用于檢測猴痘病毒的nasba試劑盒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測猴痘病毒的NASBA試劑盒及其應用。本發(fā)明所提供的NASBA試劑盒中含有用于檢測猴痘病毒的組合物，所述組合物由一個引物對和一個探針組成；所述引物對由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成；所述探針的序列為序列表中序列3。利用本發(fā)明所提供的NASBA試劑盒對猴痘病毒進行檢測，具有操作簡便，高效、快速、特異的優(yōu)點。本發(fā)明可快速篩查猴痘病毒，對口岸輸入性疾病篩查具有重要意義，為防御疾病的傳入做好技術支撐和戰(zhàn)略儲備，滿足當前衛(wèi)生檢疫的需求。
【專利說明】用于檢測猴痘病毒的NASBA試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，涉及一種用于檢測猴痘病毒的NASBA試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002]猴痘病毒是一種雙鏈DNA病毒,與天花病毒同屬痘病毒科，感染的癥狀與天花相似，如發(fā)熱、頭痛、淋巴結腫大、咳嗽和全身極度疼痛，俗稱“猴天花”，為未輸入我國的危險病毒之一，可通過直接接觸患者或者被感染的動物，或通過患者的體液傳播。
[0003]猴痘病毒于1958年首次在丹麥哥本哈根的實驗室來自非洲的猴子中發(fā)現，1970年剛果報道了世界上首例猴痘人間病例，此后尼日利亞、喀麥隆等非洲國家相繼有此病例報道。1978年天花消滅后，WHO制定了天花消滅后的監(jiān)測規(guī)劃，將猴痘作為一種重要疾病列入其中。隨后WHO專家在非洲猴痘流行區(qū)進行調查，在猴子體內檢出了猴痘病毒，并檢測到猴痘病毒抗體，證明猴子為猴痘病毒的宿主；同時在嚙齒類動物的調查中發(fā)現，一只松鼠有皮膚破潰樣癥狀，并分離出了猴痘病毒，因此松鼠也是猴痘病毒的中間宿主。2003年美國威斯康辛州爆發(fā)了一次猴痘疫情，造成了 82人感染，其傳染源是一只非洲進口的寵物土撥鼠，此次疫情感染的猴痘病毒屬于毒力較弱的西非株，因此未造成人員死亡。 目前共發(fā)現兩種病毒株，另外一種剛果盆地株毒性較強，幾乎是致命的。從猴痘在人間流行情況來看，猴痘的致病力和傳染性均比天花要弱，但是猴痘易感多種不同的動物，分布范圍廣，易造成流行，且一旦病毒在人體內發(fā)生重組變異，出現毒力類似天花或者超過天花的毒株，后果將不堪設想。因此研究猴痘病毒的檢測技術具有重要的意義。
[0004]NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification)即核酸序列依賴性擴增技術，主要用來擴增RNA，是由一對特異性的引物介導的、連續(xù)均一的、體外核酸序列等溫擴增反應過程。反應在41°C進行，在3種酶的協(xié)同作用下可在2h內將模板RNA擴增約109_12倍，且不需特殊儀器。該技術具有操作簡便，特異性強，敏感性高，快速，高通量等優(yōu)點，目前已經廣泛應用于人類與動物的多種病毒性疾病的檢測，具有良好的應用前景。在禽流感，新城疫，豬傳染性胃腸炎，口蹄疫等疾病的檢測中均表現出了很高的敏感性和特異性。
[0005]NASBA擴增反應技術是由一對特異性的引物引導的等溫條件下的核苷酸序列的體外擴增，該反應由三種酶控制完成:禽源成髓細胞瘤逆轉錄酶(AMV逆轉錄酶)、RNA酶H和T7RNA聚合酶。反應體系除了以上三種酶外還包括:核糖核苷三磷酸、脫氧核糖核苷三磷酸、一對特殊引物及各種緩沖液等。引物Pl長約45個堿基，其3'末端大約20個堿基對與模板的3'末端互補，5'末端含有能被T7RNA聚合酶識別的啟動子序列；引物P2大約20個堿基長，其序列與模板的5,末端一致。
