)化已成為困擾世界各國(guó)的普遍性環(huán)境問(wèn)題。浮游藻類的大量繁殖導(dǎo)致水華的頻繁爆發(fā)，嚴(yán)重影響了人類的生活、生產(chǎn)和身體健康，造成了世界范圍內(nèi)的生態(tài)災(zāi)害，探索控制水華發(fā)生的有效途徑已迫在眉睫。目前治理水體富營(yíng)養(yǎng)化主要是采用物理和化學(xué)方法，但這兩種方法不僅會(huì)消耗大量的財(cái)カ和物力，而且會(huì)在一定程度上破壞生態(tài)環(huán)境。溶藻菌作為水華和赤潮的防治生物，日益受到國(guó)內(nèi)外環(huán)境工作者的廣泛關(guān)注。國(guó)外對(duì)溶藻菌的研究已有數(shù)十年的歷史，自Geitler報(bào)道ー種寄生在剛毛藻上的粘細(xì)菌以來(lái)， 陸續(xù)有溶藻菌的相關(guān)報(bào)道，研究重點(diǎn)也逐漸從単一溶藻菌的篩選及溶藻特性研究過(guò)渡到菌-一藻種群生態(tài)學(xué)及分子調(diào)控機(jī)理等方面。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)溶藻細(xì)菌的研究還處于初始階段，因此，尋找高效溶藻菌對(duì)溶藻菌的深入研究及應(yīng)用具有重要意義。水華魚腥藻是導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化的主要藻種之一，分布廣，能夠產(chǎn)生藻毒素，直接和間接危害人類，然截止目前，利用微生物方式控制水華魚腥藻的研究甚是罕見。為此，本發(fā)明通過(guò)分離純化高效溶藻菌株，探討該溶藻菌株對(duì)水華魚腥藻的生長(zhǎng)效應(yīng)和光合色素的影響，對(duì)于安全、經(jīng)濟(jì)、高效的控制水體富營(yíng)養(yǎng)化、治理水華具有重要的科學(xué)實(shí)踐價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之ー是提供ー種不動(dòng)桿菌；本發(fā)明的目的之ニ是提供ー種利用微生物去除水華魚腥藻(引起水華的常見藻類)的方法，以消除當(dāng)前水華中水華魚腥藻的大量繁殖帶來(lái)的環(huán)境污染問(wèn)題。本發(fā)明中的不動(dòng)桿菌從農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(南方)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室黃化的水華魚腥藻液中分離篩選并獲得，已于2012年6月6日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCCjii :中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。保藏編號(hào)為CGMCC No. 6196。其分類命名為不動(dòng)桿菌，拉丁名=Acinetobacter
sp. O為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案一株不動(dòng)桿菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO :I 所示，命名為 Acinetobacter SSAL-8。上述不動(dòng)桿菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟A、以黃化的水華魚腥藻液作為溶藻細(xì)菌的分離源，采用涂布平板法及分區(qū)劃線法多次純化分離得到25株溶藻細(xì)菌；B、將分離獲得的25株溶藻細(xì)菌分別置于IOOmL LB液體培養(yǎng)基中，在180r .min'37°C下培養(yǎng)24h ；C、將經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的25株溶藻細(xì)菌分別取800 u L滴加到水華魚腥藻固體平板上，通過(guò)溶藻斑的大小考察、比較各菌的溶藻效果，最終篩選出具有較高溶藻效應(yīng)的菌株SSAL-8，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌，命名為Acinetobacter SSAL-8 ；D、將菌株Acinetobacter SSAL-8接入斜面培養(yǎng)基，于4°C擴(kuò)大培養(yǎng)制成菌懸液；E、將菌懸液加入到滅菌的甘油中，甘油的最終濃度為25%,放入_80°C的冰箱保藏。上述的不動(dòng)桿菌的構(gòu)建方法，其中，所述的LB液體培養(yǎng)基的組分及含量為酵母提取物，5g ;胰蛋白胨，IOg ；NaCl, IOg ;蒸餾水 IOOOmL ；pH7. 0-7. 2。上述的不動(dòng)桿菌的構(gòu)建方法，其中，所述的斜面培養(yǎng)基的組分及含量為磷酸氫ニ鉀(K2HPO4), 0. 075g ;硫酸鎂(MgSO4 H2O), 0. 125g ;碳酸鈣(CaCO3), 0. IOOg ;檸檬酸鐵(1% 水溶液)，0. 5mL ;檸檬酸(I %水溶液)，0. 5mL ;鑰酸(I %水溶液)，5滴；氫氧化鈉(I %水溶液)，I. 5mL ;瓊脂粉，15g ;蒸懼水，IOOOmLo上述不動(dòng)桿菌用于降解水華魚腥藻，其降解效果隨菌株濃度的増大而增加，當(dāng)菌株的濃度為35%時(shí)，對(duì)水華魚腥藻葉綠素a的抑制率達(dá)91%。


