采用固體罐發(fā)酵制備米曲霉乳糖酶發(fā)酵曲的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵，特別是指一種采用固體罐發(fā)酵制備米曲霉乳糖酶發(fā)酵曲的方法。包括孢子懸液的制備、固體罐發(fā)酵、曲盤培養(yǎng)等工藝步驟，本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的發(fā)酵周期長、染菌率高等技術(shù)問題，具有發(fā)酵周期短、染菌率低、生產(chǎn)效率高等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】采用固體罐發(fā)酵制備米曲霉乳糖酶發(fā)酵曲的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵，特別是指一種采用固體罐發(fā)酵制備米曲霉乳糖酶發(fā)酵曲的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乳糖酶(Lactase)是一類催化特殊類型的糖苷鍵——β _半乳糖苷類化合物中β-半乳糖苷鍵發(fā)生水解斷裂的酶。乳糖酶能將乳糖水解為半乳糖和葡萄糖，并具有半乳糖苷的轉(zhuǎn)移作用，在乳糖分子的半乳糖一側(cè)連接1-4個(gè)半乳糖，生成低聚半乳糖。米曲霉(Aspergillus oryzae)產(chǎn)生的乳糖酶是高溫乳糖酶,最適溫度較高,一般在50°C以上,應(yīng)用于生產(chǎn)中可有效防止雜菌污染，而且較耐熱、耐酸，穩(wěn)定性較高，不需要活化劑和穩(wěn)定劑，并且反應(yīng)速度快、時(shí)間短，酶的用量少。
[0003]根據(jù)發(fā)酵過程培養(yǎng)基質(zhì)的不同，發(fā)酵方式分為固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵。固態(tài)發(fā)酵比較粗放，一般不需要嚴(yán)格的無菌培養(yǎng)。固態(tài)發(fā)酵的基質(zhì)濃度高，所以發(fā)酵產(chǎn)量一般比液態(tài)發(fā)酵要高，而且后處理工藝簡單，三廢少。
[0004]米曲霉乳糖酶是胞外酶，既可以采用固態(tài)發(fā)酵，也可以采用液體深層發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵發(fā)酵成本低，分離提取方便，生產(chǎn)效率高。但與液態(tài)發(fā)酵相比，固態(tài)發(fā)酵的周期一般較長，難以實(shí)現(xiàn)純種培養(yǎng)，而且是在沒有或者幾乎沒有游離水的條件下進(jìn)行發(fā)酵，其傳質(zhì)傳熱效率非常低。固態(tài)發(fā)酵受很多因素的限制，各項(xiàng)參數(shù)不易監(jiān)測，而且很難保證每批次發(fā)酵條件一致，再現(xiàn)性差，是比液態(tài)發(fā)酵更為復(fù)雜的發(fā)酵過程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種發(fā)酵周期短、染菌率低的采用固體罐發(fā)酵制備米曲霉乳糖酶發(fā)酵曲的方法。`
[0006]本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是:
[0007]采用固體罐發(fā)酵制備米曲霉乳糖酶發(fā)酵曲的方法，包括如下工藝步驟:
[0008]A、孢子懸液的制備
[0009]將米曲霉菌株經(jīng)培養(yǎng)后制成濃度為I 一 5 X 107cfu/mL的孢子懸液；
[0010]B、固體罐發(fā)酵
[0011]將步驟A制備的孢子懸液接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，固體發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下單位重量份的組分組成:
[0012]麩皮I ;水 0.8-1.1 ;乳糖 0.05-0.15 ； (NH4)2SO40.005-0.015 ；MgS040.00 2-0.008 ；KH2PO40.005-0.01，聚丙二醇 0.0008-0.0012 ；
[0013]發(fā)酵溫度為28-32 °C，濕度為45-75%，壓力為0.03-0.05MPa,空氣流量為1.0-2.0mVmin,每間隔4_8小時(shí)間歇攪拌5_15分鐘，攪拌轉(zhuǎn)速15-30轉(zhuǎn)/分；培養(yǎng)24-36小時(shí)；