[0006]整個反應分為兩相:在非循環(huán)相，引物Pl與模板RNA結合，在AMV逆轉錄酶作用下形成RNA =DNA雜交鏈，隨后RNaseH水解掉RNA =DNA雜交鏈上的RNA鏈，只留下一條單鏈DNA。然后引物P2與這條DNA鏈的Y末端退火，在AMV逆轉錄酶催化作用下合成第二條DNA鏈。T7RNA聚合酶識別雙鏈DNA中的啟動子區(qū)域，催化DNA轉錄為RNA，在此由每一分子DNA模板可產生100拷貝的RNA。新合成的RNA進人循環(huán)相，在循環(huán)相將成為反轉錄的模板，首先與引物P2結合，由AMV逆轉錄酶作用下催化合成一條DNA鏈，形成RNA:DNA雜交分子，RNaseH隨后水解掉RNA，留下一條單鏈DNA，引物Pl退火，逆轉錄酶再催化合成一條新的含有T7RNA聚合酶啟動子的DNA片段，T7RNA聚合酶再以此DNA為模板合成更多拷貝的RNA，如此循環(huán)反復，使RNA拷貝數被不斷放大。該技術非常適合于單鏈RNA的擴增。
[0007]分子信標技術(NASBA-Beacon)是將NASBA技術和實時分子燈塔技術相結合,具有更加方便、快捷、敏感、不易被污染等優(yōu)點。分子燈塔是具有“發(fā)夾”樣結構的單鏈寡核苷酸探針，一般為含20~30個核苷酸，其中環(huán)狀序列是與目標鏈互補的探針。當無靶序列存在時，莖部的2條核苷酸鏈互補，末端分別與熒光素(5'端)和淬火物質(3'端)結合，莖部的雙鏈互補結構使末端的熒光素和淬火物質緊靠在一起，因熒光素共振能量轉移作用而使熒光被吸收，這樣熒光素就不能發(fā)光，此時便檢測不到熒光信號；當有靶序列存在時，分子信標的環(huán)序列與靶序列特異性結合，隨著環(huán)狀序列打開，莖部的雙鏈結構也打開，熒光素共振能量轉移作用不能得到發(fā)揮，熒光素和淬火物質分離使得此時能夠檢測到熒光。熒光檢測技術與NASBA技術都是在低溫條件下反應，所以這兩項技術可以完美的結合。該檢測方法操作簡單且省時，可以自動化操作，減少了攜帶污染，適合于分析高通量樣本 。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明的一個目的是提供一種用于檢測猴痘病毒的組合物。
[0009]本發(fā)明所提供的用于檢測猴痘病毒的組合物，由一個引物對和一個探針組成；所述引物對由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成；所述探針的序列為序列表中序列3。
[0010]其中，序列I共由51個核苷酸組成，第1-31位為可被T7RNA聚合酶識別的啟動子序列，第32-51位為與猴痘病毒全基因組(GenBank:AF380138)中的保守序列(GenBank:AF380138的第48332-48780位，序列4)的3’端互補的特異性序列。序列2共由26個核苷酸組成，為與猴痘病毒全基因組(GenBank:AF380138)中的保守序列(GenBank:AF380138的第48332-48780位，序列4)的5’端一致的特異性序列。
[0011]用于檢測猴痘病毒的所述引物對或所述探針也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0012]在本發(fā)明中，所述探針的5’端標記有熒光報告基團FAM，3’端標記有熒光淬滅基團 TAMRA。
[0013]在所述組合物中，組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子，以及所述探針的摩爾比為2:2:1 ;在所述引物對中，組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子的摩爾比為1:1。
[0014]本發(fā)明的再一個目的是提供一種用于檢測猴痘病毒的NASBA試劑盒。
[0015]本發(fā)明所提供的用于檢測猴痘病毒的NASBA試劑盒，可為如下(a)或(b):
[0016](a)含有所述組合物，以及如下物質:NTP、dNTP、T7RNA聚合酶、AMV逆轉錄酶、核糖核酸酶H ；
[0017](b)含有所述引物對，以及如下物質:NTP、dNTP、T7RNA聚合酶、AMV逆轉錄酶、核糖核酸酶H。
[0018]在本發(fā)明的一個實施例中，所述NASBA試劑盒中含有反應液I和酶混合液II ；
[0019]所述反應液I的溶劑為水，溶質及濃度如下:NTP0.5mmol/L, dNTP0.02mmol/L,Tris-HC150mmol/L,氯化鎂 12.5mmol/L, 二硫蘇糖醇 10mmol/L,氯化鉀 87.5mmol/L,組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子各0.5 μ mol/L ；
