一種重組狂犬病病毒口服疫苗株及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種重組狂犬病病毒口服疫苗株，它是以SAD-B19為母本毒株，所述母本毒株G蛋白上194位的天冬氨酸突變?yōu)榻z氨酸、333位的精氨酸突變?yōu)楣劝彼幔⑶宜瞿副径局甑幕蚪MG基因和L基因之間被插入犬GM-CSF基因。本發(fā)明還公開(kāi)了該重組狂犬病病毒口服疫苗株的制備方法。本發(fā)明的重組狂犬病病毒口服疫苗株具有良好的復(fù)制性，安全性，并且通過(guò)犬GM-CSF基因的插入增強(qiáng)了免疫原性，口服免疫后可以誘導(dǎo)高水平的中和抗體，顯著優(yōu)于LBNSE病毒（歐洲用于野生動(dòng)物免疫的疫苗株），可以作為狂犬病口服疫苗的候選株。
【專利說(shuō)明】一種重組狂犬病病毒口服疫苗株及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動(dòng)物疫苗【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種重組狂犬病病毒口服疫苗株及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]狂犬病是最古老的傳染病之一，是由狂犬病毒(Rabies virus，RV)引起的一種人畜共患傳染病?？袢∈瞧駷橹谷祟惒∷缆首罡叩募毙詡魅静。坏┌l(fā)病，病死率幾乎達(dá)100%。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)告，全世界每年有約55000人死于狂犬病，其中絕大多數(shù)分布在非洲和亞洲。近些年，我國(guó)平均每年死于約有3000人左右死于狂犬病，多數(shù)是由于被動(dòng)物咬傷或者咬傷而被感染。疫苗免疫是預(yù)防和控制狂犬病的最有效途徑，當(dāng)前廣泛應(yīng)用的狂犬病疫苗主要是原代細(xì)胞培養(yǎng)疫苗和傳代細(xì)胞純化疫苗等滅活疫苗，這些疫苗雖然免疫效果較好，但價(jià)格昂貴，而且主要采用的免疫方式為肌注免疫，這樣對(duì)于一些流浪動(dòng)物及野生動(dòng)物的免疫接種則很難實(shí)現(xiàn)。在我國(guó)，街頭的流浪狗、貓等動(dòng)物為當(dāng)前主要的傳染源，因此，將流浪的動(dòng)物進(jìn)行有效的免疫是狂犬病防控的關(guān)鍵。
[0003]口服免疫是一種公認(rèn)的易于實(shí)施的免疫方式，歐美許多國(guó)家已經(jīng)將口服疫苗應(yīng)用于野生動(dòng)物的狂犬病防控。目前應(yīng)用的口服疫苗主要有SAD-B19 (Schneider LG, CoxJHj Muller WWj Hohnsbeen KP.Current oral rabies vaccination in Europe:an interimbalance.Rev Infect Dis1988，IOSupp14:S654-659.Wandeler Al，Capt S，KappelerA，Hauser R.0ral immunization of wildlife against rabies:concept and firstfield experiments.Rev Infect Dis.1988，10Suppl4:S649-653.)、VR_G (Kieny MPj LatheR，Drillien R，Spehner Dj Skory S，et al.Expression of rabies virus glycoproteinfrom a recombinant vaccinia virus.Nature.1984, 312:163-166.Brochier Bj KienyMPj Costy F，Coppens P，Bauduin B，et al.Large-scale eradication of rabies usingrecombinant vaccinia-rabies vaccine.Nature.1991，354:520-522.FearneyhoughMG, Wilson PJ，Clark KA，Smith DR，Johnston DHj et al.Results of an oral rabiesvaccination program for coyotes.J Am Vet Med Assoc.1998,212:498-502.Hanlon CA, Niezgoda M，Hamir AN, Schumacher Cj Koprowski H，et al.First NorthAmerican field release of a vaccinia-rabies glycoprotein recombinant virus.J Wildl Dis.1998，34:228-239)，和 SAG-2 (Flamand A，Coulon Pj Lafay Fj TuffereauC.Avirulent mutants of rabies virus and their use as live vaccine.TrendsMicrobiol.1993, 1:317-320.Cliquet Fj Robardet E，Must K，Laine Mj Peik K，etal.Eliminating rabies in Estonia.PLoS Negl Trop Dis.2012,6:el535.CliquetF，Aubert M.Elimination of terrestrial rabies in Western European countries.Dev Biol(Basel).2004，119:185-204.Niin E，Barrat Jj Kristian M，DemersonJM，Cliquet F.First oral vaccination of wildlife against rabies in Estonia.DevBiol(Basel).2006,125:145-147.)