圖I為不動(dòng)桿菌Acinetobacter SSAL-8對(duì)水華魚腥藻細(xì)胞數(shù)的影響；圖2為不動(dòng)桿菌Acinetobacter SSAL-8對(duì)水華魚腥藻干重的影響；圖3為不動(dòng)桿菌Acinetobacter SSAL-8對(duì)水華魚腥藻色素吸收光譜的影響；圖4為不動(dòng)桿菌Acinetobacter SSAL-8對(duì)水華魚腥藻葉綠素a的影響。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I、不動(dòng)桿菌Acinetobacter SSAL-8的分離、純化及其鑒定不動(dòng)桿菌Acinetobacter SSAL-8的分離及純化以農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)(南方)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室黃化的水華魚腥藻液作為溶藻細(xì)菌的分離源，采用涂布平板法及分區(qū)劃線法多次純化分離，將分離獲得的25株細(xì)菌分別置于IOOmLLB液體培養(yǎng)基中，180r37°C下培養(yǎng)24h，然后分別取800 y L滴加到水華魚腥藻固體平板上，通過(guò)溶藻斑的大小考察、比較各菌的溶藻效果，最終篩選出具有較高溶藻效應(yīng)的菌株SSAL-8。經(jīng)鑒定為芽孢桿菌，命名為Acinetobacter SSAL-8。將其接入斜面培養(yǎng)基，于冰箱4°C保存；將擴(kuò)大培養(yǎng)制成的菌懸液加入到滅菌的甘油中，甘油的最終濃度為25%，放入-80°C的冰箱保藏。所述的LB液體培養(yǎng)基的組分及含量為酵母提取物，5g;胰蛋白胨，10g;NaCl，IOg ;蒸餾水 IOOOmL ；pH7. 0-7. 2。所述的斜面培養(yǎng)基的組分及含量為磷酸氫ニ鉀(K2HPO4)，0.075g;硫酸鎂(MgSO4 -H2O),0. 125g ;碳酸鈣(CaC03),0. IOOg ;檸檬酸鐵(I%水溶液)，0. 5mL ;檸檬酸(1%水溶液),0. 5mL ;鑰酸(1%水溶液)，5滴；氫氧化鈉(1%水溶液)，I. 5mL ;瓊脂粉，15g ;蒸餾水，lOOOmL。不動(dòng)桿菌Acinetobacter SSAL-8的生理生化鑒定該菌株為革蘭氏陰性不動(dòng)桿菌，桿狀，芽孢近圓形，大多中央生菌落呈近白色。使用引物7f(5' -CAGAGTTTGATCCTGGCT-3')和 1540r(5' -AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3/ )。經(jīng)序列比對(duì)表明，該菌株為不動(dòng)桿菌，將其命名為Acinetobacter SSAL-8。該不動(dòng)桿菌Acinetobacter SSAL-8已于2012年6月6日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保存號(hào)為CGMCC No. 6196。實(shí)施例2、不動(dòng)桿菌Acinetobacter SSAL-8對(duì)水華魚腥藻生長(zhǎng)效應(yīng)和光合色素的影響不動(dòng)桿菌Acinetobacter SSAL-8對(duì)水華魚腥藻生長(zhǎng)效應(yīng)的影響水華魚腥藻培養(yǎng)參照藻類生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)方法(國(guó)家環(huán)保部)，采用水生111號(hào)無(wú)氮培養(yǎng)液培養(yǎng)，pH為7. 5。培養(yǎng)溫度30±2°C，連續(xù)24h光照，光照強(qiáng)度3000±2001x，