[0020]所述酶混合液II的溶劑為水(如雙蒸水)，溶質及濃度如下:T7RNA聚合酶8U/ μ L，AMV逆轉錄酶1.6U/ μ L，核糖核酸酶H0.04U/ μ L，RNA酶抑制劑1.2U/ μ L，牛血清白蛋白
0.5 μ g/ μ L,所述探針 I μ mol/L。
[0021]進一步，所述NASBA試劑盒中還可含有作為陽性對照的pGSI_MPV質粒。
[0022]所述pGS1-MPV質粒是在pGSI質粒的多克隆位點SmaI酶切位點處正向插入序列表中序列4后得到的重組質粒。
[0023] 其中，序列4為猴痘病毒全基因組(GenBank:AF380138)中的保守序列(GenBank:AF380138 的第 48332-48780 位)。
[0024]所述組合物或所述引物對或所述探針或所述NASBA試劑盒在檢測或輔助檢測猴痘病毒中的非診斷目的應用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0025]在所述應用中，按照如下步驟進行反應:先將所述反應液I和所述待測樣品混合，95°C放置10分鐘，然后迅速將反應體系降溫至0-4°C，再向反應體系中加入所述酶混合液II，41°C放置90分鐘；在反應過程中，所述反應液1、所述酶混合液II和所述待測樣品的配比為 20 μ L:5 μ L:1 μ L。
[0026]在所述應用中，所述待測樣品來自離體的組織或器官。在本發(fā)明的一個實施例中，所述待測樣品為雙鏈DNA樣品。
[0027]在所述應用中，利用所述組合物或所述引物對或所述探針或所述NASBA試劑盒對所述待測樣品進行反應后，可按照如下(I)或(II)的方法確定所述待測樣品中是否含有猴
痘病毒:
[0028](I)根據反應所得RNA擴增產物的大小按照如下方法確定所述待測樣品中是否含有猴痘病毒:若所述RNA擴增產物中含有大小為269nt的RNA片段，則所述待測樣品中含有或候選含有猴痘病毒；若所述RNA擴增產物中不含有大小為269nt的RNA片段，則所述待測樣品中不含有或候選不含有猴痘病毒。
[0029](II)利用所述組合物或所述引物對或所述探針或所述NASBA試劑盒對所述待測樣品進行反應后，在紫外下觀察含有所述待測樣品的反應液的顏色，若含有所述待測樣品的反應液產生綠色突光，則所述待測樣品中含有或候選含有猴痘病毒；若含有所述待測樣品的反應液不產生綠色熒光，則所述待測樣品中不含有或候選不含有猴痘病毒。
[0030]進一步，以上(I)中，所述大小為269nt的RNA片段的核苷酸序列如序列表中序列5所示。
[0031]在所述應用的反應過程中，若所述待測樣品中含有猴痘病毒的基因組雙鏈DNAjP么，在95°C時雙鏈DNA將發(fā)生變性解鏈，冰浴降溫(0-4°C)后在所述反應液I中的所述引物對(序列I和序列2)，以及所述酶混合液II中的所述AMV逆轉錄酶和所述T7RNA聚合酶的作用下，反轉錄生成RNA ;接著以反轉錄所生成的RNA為模板進行NASBA擴增，從而得到所述RNA擴增產物。
[0032]利用本發(fā)明所提供的NASBA試劑盒對猴痘病毒進行檢測，具有操作簡便，高效、快速、特異的優(yōu)點。本發(fā)明所設計的引物及探針只針對猴痘病毒及其亞種，而不會把其他痘病毒或其他物種擴增出來，純度高，易保存。引物與整個genbank數據庫進行BLAST檢索，和其它物種的核酸序列無同源，保證了檢測方法的特異性。該方法的建立，對樣本的檢測只需1.5小時左右即可完成，可快速篩查猴痘病毒，對口岸輸入性疾病篩查具有重要意義，為防御疾病的傳入做好技術支撐和戰(zhàn)略儲備，滿足當前衛(wèi)生檢疫的需求?！緦＠綀D】