[0014]C、曲盤培養(yǎng)[0015]當(dāng)步驟B中基質(zhì)菌絲體覆蓋率達(dá)到90%以上，出料轉(zhuǎn)至曲盤培養(yǎng)；曲盤培養(yǎng)至乳糖酶酶活不再提高或提高緩慢時(shí)結(jié)束培養(yǎng)；
[0016]所述的米曲霉菌株選用米曲霉(Aspergillus oryzae),保藏編號為ATCC66222。
[0017]本發(fā)明的具體技術(shù)解決方案還有:
[0018]孢子懸液的制備應(yīng)屬于常規(guī)技術(shù)范疇，其中較為優(yōu)選的技術(shù)方案是:所述的步驟A包括如下工藝步驟:
[0019]Al、將米曲霉菌株轉(zhuǎn)接入查氏培養(yǎng)基上，在溫度為28 - 32°C條件下培養(yǎng)3_5天；
[0020]A2、將步驟Al中培養(yǎng)的菌株轉(zhuǎn)接麩曲培養(yǎng)基，在溫度為28 — 32°C條件下培養(yǎng)3_5天;
[0021]A3、用無菌水洗滌步驟A2制備的菌絲體，然后用脫脂棉過濾，濾液轉(zhuǎn)入滅菌后的種子罐中，加入無菌水調(diào)整孢子濃度，制成孢子懸液。
[0022]為保證固體發(fā)酵罐過程的順利進(jìn)行，接種過程優(yōu)選的技術(shù)方案如下，所述的步驟B中的接種步驟中工藝條件如下:
[0023]開啟攪拌，轉(zhuǎn)速為15-30轉(zhuǎn)/分，將步驟A中制備的孢子懸液按照孢子懸液:麩皮的質(zhì)量比為1%_8%的接種量接種至滅菌后的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，繼續(xù)攪拌5-15分鐘。
[0024]曲盤培養(yǎng)中優(yōu)選的培養(yǎng)條件是:步驟C中曲盤培養(yǎng)的溫度為28_32°C，濕度為45-75%，麩曲厚度l_4cm，培養(yǎng)時(shí)間為48-60小時(shí)。
[0025]步驟Al中培養(yǎng)優(yōu)選采用霉菌培養(yǎng)箱。
[0026]步驟A2中麩曲培養(yǎng)基采用麩皮:水的質(zhì)量比=1:0.8-1.1配制。
[0027]本發(fā)明所取得的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著技術(shù)進(jìn)步在于:
[0028]本發(fā)明前期采用了固體罐發(fā)酵，生產(chǎn)條件可根據(jù)需要調(diào)控，菌體生長速度快，發(fā)酵周期短，并且由于是原位滅菌，有效控制了雜菌污染，染菌率控制在1%以內(nèi)，提高了生產(chǎn)效率，采用本發(fā)明所生產(chǎn)的乳糖酶酶活最高可達(dá)320U/g。
【具體實(shí)施方式】
[0029]以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步描述，但不作為對本發(fā)明的限定，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求記載的內(nèi)容為準(zhǔn)，任何依據(jù)說明書做出的等效技術(shù)手段替換，均不脫離本發(fā)明的保護(hù)范疇。
[0030]實(shí)施例1
[0031]采用固體罐發(fā)酵制備米曲霉乳糖酶發(fā)酵曲的方法，包括如下工藝步驟:
[0032]A、孢子懸液的制備
[0033]將米曲霉菌株經(jīng)培養(yǎng)后制成濃度為I 一 5 X 107cfu/mL的孢子懸液；
[0034]B、固體罐發(fā)酵
[0035]將步驟A制備的孢子懸液接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，固體發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下單位重量份的組分組成:
[0036]麩皮I ;水 0.8 ;乳糖 0.05 ； (NH4) 2S040.005 ；MgS040.002 ；KH2PO40.005，聚丙二醇0.0008 ；
[0037]發(fā)酵溫度為28°C，濕度為45%，壓力為0.03MPa，空氣流量為1.0-2.0m3/min，每間隔4小時(shí)間歇攪拌5分鐘，攪拌轉(zhuǎn)速15轉(zhuǎn)/分；培養(yǎng)24-36小時(shí)；[0038]C、曲盤培養(yǎng)
