鮑曼不動(dòng)桿菌膜蛋白a1s_0851作為抗原的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鮑曼不動(dòng)桿菌膜蛋白A1S_0851作為抗 原的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacterbaumannii)屬于奈瑟氏菌科，不動(dòng)桿菌屬，是一種 不發(fā)酵糖類、氧化酶陰性、不能運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陰性桿菌。鮑曼不動(dòng)桿菌廣泛存在于自然界的 水及土壤、醫(yī)院環(huán)境及人體皮膚、呼吸道、消化道和泌尿生殖道中，為條件致病菌。鮑曼不動(dòng) 桿菌對(duì)溫、熱、紫外線及化學(xué)消毒劑均有較強(qiáng)的抵抗力，常規(guī)的消毒劑只能抑制其生長(zhǎng)，不 能將其殺滅，因此，鮑曼不動(dòng)桿菌常藏匿于各種醫(yī)療器械及醫(yī)院病房角落，對(duì)于重癥患者， 如老年患者、危重疾病及機(jī)體抵抗力弱的患者，以及使用各種侵入性操作和長(zhǎng)期使用廣譜 抗生素治療的患者來(lái)說(shuō)，鮑曼不動(dòng)桿菌可成為重要的致病菌。臨床上，其主要引起肺部感 染，也可引發(fā)敗血癥、嚴(yán)重軟組織或傷口感染、插管相關(guān)感染、尿路感染、菌血癥和繼發(fā)性腦 膜炎等癥狀。醫(yī)院感染的科室分布以重癥監(jiān)護(hù)室為最多，其次為呼吸內(nèi)科。
[0003] 鮑曼不動(dòng)桿菌感染有著悠久的歷史，從20世紀(jì)八十年代起就有了鮑曼不動(dòng)桿菌 感染爆發(fā)的報(bào)道，而自美國(guó)1991年報(bào)道了耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌（CRAB)菌株后，各國(guó)均 陸續(xù)報(bào)道了耐碳青霉烯鮑曼不動(dòng)桿菌，且據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，其比例逐年升高。鮑曼不動(dòng)桿菌的感 染與耐藥已經(jīng)成為一個(gè)世界性難題，常呈多重耐藥和泛耐藥，且耐藥菌在特定人群中常引 起大規(guī)模爆發(fā)流行，感染患者的病死率常高達(dá)75%。2010年中國(guó)耐藥檢測(cè)的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示 不動(dòng)桿菌對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦耐藥率為30. 7%，對(duì)米諾環(huán)素耐藥率為31. 2%，其他藥物如 亞胺培南、美羅培南、頭孢吡肟、頭孢他啶、頭孢西丁、哌拉西林/他唑巴坦、氨芐西/舒巴 坦、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星等耐藥率均在50%以上。由于耐藥性及耐藥機(jī)制復(fù)雜，鮑 曼不動(dòng)桿菌的耐藥菌株引發(fā)的感染已經(jīng)成為臨床上非常棘手的問(wèn)題。普通抗生素對(duì)它的治 療作用已不明顯，鮑曼不動(dòng)桿菌即將面臨無(wú)抗生素可治的境地，采用疫苗來(lái)預(yù)防和控制鮑 曼不動(dòng)桿菌的感染，特別是對(duì)抗高度耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的感染已成為刻不容緩的任務(wù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種鮑曼不動(dòng)桿菌膜蛋白A1S_0851作為抗原 的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明所述技術(shù)方案如下：