【附圖說明】[0033]圖1為反應液I中鎂離子濃度的優(yōu)化實驗結果。其中，泳道M為DNA分子量標準DL2000 ;泳道2為氯化鎂1.5μL ;泳道3為氯化鎂1.75μL ;泳道4為氯化鎂2.0μL ;泳道5為氯化鎂2.25μL ;泳道6為氯化鎂2.5μL ;泳道7為氯化鎂2:75μL ;泳道8為陰性對照。[0034]圖2為反應液I中鉀離子濃度優(yōu)化實驗結果。其中，泳道M為DNA分子量標準DL2000 ;泳道2為氯化鉀3.75μL ;泳道3為氯化鉀3.5μL ;泳道4為氯化鉀3.25μL ;泳道5為氯化鉀3.0μL ;泳道6為氯化鉀2.75μL ;泳道7為氯化鉀2.5μL ;泳道8為陰性對照。[0035]圖3為不同的溫度下擴增的電泳結果。其中，泳道M為DNA分子量標準DL2000 ；泳道2為42°C ;泳道3為41°C ;泳道4為40°C ;泳道5為39°C ;泳道6為38°C ;泳道7為370C ;泳道8為陰性對照。[0036]圖4為檢測猴痘病毒的NASBA試劑盒的特異性檢測結果(瓊脂糖凝膠電泳)。其中，泳道M為DNA分子量標準DL2000 ;泳道2為陽性對照質粒(pGS1-MPV質粒)；泳道3為雞痘疫苗；泳道4為牛痘疫苗；泳道5為羊痘疫苗；泳道6為水痘疫苗；泳道7為陰性對照。[0037]圖5為檢測猴痘病毒的NASBA試劑盒的特異性檢測結果(紫外觀察)。其中，I為陽性對照質粒(pGS1-MPV質粒);2為雞痘疫苗；3為牛痘疫苗；4為羊痘疫苗；5為水痘疫苗；6為陰性對照。[0038]圖6為檢測猴痘病毒的NASBA試劑盒的靈敏度檢測結果。其中，泳道I為DNA分子量標準DL2000 ;泳道2為2.76X IO7拷貝數陽性對照質粒(pGS1-MPV質粒)；泳道3為2.76X IO6拷貝數陽性對照質粒(pGS1-MPV質粒)；泳道4為2.76X IO5拷貝數陽性對照質粒(pGS1-MPV質粒)；泳道5為2.76X IO4拷貝數陽性對照質粒(pGS1-MPV質粒)；泳道6為2.76 X IO3拷貝數陽性對照質粒(pGS1-MPV質粒);泳道7為2.76 X IO2拷貝數陽性對照質粒(pGS1-MPV質粒)；泳道8為陰性對照。[0039]圖7為猴痘病毒的NASBA試劑盒用于檢測臨床樣本的結果。其中，泳道I為DNA分子量標準DL2000 ;泳道2為陽性對照質粒(pGS1-MPV質粒)，泳道3_15為臨床發(fā)熱病人樣本抽提的DNA，泳道16為陰性對照。【具體實施方式】[0040]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。[0041]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。[0042]羊痘疫苗、雞痘疫苗、牛痘疫苗:購自杭州吉創(chuàng)生物科技有限公司；[0043]水痘疫苗:購自長春祈健生物制品有限公司。[0044]pGSI質粒:購自北京中美泰和生物技術有限公司。[0045]T7RNA聚合酶(公司名稱:Thermo Fisher目錄號:EP0112)、AMV逆轉錄酶(公司名稱=Promega目錄號:M5108)、核糖核酸酶H (RNase H)(公司名稱:2150A目錄號:2150A)、RNA酶抑制劑:(公司名稱=Thermo Fisher目錄號:E00382)。
[0046]實施例1、檢測猴痘病毒的NASBA試劑盒的制備及反應體系的建立
[0047]一、檢測猴痘病毒的NASBA試劑盒的制備
[0048]1、引物和探針的設計
[0049]根據猴痘病毒全基因組(GenBank:AF380138)中的保守序列(GenBank:AF380138的第48332-48780位，序列4)，設計一組引物及探針，分別是正向引物P1、反向引物P2及探針，引物及探針基因序列如下:
[0050]引物Pl (序列I):
[0051 ] 5，-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCAGCATCACCTATAGATGAC-3，
[0052]引物P2 (序列 2):5’ -TACAGAGCTTTATTAACTTCTCGCTT-3’
[0053]探針(序列3 ): 5 ’ -CATCGGAACGACGAACCACCAGAGGATGACGATG-3，
[0054]其中，引物Pl (序列I)的第32-51位為與猴痘病毒保守序列的3’端(序列4的第396-415位)互補的特異性序列，第1-31位為可被T7RNA聚合酶識別的啟動子序列。引物P2 (序列2)為與猴痘病毒保守序列的5’端(序列4的第147-172位)一致的特異性序列。探針(序列3)中兩處下劃線部分序列反向互補，中間無下劃線部分序列為序列4的第346-369位的反向互補序列， 可與NASBA擴增產物互補。