靜置培養(yǎng)，每天定期搖動(dòng)3次。在水華魚腥藻濃度為5 X IO4 I X IO5個(gè)/mL時(shí)，分別向IOOmL藻液中加入不動(dòng)桿 菌Acinetobacter SSAL-8 (菌體濃度約為IO9個(gè)/mL)，處理濃度(v/v)梯度為5%U0%,15^^20^^25^^30%和35%,姆組樣設(shè)3個(gè)重復(fù)。制備與實(shí)驗(yàn)組相同的一系列不同配比的培養(yǎng)液(LB培養(yǎng)液水生111號(hào)無(wú)氮培養(yǎng)液)，分別用于培養(yǎng)不動(dòng)桿菌AcinetobacterSSAL-8和水華魚腥藻形成對(duì)照組。以細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定藻體細(xì)胞數(shù)量、并測(cè)定水華魚腥藻干重。細(xì)胞計(jì)數(shù)方法從接種計(jì)時(shí)起，每隔24h取樣，用計(jì)數(shù)框進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。用移液器取經(jīng)過(guò)超聲波破碎儀打碎過(guò)的藻液0. ImL于計(jì)數(shù)框中，在低倍鏡下觀察，放大倍數(shù)40X 10，隨機(jī)取五個(gè)視野，數(shù)出所看到的細(xì)胞數(shù)，取其平均值。N= IOXaXSitVSft ;a-每個(gè)視野內(nèi)細(xì)胞平均值；Si+-計(jì)數(shù)框面積；Sft-視野面積；N-每mL中細(xì)胞個(gè)數(shù)。水華魚腥藻干重測(cè)定方法取定量的藻液，離心得藻，加入稱量皿，在80°C烘至恒重。不同濃度的不動(dòng)桿菌Acinetobacter SSAL-8對(duì)水華魚腥藻的細(xì)胞數(shù)的影響的測(cè)定結(jié)果如圖I所示，結(jié)果表明水華魚腥藻細(xì)胞的去除效果與不動(dòng)桿菌AcinetobacterSSAL-8濃度呈現(xiàn)出一定的相關(guān)性，即隨著不動(dòng)桿菌Acinetobacter SSAL-8濃度的增長(zhǎng)，對(duì)水華魚腥藻細(xì)胞的去除作用越強(qiáng)。當(dāng)不動(dòng)桿菌Acinetobacter SSAL-8菌體濃度為5 %、10%、15%、20%、25%、30%和35%時(shí)，培養(yǎng)24h對(duì)水華魚腥藻細(xì)胞的去除率分別為2%、5%、11%、15%、18%、21%和 24%，培養(yǎng)16811后分別變?yōu)?%、16%、25%、28%、29%、32%和34%，與對(duì)照相比，呈現(xiàn)顯著差異(P < 0. 05)。不同濃度的不動(dòng)桿菌Acinetobacter SSAL-8對(duì)水華魚腥藻的干重的影響的測(cè)定結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明純LB液體培養(yǎng)基的投入對(duì)水華魚腥藻干重亦會(huì)產(chǎn)生影響，當(dāng)LB液體培養(yǎng)基濃度依次為5%、10%、15%、20%、25%、30%和35%時(shí)，培養(yǎng)168h后的水華魚腥藻干重相應(yīng)增加，分別為 15. 90、16. 40、16. 77、17. 74、18. 11、19. 38 和 22. 04mg/mL。通過(guò)排除LB液體培養(yǎng)基本身對(duì)水華魚腥藻生長(zhǎng)的影響因素，可見，隨著菌體濃度從5%依次升至35 %，不動(dòng)桿菌Acinetobacter SSAL-8對(duì)水華魚腥藻干重的抑制率依次為4 %、15 %、25%、29%、35%、36%和 38%。不動(dòng)桿菌Acinetobacter SSAL-8對(duì)水華魚腥藻光合色素的影響以Bhandari and Sharma法連續(xù)掃描400 750nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)色素吸收光譜,并對(duì)水華魚腥藻葉綠素a含量進(jìn)行測(cè)定。葉綠素a的提取測(cè)定取水華魚腥藻藻液IOmL過(guò)0. 45 的混合纖維素膜，將帶藻細(xì)胞的膜冷凍過(guò)夜，取出后迅速用SmL熱こ醇于熱水浴中萃取2min，將萃取液超聲破碎5-20min后，于暗處?kù)o置2_6h，離心(5000r/min，4°C ) 5min后取上清液3. 5mL置于比色皿中，于665nm和750nm處測(cè)吸光值，計(jì)算酸化前的光密度值(E665b=Abs665b-Abs750b),然后滴加200 ii L的lmol/L鹽酸酸化,5min后于波長(zhǎng)665nm和750nm處再測(cè)吸光值，計(jì)算酸化后的光密度值(E665a = Abs665a-Abs75J。采用熱こ醇為萃取溶剤，A =11. 5，K = 2. 43，比色皿光程為Icm