[0039]當(dāng)步驟B中基質(zhì)菌絲體覆蓋率達(dá)到90%以上，出料轉(zhuǎn)至曲盤培養(yǎng)；曲盤培養(yǎng)至乳糖酶酶活不再提高或提高緩慢時(shí)結(jié)束培養(yǎng)；
[0040]所述的米曲霉菌株選用米曲霉(Aspergillus oryzae),保藏編號為ATCC66222。
[0041]所述的步驟A包括如下工藝步驟:
[0042]Al、將米曲霉菌株轉(zhuǎn)接入查氏培養(yǎng)基上，在溫度為28 - 32°C條件下培養(yǎng)3_5天；
[0043]A2、將步驟Al中培養(yǎng)的菌株轉(zhuǎn)接麩曲培養(yǎng)基，在溫度為28 — 32°C條件下培養(yǎng)3_5天;
[0044]A3、用無菌水洗滌步驟A2制備的菌絲體，然后用脫脂棉過濾，濾液轉(zhuǎn)入滅菌后的種子罐中，加入無菌水調(diào)整孢子濃度，制成孢子懸液。
[0045]所述的步驟B中的接種步驟中工藝條件如下:
[0046]開啟攪拌，轉(zhuǎn)速為15轉(zhuǎn)/分，將步驟A中制備的孢`子懸液按照孢子懸液:麩皮的質(zhì)量比為1%_8%的接種量接種至滅菌后的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，繼續(xù)攪拌5分鐘。
[0047]曲盤培養(yǎng)中優(yōu)選的培養(yǎng)條件是:步驟C中曲盤培養(yǎng)的溫度為28_32°C，濕度為45-75%，麩曲厚度l_4cm，培養(yǎng)時(shí)間為48-60小時(shí)。
[0048]步驟Al中培養(yǎng)優(yōu)選采用霉菌培養(yǎng)箱。
[0049]步驟A2中麩曲培養(yǎng)基采用麩皮:水的質(zhì)量比=1:0.8配制。
[0050]所制備的米曲霉乳糖酶酶活為265U/g。
[0051]實(shí)施例2
[0052]采用固體罐發(fā)酵制備米曲霉乳糖酶發(fā)酵曲的方法，包括如下工藝步驟:
[0053]A、孢子懸液的制備
[0054]將米曲霉菌株經(jīng)培養(yǎng)后制成濃度為I 一 5 X 107cfu/mL的孢子懸液；
[0055]B、固體罐發(fā)酵
[0056]將步驟A制備的孢子懸液接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，固體發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下單位重量份的組分組成:
[0057]麩皮I ;水 1.1 ;乳糖 0.15 ； (NH4)2SO40.015 ；MgS040.008 ；KH2PO40.01，聚丙二醇
0.0012 ；
[0058]發(fā)酵溫度為32°C，濕度為75%，壓力為0.05MPa，空氣流量為1.0-2.0m3/min，每間隔8小時(shí)間歇攪拌15分鐘，攪拌轉(zhuǎn)速30轉(zhuǎn)/分；培養(yǎng)24-36小時(shí)；
[0059]C、曲盤培養(yǎng)
[0060]當(dāng)步驟B中基質(zhì)菌絲體覆蓋率達(dá)到90%以上，出料轉(zhuǎn)至曲盤培養(yǎng)；曲盤培養(yǎng)至乳糖酶酶活不再提高或提高緩慢時(shí)結(jié)束培養(yǎng)；
[0061]所述的米曲霉菌株選用米曲霉(Aspergillus oryzae),保藏編號為ATCC66222。
[0062]步驟A2中麩曲培養(yǎng)基采用麩皮:水的質(zhì)量比=1:1.1配制。
[0063]其余內(nèi)容同實(shí)施例1。
[0064]所制備的米曲霉乳糖酶酶活為286U/g。
[0065]實(shí)施例3
[0066]采用固體罐發(fā)酵制備米曲霉乳糖酶發(fā)酵曲的方法，包括如下工藝步驟:
[0067]A、孢子懸液的制備[0068]將米曲霉菌株經(jīng)培養(yǎng)后制成濃度為I 一 5 X 107cfu/mL的孢子懸液；
[0069]B、固體罐發(fā)酵
[0070]將步驟A制備的孢子懸液接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，固體發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下單位重量份的組分組成:
[0071]麩皮I ;水 I ;乳糖 0.1 ; (NH4) 2S040.01 ；MgS040.00 5 ；KH2PO40.0075，聚丙二醇0.001 ；