[0055]其中，探針的5’端標記有熒光報告基團FAM，3’端標記有熒光淬滅基團TAMRA。
[0056]2、反應液I和酶混合液11
[0057]利用步驟I設計的引物對和探針配制反應液I和酶混合液II，同時制備陽性對照質粒，從而得到用于檢測猴痘病毒的NASBA試劑盒。
[0058]反應液I 組成如下:2.5mmol/L NTP4 μ L，0.2mmol/L dNTP2 μ L, 400mmol/LTris-HC12.5 μ L, IOOmmoI/L 氯化鎂 2.5 μ L，IOOmmoI/L DTT (二硫蘇糖醇)2 μ L, 500mmol/L氯化鉀3.5 μ L，10 μ M正反向引物各I μ L，雙蒸水補充至20 μ L。各物質的溶劑均為雙蒸水。
[0059]酶混合液II組成如下:20U/y L T7RNA聚合酶2.0 μ L，5U/μ L AMV逆轉錄酶1.6μ L，20U/y L 核糖核酸酶 H (RNase H) 0.01 μ L,40U/y L RiboLock RNase Inhibitor(RNA 酶抑制劑)0.15 μ L，10 μ g/μ L 牛血清白蛋白(BSA)0.25 μ L，5 μ mol/L 探針 I μ L。各物質的溶劑均為雙蒸水。
[0060]陽性對照質粒:pGS1-MPV。pGS1-MPV是在pGSI質粒的多克隆位點SmaI酶切位點處正向插入序列表中序列4所示DNA片段后得到的重組質粒。
[0061]二、檢測猴痘病毒的NASBA試劑盒的使用
[0062]操作方法:將反應液I混勻，取20 μ I加入PCR管中，加入待測樣品I μ I，放入PCR儀，95°C放置10分鐘，迅速放入冰浴中放置5分鐘，向其中加入5 μ I的酶混合液II，混勻，41°C放置PCR儀中90分鐘，反應結束。反應過程中，最好同時設置陰性對照和陽性對照。其中，陰性對照為用蒸餾水替代待測樣品；陽性對照為用陽性對照質粒(濃度為lOng/μ I的pGS1-MPV質粒)替代待測樣品。
[0063]工作原理如下:由于猴痘病毒為雙鏈DNA病毒，故采用95°C放置10分鐘使猴痘病毒的基因組雙鏈DNA變性解鏈，隨后立即冰浴5分鐘降溫，在引物對(序列I和序列2)，以及AMV逆轉錄酶、和T7RNA聚合酶的作用下，反轉錄生成RNA ;接著以反轉錄所生成的RNA為模板進行NASBA擴增，至反應結束獲得大量的RNA擴增產物。
[0064]檢測結果判定方法為如下(I)或(II):
[0065](I)將RNA擴增產物進行瓊脂糖凝膠，根據電泳條帶的大小按照如下方法確定所述待測樣品中是否含有猴痘病毒:若得到大小為269nt的目的條帶(序列5)，則所述待測樣品中含有或候選含有猴痘病毒；若沒有得到大小為269nt的目的條帶(序列5)，則所述待測樣品中不含有或候選不含有猴痘病毒。
[0066](II)反應結束后，在紫外燈下觀察含有所述待測樣品的反應液的顏色，若含有所述待測樣品的反應液產生綠色熒光，則所述待測樣品中含有或候選含有猴痘病毒；若含有所述待測樣品的反應液不產生綠色熒光，則所述待測樣品中不含有或候選不含有猴痘病毒。
[0067]三、反應體系及反應程序的優(yōu)化
[0068]以上步驟一中反應液I的配方，以及步驟二中反應條件均是經過優(yōu)化的，優(yōu)化實驗具體如下:
[0069]1、反應液I中鎂離子濃度的優(yōu)化
[0070]將步驟一 2中反應液I中的100mmol/L的氯化鎂的體積設置如下平行:
1.5/1.75/2.0/2.25/2.5/2.75 μ L，其余成分不變，配合使用步驟一 2中的所述酶混合液
II，按照步驟二中所述的操作方法 進行測定，并按照步驟二中的檢測結果判定方法(I)進行結果判定。以陽性對照質粒(pGS1-MPV質粒)作為待測樣品，從而判定擴增效果。
[0071]RNA擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示，從圖中可以看出，當反應液I中的lOOmmol/L的氯化鎂的體積取2.5 μ L時目的條帶(269nt)最亮，擴增效率為最高。將目的條帶切下后送樣測序，結果證實目的條帶的序列正如序列表中序列5所示。