27.9 X (L6656 - tM5a JXV不同濃度的不動(dòng)桿菌Acinetobacter SSAL-8對(duì)水華魚腥藻色素吸收光譜的影響的測(cè)定結(jié)果如圖3所示,結(jié)果表明不同濃度的不動(dòng)桿菌Acinetobacter SSAL-8作用于水華魚腥藻時(shí)，其色素光譜吸收曲線變化差異較大。高濃度(> 25% )處理下光譜吸收曲線已非常不明顯，各處峰值模糊甚微，表明Acinetobacter SSAL-8已大大地抑制了藻體色素的種類和含量。中低濃度(5 25%)處理下，隨著菌體濃度的増加，各色素光譜吸收峰值均有降低，這與不動(dòng)桿菌Acinetobacter SSAL-8對(duì)藻體細(xì)胞數(shù)以及干重的影響相一致,譜圖 充分體現(xiàn)溶藻菌的濃度相關(guān)性。葉綠素a是光能的捕獲者，也是葉綠體膜內(nèi)光傳導(dǎo)者，因此葉綠素a含量的多少，充分反映出藻體光合成能力的強(qiáng)弱。不同濃度的不動(dòng)桿菌Acinetobacter SSAL-8對(duì)水華魚腥藻葉綠素a的影響的測(cè)定結(jié)果如圖4所示(A、B、C、D、E、F、G、H分別代表不動(dòng)桿菌 Acinetobacter SSAL-8 濃度為 0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35% )，結(jié)果表明溶藻菌對(duì)葉綠素a的抑制作用隨著菌體濃度的增加而增強(qiáng)。菌體濃度為
20%、25%、30%和35%，對(duì)不動(dòng)桿菌Acinetobacter SSAL-8而言，24h對(duì)葉綠素a的抑制率分別為 6%、12%、21%、29%、30%、41%和 43%，168h 后依次升至 61%,68%,82%,90%,87%、90%和 91%。
權(quán)利要求
1.一株不動(dòng)桿菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示,命名為Acinetobacter SSAL-8。
2.如權(quán)利要求I所述的不動(dòng)桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟 A、以黃化的水華魚腥藻液作為溶藻細(xì)菌的分離源，采用涂布平板法及分區(qū)劃線法多次純化分離得到25株溶藻細(xì)菌； B、將分離獲得的25株溶藻細(xì)菌分別置于IOOmLLB液體培養(yǎng)基中，在180r下培養(yǎng)24h ； C、將經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的25株溶藻細(xì)菌分別取800y L滴加到水華魚腥藻固體平板上，通過(guò)溶藻斑的大小考察、比較各菌的溶藻效果，最終篩選出具有較高溶藻效應(yīng)的菌株SSAL-8，經(jīng)鑒定為不動(dòng)桿菌，命名為Acinetobacter SSAL-8 ; D、將菌株AcinetobacterSSAL-8接入斜面培養(yǎng)基，于4°C擴(kuò)大培養(yǎng)制成菌懸液； E、將菌懸液加入到滅菌的甘油中，甘油的最終濃度為25%，放入_80°C的冰箱保藏。
3.如權(quán)利要求2所述的不動(dòng)桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于所述的LB液體培養(yǎng)基的組分及含量為:酵母提取物，5g ;胰蛋白胨，IOg ；NaCl, IOg ;蒸餾水IOOOmL ；pH7. 0-7. 2。
4.如權(quán)利要求2所述的不動(dòng)桿菌的構(gòu)建方法，其特征在干所述的斜面培養(yǎng)基的組分及含量為=K2HPO4,0. 075g ；MgS04 H20,0. 125g ；CaC03,0. IOOg ;檸檬酸鐵的 I %水溶液，0.5mL;檸檬酸的1%水溶液，0. 5mL;鑰酸的I %水溶液，5滴；氫氧化鈉的I %水溶液，1.5mL ;瓊脂粉，15g ;蒸懼水，IOOOmLo
5.如權(quán)利要求I所述的不動(dòng)桿菌的應(yīng)用，其特征在于所述的不動(dòng)桿菌用于降解水華魚腥藻，其降解效果隨菌株濃度的増大而增加，當(dāng)菌株的濃度為35%時(shí)，對(duì)水華魚腥藻葉綠素a的抑制率達(dá)91 %。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株不動(dòng)桿菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。其中的不動(dòng)桿菌從黃化的水華魚腥藻液中分離篩選并獲得，該不動(dòng)桿菌的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，命名為Acinetobacter SSAL-8。該不動(dòng)桿菌可用于降解水華魚腥藻，其降解效果隨菌株濃度的增大而增加，當(dāng)菌株的濃度為35％時(shí)，對(duì)水華魚腥藻葉綠素a的抑制率達(dá)91％。
文檔編號(hào)C02F3/34GK102851236SQ20121027176
公開日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月1日
發(fā)明者沈健英, 孫秀敏 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)