等。但這些口服疫苗均存在許多不足，例如，SAD雖然在歐美一些國(guó)家消滅了狂犬病在狐貍中的傳播，但有研究表明SAD對(duì)小鼠及本土動(dòng)物具有致病性(Winkler WG, Shaddock JH, Williams Lff.0ral rabies vaccine: evaluation ofits infectivity in three species of rodents.Am J Epidemiol.1976，104:294-298.XSAG-2為從SAD株發(fā)展而來(lái)，是在SAD株中突變2個(gè)氨基酸位點(diǎn)而使其致病性大大降低，但 SAG-2 所產(chǎn)生的中和抗體水平較低(Hanlon CA, Niezgoda M, Morrill P, RupprechtCE.0ral efficacy of an attenuated rabies virus vaccine in skunks and raccoons.J Wildl Dis.2002,38:420-427.)。VR-G為痘病毒表達(dá)狂犬病G蛋白的重組毒株，雖然VR-G幫助歐美許多國(guó)家阻止了狂犬病在浣熊和狐貍等野生動(dòng)物中的傳播，但有研究表明，VR-G暴露給人可導(dǎo)致嚴(yán)重的皮膚炎癥發(fā)應(yīng)和全身的痘病毒感染(Mempel M, IsaG,Klugbauer N, Meyer H, Wildi G, et al.Laboratory acquired infection withrecombinant vaccinia virus containing an immunomodulating construct.J InvestDermatol.2003, 120:356-358.Rupprecht CE, Blass L, Smith K, Orciari LA,NiezgodaM, et al.Human infection due to recombinant vaccinia-rabies glycoprotein virus.N Engl J Med.2001, 345:582-586.Centers for Disease C, Prevention.Human vacciniainfection after contact with a raccoon rabies vaccine bait-Pennsylvania, 2009.MMWR Morb Mortal Wkly Rep.2009, 58:1204-1207.)。因此，一種安全有效價(jià)格便宜的狂犬病口服疫苗將對(duì)狂犬病的防控起到重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一株重組狂犬病病毒可以用于狂犬病口服免疫，它以SAD-B19為母本毒株，突變其2個(gè)氨基酸位點(diǎn)，得到LBNSE毒株，并將犬GM-CSF基因插入到LBNSE毒株基因組中，通過(guò)反向遺傳操作系統(tǒng)拯救出可以表達(dá)犬GM-CSF基因的重組狂犬病毒LBNSE-dog GM-CSF，該病毒株具有較高的復(fù)制滴度，致病性低，有較好的免疫原性，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的中和抗體。
[0005]本發(fā)明的上述目的通 過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):
[0006]所用的LBNSE毒株來(lái)源于用于歐洲野生動(dòng)物口服免疫用的疫苗株SAD-B19，但在SAD-B19病毒G蛋白上將194位的天冬氨酸(AAT)突變?yōu)榻z氨酸(TCC)，將333位的精氨酸(AGA)突變?yōu)楣劝彼?GAA)，相當(dāng)于另一株疫苗株SAG2 (在歐洲用于免疫野生動(dòng)物的疫苗株)，大大減弱了病毒的致病性(Wen Y, Wang H, Wu H, Yang F，Tripp RA, etal.(2011)Rabies virus expressing dendritic cell-activating molecules enhancesthe innate and adaptive immune response to vaccination.J Virol85:1634-1.Rasalingam P，Rossiter JPjMebatsion T，Jackson AC.Comparative pathogenesis ofthe SAD_L16strain of rabies virus and a mutant modifying the dynein lightchain binding site of the rabies virus phosphoprotein in young mice.VirusRes.2005，111:55-60.Conzelmann KKjCox JHj Schneider LGj Thiel HJ.Molecularcloning and complete nucleotide sequence of the attenuated rabies virus SADB19.Virology.1990，175:485-499.)