[0072]2、反應液I中鉀離子濃度優(yōu)化
[0073]將步驟一 2中反應液I中的500mmol/L氯化鉀的體積設置如下平行:
2.5/2.75/3.0/3.25/3.5/3.75 μ L，其余成分不變，配合使用步驟一 2中的所述酶混合液II，按照步驟二中所述的操作方法進行測定，并按照步驟二中的檢測結果判定方法(I)進行結果判定。以陽性對照質粒(pGS1-MPV質粒)作為待測樣品，從而判定擴增效果。
[0074]RNA擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2所示，從圖中可以看出，當反應液I中的500mmol/L氯化鉀的體積取3.5 μ L時目的條帶(269nt)最亮，擴增效率為最高。將目的條帶切下后送樣測序，結果證實目的條帶的序列正如序列表中序列5所示。
[0075]3、反應條件的優(yōu)化
[0076]使用步驟一 2中的所述反應液I和所述酶混合液II，按照步驟二中所述的操作方法進行測定，將其中加入酶混合液II后放置PCR儀中90分鐘的溫度設置如下平行:370C /380C /390C /40°C /41°C /42°C，按照步驟二中的檢測結果判定方法(I)進行結果判定。以陽性對照質粒(pGS1-MPV質粒)作為待測樣品，從而比較不同溫度對檢測反應的影響。
[0077]RNA擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果結果如圖3所示，從圖中可以看出，當反應溫度為41 °C時目的條帶(269nt)最亮，擴增效率為最高。將目的條帶切下后送樣測序，結果證實目的條帶的序列正如序列表中序列5所示?？梢?，41°C為最佳的反應擴增溫度。
[0078]實施例2、檢測猴痘病毒的NASBA試劑盒的特異性檢測[0079]待測樣品:陽性對照質粒(pGS1-MPV質粒)、羊痘疫苗、雞痘疫苗、牛痘疫苗、水痘疫苗。其中，以上各痘類病毒疫苗利用DNA抽提試劑盒根據說明書提取基因組DNA，備用。
[0080]使用實施例1步驟一 2中的所述反應液I和所述酶混合液11，按照實施例1步驟二中所述的操作方法進行測定，按照實施例1步驟二中的檢測結果判定方法(I)和(II)分別進行結果判定，從而檢測NASBA試劑盒的特異性。實驗同時設置以滅菌雙蒸水作為待測樣品的陰性對照。
[0081]RNA擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖4所示，從圖中可以看出，只有陽性對照質粒(pGS1-MPV質粒)擴增出目的條帶(269nt)，而其他病毒疫苗均未擴增出條帶。觀察紫外燈下各樣品反應液的顏色，結果如圖5所示，從圖中可以看出，只有陽性對照質粒(pGS1-MPV質粒)的反應液可見明顯的綠色熒光，而其他病毒疫苗均未見，與瓊脂糖凝膠電泳結果一致?？梢?，實施例1制備的檢測猴痘病毒的NASBA試劑盒具有很好的特異性。
[0082]實施例3、檢測猴痘病毒的NASBA試劑盒的靈敏度檢測
[0083]將陽性對照質粒(pGS1-MPV質粒)作為待測樣品，檢測實施例1制備的NASBA試劑盒的靈敏度。實驗同時設置以滅菌雙蒸水作為待測樣品的陰性對照。具體操作如下:
[0084]取已知濃度的陽性對照質粒(pGS1-MPV質粒質粒)，10倍倍比稀釋為如下系列濃度:2.76,2.76X 10\2.76X 102、2.76Χ 103、2.76Χ 104、2.76Χ 105、2.76Χ 106、2.76X 1O7 拷貝數/UL。以所得系列濃度的陽性對照質粒(pGS1-MPV質粒)分別作為模板，使用實施例1步驟一 2中的所述反應液I和所述酶混合液II，按照實施例1步驟二中所述的操作方法進行測定，按照實施例1步驟二中的檢測結果判定方法(I)進行結果判定，從而檢測實施例1制備的NASBA試劑盒的靈敏度。
[0085]RNA擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖6所示，從圖中可以看出，陽性對照質粒(pGS1-MPV質粒)的拷貝數為2.76X 103以上時，均可擴增出目的條帶(269nt)。觀察紫外燈下各樣品反應液的顏色，可見，實施例1制備的檢測猴痘病毒的NASBA試劑盒具有較高的靈敏度。
