一種提高豬藍(lán)耳病病毒靶細(xì)胞感染滴度的方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高豬藍(lán)耳病病毒靶細(xì)胞感染滴度的方法及其應(yīng)用，屬于動(dòng)物疫病預(yù)防控制領(lǐng)域。通過構(gòu)建能夠表達(dá)豬藍(lán)耳病病毒受體硫酸乙酰肝素、唾液酸粘附素、波形蛋白、CD163、CD151和非肌肉肌球蛋白重鏈ⅡA受體中的單個(gè)或多個(gè)的Marc145細(xì)胞或MA-104細(xì)胞，再利用該細(xì)胞接種豬藍(lán)耳病病毒，收集病毒液，豬藍(lán)耳病病毒感染滴度得到大幅提高；收集的病毒液可進(jìn)一步用于藍(lán)耳病疫苗生產(chǎn)。本發(fā)明利用能表達(dá)豬藍(lán)耳病病毒受體細(xì)胞接種病毒，可連續(xù)收獲病毒且收獲病毒滴度提高2～5倍，而所制備疫苗的效力并沒有降低，在不增加額外生產(chǎn)成本的基礎(chǔ)上，使單位時(shí)間產(chǎn)能提高2～5倍。
【專利說明】一種提高豬藍(lán)耳病病毒靶細(xì)胞感染滴度的方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動(dòng)物疫病預(yù)防控制領(lǐng)域，尤其涉及一種提高豬藍(lán)耳病病毒靶細(xì)胞感染滴度的方法及其在疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]豬藍(lán)耳病，也叫豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratorysyndrome,PRRS),是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus, PRRSV)引起的以母豬流產(chǎn)和仔豬呼吸障礙為主要特征的病毒性傳染病，并引起嚴(yán)重的免疫抑制。該病毒自1987年在美國出現(xiàn)以來，已在全球豬群中廣泛傳播，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，成為全球規(guī)模化豬場的主要疫病之一，也是全球豬病控制上的一大難題。
[0003]病毒受體是決定病毒宿主范圍和組織嗜性的重要因素。關(guān)于病毒受體特異性和病毒起源宿主類型之間關(guān)系的研究是目前病毒學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。豬藍(lán)耳病病毒侵染靶細(xì)胞的先決條件是實(shí)現(xiàn)與宿主細(xì)胞的吸附，而宿主細(xì)胞表面的受體是完成這種吸附過程必不可少的。研究表明，豬藍(lán)耳病病毒與細(xì)胞上的受體結(jié)合是實(shí)現(xiàn)其侵染豬肺泡巨噬細(xì)胞的先決條件。目前已經(jīng)確定的豬藍(lán)耳病病毒的細(xì)胞受體有六種，分別是硫酸乙酰肝素(Heparin Sulphate, HS)、唾液酸粘附素(Sialoadhesin, Sn)、波形蛋白(Vimentin)、CD163(Cluster of Differentiationl63)分子、CD151 (Cluster of Differentiationl51)分子和NMMHC IIA (非肌肉肌球蛋白重鏈II A)分子。
[0004]隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)將在抗病毒新藥開發(fā)中起著越來越重要的作用。通過病毒感染亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組研究，可以篩選病毒作用于細(xì)胞的靶標(biāo)蛋白。發(fā)現(xiàn)病毒的作用靶標(biāo)對抗病毒新型藥物的開發(fā)具有重要意義，可以根據(jù)靶標(biāo)的結(jié)構(gòu)有的放矢地設(shè)計(jì)多肽類等抗病毒分子藥物，阻斷病毒對靶標(biāo)的作用等。可以將編碼靶標(biāo)蛋白的基因通過基因工程修飾的手段轉(zhuǎn)移到相應(yīng)細(xì)胞基因組中，增強(qiáng)細(xì)胞感染病毒的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，生產(chǎn)更高效價(jià)的疫苗，為病毒性疾病的預(yù)防和治療帶來前所未有的發(fā)展空間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種提高豬藍(lán)耳病病毒靶細(xì)胞感染滴度的方法。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供上述方法在豬藍(lán)耳病疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0008]一種提高豬藍(lán)耳病病毒靶細(xì)胞感染滴度的方法，包括如下步驟:用細(xì)胞生長液培養(yǎng)可表達(dá)豬藍(lán)耳病病毒受體的細(xì)胞；待細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%以上時(shí)，移除細(xì)胞生長液，接種豬藍(lán)耳病病毒，加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)； 待病毒引起的細(xì)胞病變達(dá)到80%以上時(shí)收獲病毒液，隨后補(bǔ)入不含病毒的細(xì)胞維持液，12h后再收毒,如此反復(fù)收毒3~5次。