[0072]發(fā)酵溫度為30°C，濕度為50%，壓力為0.035MPa，空氣流量為1.0-2.0m3/min，每間隔6小時(shí)間歇攪拌10分鐘，攪拌轉(zhuǎn)速20轉(zhuǎn)/分；培養(yǎng)24-36小時(shí)；
[0073]C、曲盤培養(yǎng)
[0074]當(dāng)步驟B中基質(zhì)菌絲體覆蓋率達(dá)到90%以上，出料轉(zhuǎn)至曲盤培養(yǎng)；曲盤培養(yǎng)至乳糖酶酶活不再提高或提高緩慢時(shí)結(jié)束培養(yǎng)；
[0075]所述的米曲霉菌株選用米曲霉(Aspergillus oryzae),保藏編號為ATCC66222。
[0076]步驟A2中麩曲培養(yǎng)基采用麩皮:水的質(zhì)量比=1:1配制。
[0077]其余內(nèi)容同實(shí)施例1。
[0078]所制備的米曲霉乳糖酶酶活為320U/g。
[0079]實(shí)施例4
[0080]采用固體罐發(fā)酵制備米曲霉乳糖酶發(fā)酵曲的方法，包括如下工藝步驟:
[0081]A、孢子懸液的制備
[0082]將米曲霉菌株經(jīng)培養(yǎng)后制成濃度為I 一 5 X 107cfu/mL的孢子懸液；
[0083]B、固體罐發(fā)酵
[0084]將步驟A制備的孢子懸液接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，固體發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下單位重量份的組分組成:
[0085]麩皮I ;水 I ;乳糖 0.12 ; (NH4) 2S040.01 ；MgS040.006 ；KH2PO40.008，聚丙二醇
0.001 ；
[0086]發(fā)酵溫度為28-32 °C，濕度為45_75%，壓力為0.03-0.05MPa,空氣流量為
1.0-2.0mVmin,每間隔4_8小時(shí)間歇攪拌5_15分鐘，攪拌轉(zhuǎn)速15-30轉(zhuǎn)/分；培養(yǎng)24-36小時(shí)；
[0087]C、曲盤培養(yǎng)
[0088]當(dāng)步驟B中基質(zhì)菌絲體覆蓋率達(dá)到90%以上，出料轉(zhuǎn)至曲盤培養(yǎng)；曲盤培養(yǎng)至乳糖酶酶活不再提高或提高緩慢時(shí)結(jié)束培養(yǎng)；
[0089]所述的米曲霉菌株選用米曲霉(Aspergillus oryzae),保藏編號為ATCC66222。
[0090]孢子懸液的制備應(yīng)屬于常規(guī)技術(shù)范疇，其中較為優(yōu)選的技術(shù)方案是:所述的步驟A包括如下工藝步驟:
[0091]Al、將米曲霉菌株轉(zhuǎn)接入查氏培養(yǎng)基上，在溫度為28 - 32°C條件下培養(yǎng)3_5天；
[0092]A2、將步驟Al中培養(yǎng)的菌株轉(zhuǎn)接麩曲培養(yǎng)基，在溫度為28 — 32°C條件下培養(yǎng)3_5天;
[0093]A3、用無菌水洗滌步驟A2制備的菌絲體，然后用脫脂棉過濾，濾液轉(zhuǎn)入滅菌后的種子罐中，加入無菌水調(diào)整孢子濃度，制成孢子懸液。
[0094]步驟A2中麩曲培養(yǎng)基采用麩皮:水的質(zhì)量比=1:0.8配制。其余內(nèi)容同實(shí)施例1。[0095]所制備的米曲霉乳糖酶酶活為304U/g。
[0096]實(shí)施例5
[0097]采用固體罐發(fā)酵制備米曲霉乳糖酶發(fā)酵曲的方法，包括如下工藝步驟:
[0098]A、孢子懸液的制備
[0099]將米曲霉菌株經(jīng)培養(yǎng)后制成濃度為I 一 5 X 107cfu/mL的孢子懸液；
[0100]B、固體罐發(fā)酵
[0101]將步驟A制備的孢子懸液接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，固體發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下單位重量份的組分組成:
[0102]麩皮I ;水 1.1 ;乳糖 0.15 ； (NH4)2SO40.01 ；MgS040.0026 ;ΚΗ2Ρ040.008，聚丙二醇0.001 ；
[0103]發(fā)酵溫度為30°C，濕度為60%，壓力為0.05MPa，空氣流量為1.0-2.0m3/min，每間隔6小時(shí)間歇攪拌10分鐘，攪拌轉(zhuǎn)速25轉(zhuǎn)/分；培養(yǎng)24-36小時(shí)；
[0104]C、曲盤培養(yǎng)