[0086]實施例4、檢測猴痘病毒的NASBA試劑盒的實際應用
[0087]待測樣品:機場口岸入境的發(fā)熱病人的離體血清，14人份。利用DNA抽提試劑盒根據說明書提取DNA，備用。
[0088]使用實施例1步驟一 2中的所述反應液I和所述酶混合液II，按照實施例1步驟二中所述的操作方法進行測定，按照實施例1步驟二中的檢測結果判定方法(I)和(II)分別進行結果判定。
[0089]結果顯示:14例發(fā)熱病人的離體血清樣本的反應液在紫外燈下均沒有綠色熒光產生，且RNA擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測也均沒有出現特異性目的條帶(269nt)，從而判定14份待測樣品的猴痘病毒檢測結果均為陰性，見圖7。
【權利要求】
1.用于檢測猴痘病毒的組合物，其特征在于:所述組合物由一個引物對和一個探針組成；所述引物對由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成；所述探針的序列為序列表中序列3。
2.用于檢測猴痘病毒的引物對或探針，其特征在于:所述引物對由序列表中序列I和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成；所述探針的序列為序列表中序列3。
3.根據權利要求1所述的組合物，或權利要求2所述的引物對或探針，其特征在于:所述探針的5’端標記有熒光報告基團FAM，3’端標記有熒光淬滅基團TAMRA。
4.根據權利要求1-3中任一所述的組合物或引物對，其特征在于:所述組合物中，組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子，以及所述探針的摩爾比為2:2:1 ; 組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子的摩爾比為1:1。
5.用于檢測猴痘病毒的試劑盒，為如下(a)或(b): (a)含有權利要求1或3所述的組合物，以及如下物質:NTP、dNTP、T7RNA聚合酶、AMV逆轉錄酶、核糖核酸酶H ； (b)含有權利要求2或3所述的引物對，以及如下物質:NTP、dNTP、T7RNA聚合酶、AMV逆轉錄酶、核糖核酸酶H。
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中含有反應液I和酶混合液II ; 所述反應液I的溶劑為水.，溶質及濃度如下:NTP0.5mmol/L, dNTP0.02mmol/L,Tris-HC150mmol/L,氯化鎂 12.5mmol/L, 二硫蘇糖醇 10mmol/L,氯化鉀 87.5mmol/L,組成權利要求1-4任一中所述引物對的兩條單鏈DNA分子各0.5 μ mol/L ； 所述酶混合液II的溶劑為水，溶質及濃度如下:T7RNA聚合酶8U/ μ L，AMV逆轉錄酶1.6U/ μ L，核糖核酸酶H0.04U/ μ L，RNA酶抑制劑1.2U/ μ L，牛血清白蛋白0.5 μ g/ μ L，權利要求1-4任一中所述探針I(yè) μ mol/L。
7.權利要求1-6中任一所述的組合物或引物對或探針或試劑盒在檢測或輔助檢測猴痘病毒中的非診斷目的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于:所述應用中，先將所述反應液I和所述待測樣品混合，95°C放置10分鐘，將反應體系降溫至0-4°C，再向反應體系中加入所述酶混合液II，41°C放置90分鐘；在反應過程中，所述反應液1、所述酶混合液II和所述待測樣品的配比為 20 yL:5 μ L:lyL。
9.根據權利要求7或8所述的應用，其特征在于:所述待測樣品為DNA樣品。
【文檔編號】C12Q1/70GK103468830SQ201310460128
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權日:2013年9月29日
【發(fā)明者】呂沁風, 鄭偉, 吳忠華, 羅鵬, 徐琦, 何蕾, 李 禾 申請人:浙江國際旅行衛(wèi)生保健中心