。另外，還將SAD-B19毒株基因組中G基因和L基因之間的假基因敲出，在G基因和L基因之間加入兩個(gè)酶切位點(diǎn)BsiWI和NheI作為插入外源基因的位點(diǎn)。[0007]狂犬病病毒疫苗株SAD-B19的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]本發(fā)明中的犬GM-CSF基因的克隆是通過(guò)對(duì)犬的新鮮血液中PBMCs的分離，經(jīng)過(guò)LPS的刺激后，然后用反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增得到。將擴(kuò)增的犬GM-CSF基因經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確后插入到LBNSE毒株基因組的G基因和L基因之間，構(gòu)建出表達(dá)犬GM-CSF基因的感染性克隆LBNSE-dog GMCSF。
[0009]犬GM-CSF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示，重組狂犬病毒LBNSE-dogGM-CSF的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0010]感染性克隆LBNSE-dog GMCSF與分別表達(dá)狂犬病毒N、P、G和L四個(gè)蛋白的輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染BSR細(xì)胞后，經(jīng)免疫熒光證明拯救了可以表達(dá)犬GM-CSF基因的重組狂犬病病毒。為了驗(yàn)證是否犬GM-CSF基因已經(jīng)插入到狂犬病毒基因組中，將拯救的病毒LBNSE-dogGM-CSF感染BSR細(xì)胞，然后提取病毒RNA，用反轉(zhuǎn)錄PCR進(jìn)行驗(yàn)證，證明了犬GM-CSF基因已插入到狂犬病毒基因組中。
[0011]本發(fā)明中的重組病毒LBNSE-dog GM-CSF在BSR細(xì)胞及NA細(xì)胞上的生長(zhǎng)曲線與LBNSE病毒相似，表明外源基因犬GM-CSF的插入并沒(méi)有影響到病毒的生長(zhǎng)和增殖。另外，重組病毒LBNSE-dog GM-CSF在NA和BSR細(xì)胞上的滴度分別可以達(dá)到108 25FFU/ml和IO8 5FFU/ml，達(dá)到了口服免疫滴度的要求。
[0012]將重組病毒LBNSE-dog GM-CSF腦內(nèi)接種小鼠，小鼠未出現(xiàn)任何發(fā)病癥狀，表明該重組病毒無(wú)致病性。另外，在口服免疫犬后，用棉拭子采集不同時(shí)間點(diǎn)的唾液樣本，用RT-PCR均未檢測(cè)到狂犬病毒,表明該病毒口服免疫后不會(huì)導(dǎo)致病毒向外傳播的隱患,安全性高。
[0013]將表達(dá)犬GM-CSF基因的重組狂犬病毒LBNSE-dog GM-CSF 口服免疫一次便可以誘導(dǎo)較高水平的中和抗體，顯著高于 母本毒株LBNSE，并且在口服免疫后第5周仍然具有較高水平抗體。
[0014]總之，本發(fā)明中重組病毒LBNSE-dog GM-CSF具有良好的復(fù)制性，安全性，并且通過(guò)犬GM-CSF基因的插入增強(qiáng)了免疫原性，口服免疫后可以誘導(dǎo)高水平的中和抗體，顯著優(yōu)于LBNSE病毒(歐洲用于野生動(dòng)物免疫的疫苗株)，因此，重組病毒LBNSE-dog GM-CSF可以作為狂犬病口服疫苗的候選株。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1是LBNSE毒株與SAD-B19的堿基序列及氨基酸序列突變位點(diǎn)示意圖。
[0016]圖2是向LBNSE毒株基因中插入犬GM-CSF基因的示意圖。
[0017]圖3是拯救出的重組狂犬病病毒LBNSE-dog GMCSF的免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果。
[0018]圖4是細(xì)胞對(duì)照的免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果。
[0019]圖5重組病毒LBNSE-dog GM-CSF的反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)結(jié)果(Μ為DL2000marker，I為L(zhǎng)BNSE毒株，2為L(zhǎng)BNSE-dog GM-CSF毒株，3為陰性對(duì)照)。
[0020]圖6重組病毒LBNSE-dog GM-CSF在不同細(xì)胞系上的生長(zhǎng)曲線。
[0021]圖7重組病毒口服免疫犬后的中和抗體水平。
[0022]圖8 口服免疫后I小時(shí)病毒殘留及排毒情況反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)結(jié)果(1-6為L(zhǎng)BNSE組，7-12 為 LBNSE-GMCSF)。[0023]圖9 口服免疫后I小時(shí)病毒殘留及排毒情況反轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)結(jié)果(1-6為L(zhǎng)BNSE組，7-12 為 LBNSE-GMCSF)。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0025]實(shí)施例1重組病毒LBNSE-dog GM-CSF的設(shè)計(jì)、拯救、鑒定及免疫效力初步評(píng)價(jià)