[0006] 1、鮑曼不動(dòng)桿菌膜蛋白A1S_0851作為抗原的應(yīng)用，所述膜蛋白A1S_0851的氨基 酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0007] 2、鮑曼不動(dòng)桿菌重組蛋白A1S_0851在制備疫苗中的應(yīng)用，所述重組蛋白 A1S_0851的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0008] 3、由鮑曼不動(dòng)桿菌重組蛋白A1S_0851制備得到的鮑曼不動(dòng)桿菌疫苗，所述重組 蛋白A1S_0851的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0009] 優(yōu)選的，所述疫苗還包括佐劑，所述佐劑為終濃度13. 5mg/mL的氫氧化鋁。
[0010] 優(yōu)選的，所述疫苗還包括稀釋液，所述稀釋液pH值為6. 0,由濃度為10mM的組氨 酸、質(zhì)量分?jǐn)?shù)〇. 9%的NaCl和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0. 01 %的泊洛沙姆188組成。
[0011] 4、上述疫苗的制備方法，包括如下步驟：
[0012] (1)用pH值為6. 0的疫苗稀釋液溶解濃度為30mg/mL的氫氧化鋁佐齊IJ，得溶液A; 所述氫氧化鋁佐劑與疫苗稀釋液的體積比為9:1;
[0013] (2)用步驟（1)所述疫苗稀釋液稀釋重組蛋白A1S_0851，得蛋白濃度為0.3yg/ yL的溶液B;
[0014] (3)取等體積的溶液A和溶液B于4~32°C條件下進(jìn)行吸附，即得疫苗。
[0015] 5、上述疫苗在制備預(yù)防或治療鮑曼不動(dòng)桿菌感染的藥物中的應(yīng)用。
[0016] 6、鮑曼不動(dòng)桿菌重組蛋白A1S_0851作為抗原免疫動(dòng)物得到的抗體，所述重組蛋 白A1S_0851的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0017] 優(yōu)選的，所述抗體為免疫小鼠或者兔得到的IgG抗體。
[0018] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明通過(guò)分析鮑曼不動(dòng)桿菌基因信息，選取鮑曼不動(dòng) 桿菌的膜蛋白A1S_0851作為疫苗的候選抗原，通過(guò)基因工程的手段，選用pEGX-6P-2融合 蛋白表達(dá)載體對(duì)A1S_0851抗原進(jìn)行克隆、表達(dá)，并用表達(dá)的重組蛋白免疫小鼠進(jìn)行抗原性 評(píng)價(jià)以及抗鮑曼不動(dòng)桿菌感染的免疫保護(hù)性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明鮑曼不動(dòng)桿菌A1S_0851基因 編碼的蛋白具有抗鮑曼不動(dòng)桿菌感染的效果，是理想的鮑曼不動(dòng)桿菌疫苗抗原。與全菌滅 活疫苗相比，由于全菌滅活疫苗外膜復(fù)合物成分比較復(fù)雜，可能含有效的保護(hù)性抗原成分， 也可能存在與免疫保護(hù)無(wú)關(guān)或者副作用的成分，且制備過(guò)程難于標(biāo)準(zhǔn)化，而基因工程亞單 位疫苗抗原成分明確，效果明確，副作用小，安全性高，是一種理想的疫苗形式。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0020] 圖1鮑曼不動(dòng)桿菌A1S_0851基因PCR擴(kuò)增凝膠電泳結(jié)果；其中，M泳道為marker， 1泳道為A1S_0851基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0021] 圖2pGEX-6p-2/AlS_0851重組質(zhì)粒凝膠電泳鑒定結(jié)果；其中，1~4泳道為重組質(zhì) 粒，M泳道為marker，其中泳道3為鑒定正確的重組質(zhì)粒。
[0022] 圖3重組工程菌pGEX-6P-2-AlS_0851/XL-lblue誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白A1S_0851結(jié) 果；其中，M泳道為marker，1~3泳道依次為16、25和30°C條件下IPTG誘導(dǎo)處理后，破碎 菌體并離心所得上清液中的重組蛋白A1S_0851 ;4~6則依次為16、25和30°C條件下IPTG 誘導(dǎo)處理后，破碎菌體并離心所得沉淀中的重組蛋白A1S_0851。