[0009]所述的可表達(dá)豬藍(lán)耳病病毒受體的細(xì)胞優(yōu)選為能表達(dá)硫酸乙酰肝素OfeparinSulphate, HS)、唾液酸粘附素(Sialoadhesin, Sn)、波形蛋白(Vimentin)、CD163 (Clusterof Differentiationl63)>CD151 (Cluster of Differentiationl51)和 NMMHC IIA (非肌肉肌球蛋白重鏈II A)等受體中的單個(gè)或多個(gè)的Marcl45細(xì)胞或MA-104細(xì)胞。
[0010]更優(yōu)選的，所述的可表達(dá)豬藍(lán)耳病病毒受體的細(xì)胞為能表達(dá)⑶151分子、⑶163分子或共同表達(dá)⑶151和⑶163分子的Marcl45細(xì)胞。
[0011]所述的表達(dá)豬藍(lán)耳病病毒受體的細(xì)胞優(yōu)選通過包含如下步驟的方法制備得到:將編碼所述受體的基因片段連接到真核表達(dá)載體上，再轉(zhuǎn)染到Marcl45細(xì)胞或MA-104細(xì)胞中，通過G418和單細(xì)胞克隆培養(yǎng)法篩選獲得表達(dá)豬藍(lán)耳病病毒受體的細(xì)胞；所述的真核表達(dá)載體優(yōu)選為PIRES2-EGFP。[0012]所述的細(xì)胞生長液優(yōu)選為含體積濃度為8%小牛血清的DMEM ;所述的細(xì)胞維持液優(yōu)選為含體積濃度為2%小牛血清的DMEM。
[0013]所述的豬藍(lán)耳病病毒接種的劑量優(yōu)選為0.0005~0.002M0I，更優(yōu)選的，豬藍(lán)耳病病毒接種的劑量為0.001M0I。
[0014]上述提高豬藍(lán)耳病病毒靶細(xì)胞感染滴度的方法在豬藍(lán)耳病疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0015]一種生產(chǎn)豬藍(lán)耳病疫苗的方法包括如下步驟:按照上述方法收集病毒液后，將病毒液與凍干保護(hù)劑混合，制成凍干活疫苗；或?qū)⒉《疽河?00KD截留分子量的超濾膜包濃縮10倍以上，將滅活劑與濃縮的病毒液混合進(jìn)行滅活后，再用凝膠層析柱柱層析得到純化抗原，按抗原和油佐劑混合，乳化配制成滅活疫苗。
[0016]所述的凍干保護(hù)劑優(yōu)選為質(zhì)量濃度為5%的蔗糖脫脂乳；所述的滅火劑優(yōu)選為質(zhì)量濃度為37%的甲醛溶液；所述的油佐劑優(yōu)選為用94%白油、6%Span-80和2%硬脂酸鋁配制。
[0017]所述的病毒液與凍干保護(hù)劑的體積比優(yōu)選為1:0.5~2，更優(yōu)選為1:1 ;所述的滅活劑與濃縮的病毒液的體積比優(yōu)選為1:1500~2500，更優(yōu)選為1:2000 ;所述的抗原和油佐劑的體積比優(yōu)選為1:0.5~2，更優(yōu)選為1:1。
[0018]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果:
[0019]本發(fā)明采用基因克隆方法從豬肺泡巨噬細(xì)胞克隆豬藍(lán)耳病病毒受體蛋白基因編碼片段，插入到真核表達(dá)載體，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)方式穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到PRRSV敏感細(xì)胞，并采用極限稀釋法，從單個(gè)陽性細(xì)胞克隆逐步擴(kuò)繁，建立單個(gè)PRRSV受體或多個(gè)PRRSV受體遺傳修飾的細(xì)胞系(株)，利用該細(xì)胞接種豬藍(lán)耳病病毒后，可以大幅提高病毒感染滴度，可以多次收毒，并最終確保所生產(chǎn)PRRSV疫苗效力的穩(wěn)定性。例如，在本發(fā)明所列舉實(shí)施方式中，利用豬藍(lán)耳病病毒JXAl-R (JXAl)株感染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染⑶151分子、⑶163分子和共同表達(dá)⑶151和CD163分子，可連續(xù)收獲病毒且收獲病毒滴度提高2~5倍，而所制備疫苗的效力并沒有降低?？傮w評價(jià)，采用本發(fā)明的技術(shù)，可以在不增加額外生產(chǎn)成本的基礎(chǔ)上，使單位時(shí)間產(chǎn)能提高2~5倍。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1是PCR擴(kuò)增的目的基因CD151和CD163片段電泳結(jié)果圖；其中，A:CD151 ；B:CD163。
[0021]圖2 是重組質(zhì)粒 pIRES2-EGFP-CD151 和 pIRES2_EGFP_CD163 分別用 SalI 和 KpnI雙酶切的電泳結(jié)果圖；其中，A:pIRES2-EGFP-CD151 ；B:pIRES2-EGFP_CD163。
[0022]圖3是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PRRSV受體蛋白基因CD151、CD163和CD151/CD163共轉(zhuǎn)染的Marcl45細(xì)胞在熒光倒置顯微鏡下的結(jié)果圖；其中，A:轉(zhuǎn)染⑶151的Marcl45細(xì)胞；B:轉(zhuǎn)染CD163的Marcl45細(xì)胞；C:CD151/CD163共轉(zhuǎn)染的Marcl45細(xì)胞；A、B、C各圖中左圖為明視
野，右圖為熒光顯微鏡觀察結(jié)果。