[0026]I材料和方法
[0027]1.1 材料
[0028]1.1.1 病毒
[0029]LBNSE毒株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，該病毒的具體信息和構(gòu)建方法可參考有關(guān)文獻(xiàn)(Wen Y, Wang H, Wu H, Yang F，Tripp RA, et al.(2011) Rabiesvirus expressing dendritic cell-activating molecules enhances the innate andadaptive immune response to vaccination.J Virol85:1634-1.X
[0030]1.1.2 質(zhì)粒
[0031]用于拯救LBNSE毒株的感染性克隆pLBNSE的構(gòu)建策略及具體方法可參考有關(guān)文獻(xiàn)(Wen Y, Wang H, Wu H, Yang F，Tripp RA, et al.(2011) Rabies virus expressingdendritic cell-activating molecules enhances the innate and adaptive immuneresponse to vaccination.J Virol85:1634-1.X
[0032]1.1.3細(xì)胞和單克隆抗體
[0033]BSR細(xì)胞(BHK-21細(xì)胞的一個(gè)克隆細(xì)胞系)，生長(zhǎng)于含10%胎牛血清(Fetalbovine serum, FBS) (Gibco, Grand Island, NY)的 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’smedium, DMEM) (Mediatech, Herndon, VA)培養(yǎng)液。鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞(Mouse neuroblastomacells, NA),生長(zhǎng)于含10%FBS的RMPI1640培養(yǎng)液(Mediatech)。異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate, FITC)標(biāo)記的狂犬病毒核蛋白單克隆抗體購(gòu)自Fujirebio(Melvin, PA)公司。
[0034]1.1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0035]6-8周齡的ICR小鼠，購(gòu)于公司；6_7月齡的雌性比格犬購(gòu)于安陸瑞科森實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。
[0036]1.1.5主要試劑
[0037]膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提和大提試劑盒、RNeasy min1-kit RNA提取試劑盒及Superfect轉(zhuǎn)染試劑盒均購(gòu)于QIAGEN公司，各種限制性內(nèi)切酶購(gòu)于New EnglandBiolabs, Beverly, MA 公司。Superscript? RT-PCR 試劑盒購(gòu)于 Invitrogen 公司。Ficoll-1077 購(gòu)于 sigma-aIdrich 公司。
[0038]1.2引物的設(shè)計(jì)與合成
[0039]用于擴(kuò)增犬GM-CSF基因及RT-PCR檢測(cè)犬GM-CSF基因的引物見(jiàn)表1，由上海金斯瑞公司合成。
[0040]表1
[0041]
【權(quán)利要求】
1. 一種重組狂犬病病毒口服疫苗株，其特征在于:它是以SAD-B19為母本毒株，所述母本毒株G蛋白上194位的天冬氨酸突變?yōu)榻z氨酸、333位的精氨酸突變?yōu)楣劝彼幔⑶宜瞿副径局甑幕蚪MG基因和L基因之間被插入犬GM-CSF基因。
2.一種重組狂犬病病毒口服疫苗株的制備方法，其特征在于包括以下步驟: 1)以SAD-B19為母本毒株，將所述母本毒株G蛋白上194位的天冬氨酸突變?yōu)榻z氨酸、333位的精氨酸突變?yōu)楣劝彼幔? 2)將母本毒株基因組中G基因和L基因之間的假基因敲出，在G基因和L基因之間加入兩個(gè)酶切位點(diǎn)BsiWI和NheI，將犬GM-CSF基因插入到G基因和L基因之間，并通過(guò)反向遺傳操作系統(tǒng)拯救出表達(dá)犬GM-CSF基因的重組狂犬病病毒。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK103525776SQ201310502446
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月23日
【發(fā)明者】傅振芳, 周明, 王雷, 周頌欽, 溫永俊, 趙凌, 崔旻 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)