[0105]當(dāng)步驟B中基質(zhì)菌絲體覆蓋率達(dá)到90%以上，出料轉(zhuǎn)至曲盤培養(yǎng)；曲盤培養(yǎng)至乳糖酶酶活不再提高或提高緩慢時(shí)結(jié)束培養(yǎng)；
[0106]所述的米曲霉菌株選用米曲霉(Aspergillus oryzae),保藏編號為ATCC66222。
[0107]步驟A2中麩曲培養(yǎng)基采用麩皮:水的質(zhì)量比=1:1.1配制。
[0108]其余內(nèi)容同實(shí)施例1。
[0109]所制備的米曲霉乳糖酶酶活為312U/g。
【權(quán)利要求】
1.采用固體罐發(fā)酵制備米曲霉乳糖酶發(fā)酵曲的方法，其特征在于包括如下工藝步驟: A、孢子懸液的制備 將米曲霉菌株經(jīng)培養(yǎng)后制成濃度為I 一 5X107cfu/mL的孢子懸液； B、固體罐發(fā)酵 將步驟A制備的孢子懸液接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，固體發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下單位重量份的組分組成:
麩皮1 ;水 0.8-1.1 ;乳糖 0.05-0.15 ； (NH4) 2S040.00 5-0.0 1 5 ；MgS040.00 2-0.008 ；KH2PO40.005-0.01，聚丙二醇 0.0008-0.0012 ； 發(fā)酵溫度為28-32°C，濕度為45-75%，壓力為0.03-0.05MPa,空氣流量為1.0-2.0m3/分，每間隔4-8小時(shí)間歇攪拌5-15分鐘，攪拌轉(zhuǎn)速15-30轉(zhuǎn)/分；培養(yǎng)24-36小時(shí)； C、曲盤培養(yǎng) 當(dāng)步驟B中基質(zhì)菌絲體覆蓋率達(dá)到90%以上，出料轉(zhuǎn)至曲盤培養(yǎng)；曲盤培養(yǎng)至乳糖酶酶活不再提高或提高緩慢時(shí)結(jié)束培養(yǎng)； 所述的米曲霉菌株選用米曲霉ATCC66222。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用固體罐發(fā)酵制備米曲霉乳糖酶發(fā)酵曲的方法，其特征在于所述的步驟A包括如下工藝步驟: Al、將米曲霉菌株轉(zhuǎn)接入查氏 培養(yǎng)基上，在溫度為28 - 32°C條件下培養(yǎng)3-5天； A2、將步驟Al中培養(yǎng)的菌株轉(zhuǎn)接麩曲培養(yǎng)基，在溫度為28 - 32°C條件下培養(yǎng)3_5天； A3、用無菌水洗滌步驟A2制備的菌絲體，然后用脫脂棉過濾，濾液轉(zhuǎn)入滅菌后的種子罐中，加入無菌水調(diào)整孢子濃度，制成孢子懸液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用固體罐發(fā)酵制備米曲霉乳糖酶發(fā)酵曲的方法，其特征在于所述的步驟B中的接種步驟中工藝條件如下: 開啟攪拌，轉(zhuǎn)速為15-30轉(zhuǎn)/分，將步驟A中制備的孢子懸液按照孢子懸液:麩皮的質(zhì)量比為1%_8%的接種量接種至滅菌后的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，繼續(xù)攪拌5-15分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用固體罐發(fā)酵制備米曲霉乳糖酶發(fā)酵曲的方法，其特征在于所述的步驟C中曲盤培養(yǎng)的溫度為28-32°C，濕度為45-75%，麩曲厚度l_4cm，培養(yǎng)時(shí)間為48-60小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的采用固體罐發(fā)酵制備米曲霉乳糖酶發(fā)酵液的方法，其特征在于所述的步驟Al中培養(yǎng)采用霉菌培養(yǎng)箱。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的采用固體罐發(fā)酵制備米曲霉乳糖酶發(fā)酵曲的方法，其特征在于所述的步驟A2中麩曲培養(yǎng)基采用麩皮:水的質(zhì)量比=1:0.8-1.1配制。
【文檔編號】C12R1/69GK103555692SQ201310519860
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】趙從波, 章淑艷, 馬清河, 李賓, 王云鵬, 李軍, 韓韜, 羅同陽, 秦艷梅, 劉麗娜 申請人:河北省微生物研究所