[0023]圖4是PRRSV受體在未轉(zhuǎn)染Marcl45細(xì)胞和轉(zhuǎn)染的Marcl45細(xì)胞中的表達(dá)情況結(jié)果圖；其中，Al和A2分別是未轉(zhuǎn)染的和轉(zhuǎn)染CD151的Marcl45細(xì)胞；BI和B2分別是未轉(zhuǎn)染的和轉(zhuǎn)染⑶163的Marcl45細(xì)胞；C1和C2分別是未轉(zhuǎn)染的和⑶151/⑶163共轉(zhuǎn)染的Marc 145細(xì)胞；各圖中左圖藍(lán)色指示細(xì)胞核,右圖紅色指示目標(biāo)受體蛋白。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0025]實(shí)施例1豬藍(lán)耳病病毒受體蛋白編碼基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及質(zhì)粒提取
[0026](I)目的基因編碼區(qū)(⑶S)引物設(shè)計(jì)
[0027]根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI, National Center for BiotechnologyInformational ；網(wǎng)站 http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)的 GenBank 里已報(bào)道的豬 CD151(NM_001243865.1)和CD163 (NM_213976.1)基因序列，以此段序列為模板，利用primerpremier6及01igo6軟件進(jìn)行引物設(shè) 計(jì)。所設(shè)計(jì)的引物序列見表1，引物由上海生物工程公司合成。
[0028]表1豬⑶151和⑶163基因cDNA擴(kuò)增的引物序列
[0029]
【權(quán)利要求】
1.一種提高豬藍(lán)耳病病毒靶細(xì)胞感染滴度的方法，其特征在于包括如下步驟:用細(xì)胞生長液培養(yǎng)可表達(dá)豬藍(lán)耳病病毒受體的細(xì)胞；待細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%以上時(shí)，移除細(xì)胞生長液，接種豬藍(lán)耳病病毒，加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)；待病毒引起的細(xì)胞病變達(dá)到80%以上時(shí)收獲病毒液，隨后補(bǔ)入不含病毒的細(xì)胞維持液，12h后再收毒,如此反復(fù)收毒3~5次。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高豬藍(lán)耳病病毒靶細(xì)胞感染滴度的方法，其特征在于:所述的可表達(dá)豬藍(lán)耳病病毒受體的細(xì)胞為能表達(dá)硫酸乙酰肝素、唾液酸粘附素、波形蛋白、CD163、CD151和非肌肉肌球蛋白重鏈II A受體中的單個(gè)或多個(gè)的Marcl45細(xì)胞或MA-104細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高豬藍(lán)耳病病毒靶細(xì)胞感染滴度的方法，其特征在于:所述的可表達(dá)豬藍(lán)耳病病毒受體的細(xì)胞為能表達(dá)⑶151分子、⑶163分子或共同表達(dá)⑶151和⑶163分子的Marcl45細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高豬藍(lán)耳病病毒靶細(xì)胞感染滴度的方法，其特征在于:所述的表達(dá)豬藍(lán)耳病病毒受體的細(xì)胞通過包含如下步驟的方法制備得到:將編碼所述受體的基因片段連接到真核表達(dá)載體上，再轉(zhuǎn)染到Marcl45細(xì)胞或MA-104細(xì)胞中，通過G418和單細(xì)胞克隆培養(yǎng)法篩選獲得表達(dá)豬藍(lán)耳病病毒受體的細(xì)胞；所述的真核表達(dá)載體為PIRES2-EGFP。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高豬藍(lán)耳病病毒靶細(xì)胞感染滴度的方法，其特征在于:所述的豬藍(lán)耳病病毒接種的劑量為0.0005~0.002M0I。
6.權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的提高豬藍(lán)耳病病毒靶細(xì)胞感染滴度的方法在豬藍(lán)耳病疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用。
7.—種生產(chǎn)豬藍(lán)耳病疫苗的方法，其特征在于包括如下步驟:按照權(quán)利要求1~6任一項(xiàng)所述的提高豬藍(lán)耳病病 毒靶細(xì)胞感染滴度的方法方法收集病毒液后，將病毒液與凍干保護(hù)劑混合，制成凍干活疫苗；或?qū)⒉《疽河?00KD截留分子量的超濾膜包濃縮10倍以上，將滅活劑與濃縮的病毒液混合進(jìn)行滅活后，再用凝膠層析柱柱層析得到純化抗原，按抗原和油佐劑混合，乳化配制成滅活疫苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)豬藍(lán)耳病疫苗的方法，其特征在于:所述的凍干保護(hù)劑為質(zhì)量濃度為5%的蔗糖脫脂乳；所述的滅火劑為質(zhì)量濃度為37%的甲醛溶液；所述的油佐劑用94%白油、6% Span-80和2%硬脂酸鋁配制。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)豬藍(lán)耳病疫苗的方法，其特征在于:所述的病毒液與凍干保護(hù)劑的體積比為1:0.5~2;所述的滅活劑與濃縮的病毒液的體積比為1:1500~2500 ;所述的抗原和油佐劑的體積比為1:0.5~2。
【文檔編號】C12N7/00GK103525773SQ201310491696
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月18日
【發(fā)明者】黃海軍 申請人:武漢市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所