[0023] 圖4重組工程菌pGEX-6P-2-AlS_0851/XL-lblue發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線圖； 整個(gè)生長(zhǎng)曲線比較標(biāo)準(zhǔn)，前期細(xì)菌生長(zhǎng)較快，后期誘導(dǎo)時(shí)曲線較平穩(wěn)。
[0024] 圖5重組工程菌pGEX-6P-2-AlS_0851/XL-lblue發(fā)酵獲得的目的蛋白鑒定結(jié)果； 各泳道從左到右依次為maker、IPTG誘導(dǎo)lh、2h、3h、4h;由圖可知，經(jīng)過(guò)工程菌發(fā)酵成功獲 得重組A1S_0851蛋白。
[0025] 圖6對(duì)發(fā)酵獲得的重組蛋白A1S_0851經(jīng)GST瓊脂糖凝膠4B親和層析的純化結(jié)果 圖，結(jié)果顯示，目的蛋白純度在95%以上，目的蛋白分子量在33kDa左右，與預(yù)期大小相符 合。M:蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，泳道1 :重組蛋白A1S_0851與GST融合蛋白，泳道2為純化后經(jīng)酶切后 的重組蛋白A1S_0851。
[0026] 圖7重組蛋白A1S_0851Q HP層析圖。
[0027] 圖8為重組蛋白A1S_0851經(jīng)QHP層析后SDS-PAGE結(jié)果圖，圖中，泳道1:標(biāo)準(zhǔn)蛋 白；泳道2 :GST親和PP酶切后洗脫樣品；泳道3:QHP流穿樣品；泳道4:QHP層析后樣品。
[0028] 圖9為重組蛋白A1S_0851QHP層析去內(nèi)毒素后SDS-PAGE結(jié)果圖，圖中，泳道1: 標(biāo)準(zhǔn)蛋白；泳道2:QHP層析去內(nèi)毒素后樣品。
[0029] 圖10鮑曼不動(dòng)桿菌攻毒后，不同濃度菌液的小鼠生存率圖。
[0030] 圖11重組蛋白A1S_0851免疫后第14天，ELISA檢測(cè)小鼠免疫后疫苗抗原特異性 IgG體液應(yīng)答水平，實(shí)驗(yàn)組滴度與氫氧化鋁佐劑對(duì)照組及疫苗稀釋液對(duì)照組滴度相比，均有 顯著差異（P〈〇.〇l)。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0032] 鮑曼不動(dòng)桿菌ATCC國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株ATCC17978,由美國(guó)ATCC提供；引物由TaKaRa 公司合成；宿主菌株XLl-blue大腸桿菌購(gòu)于美國(guó)安捷倫公司；質(zhì)粒pGEX-6p-2購(gòu)于美國(guó) GEHealthcare公司；primeSTARHSDNA聚合酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（marker)、限制性內(nèi)切 酶BamHI和NotI、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)（marker)、DNA連接酶均購(gòu)于大連TakaRa公司；細(xì)菌 基因組提取試劑盒購(gòu)于天根公司；質(zhì)粒提取試劑盒和凝膠回收試劑盒購(gòu)于美國(guó)Omega公 司；氨芐西林、卡那霉素購(gòu)自華北制藥股份有限公司；谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司；高壓勾質(zhì)機(jī)APV-1000購(gòu)自丹麥AnInvernsysGroup;BALB/C小鼠購(gòu)自 北京華阜康公司；氫氧化鋁佐劑購(gòu)自美國(guó)GENERALCHEMICAL公司；藥用級(jí)組氨酸購(gòu)自美國(guó) Merck公司；藥用級(jí)泊洛沙姆188購(gòu)自美國(guó)Merck公司，無(wú)熱原。
[0033] 試劑配制：
[0034] 5X蛋白質(zhì)上樣緩沖液由以下組分組成：PH6.8,250mMTris-HCl10% (W/V)，SDS 0? 5% (W/V)，溴酚藍(lán)50% (