一株利用生物質(zhì)原料為碳源高產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一株利用生物質(zhì)原料為碳源高產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳桿菌及其應(yīng)用，屬于微生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明公開了一株利用生物質(zhì)原料為碳源高產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳桿菌，其分類命名為乳桿菌（Lactobacillussp.）PZW0001，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC?NO:M2013438。并公開了用所述乳桿菌CCTCC?NO:M2013438生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法，利用富含半纖維素和/或纖維素的生物質(zhì)原料的水解液為碳源發(fā)酵生產(chǎn)，所述乳桿菌經(jīng)MRS液體培養(yǎng)基二次活化后，以5%的接種量接種于MRS-G培養(yǎng)基中，靜態(tài)發(fā)酵72-96h。本發(fā)明用富含纖維素和/或半纖維素的生物質(zhì)原料的水解液代替乳桿菌通用培養(yǎng)基MRS中的葡萄糖，并在培養(yǎng)基中添加一定量的谷氨酸鈉，使γ-氨基丁酸產(chǎn)量達(dá)46.16g/L。
【專利說明】一株利用生物質(zhì)原料為碳源高產(chǎn)Y-氨基丁酸的乳桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明一株利用生物質(zhì)原料為碳源高產(chǎn)Y-氨基丁酸的乳桿菌及其應(yīng)用，具體涉及一株高產(chǎn)Y-氨基丁酸的乳桿菌及利用該菌株以富含纖維素和/或半纖維素的植物原料的水解液為碳源發(fā)酵生產(chǎn)Y -氨基丁酸的方法，屬于微生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]Y -氨基丁酸(Y-aminobutyric acid,簡(jiǎn)稱GABA)是一種在自然界中廣泛存在并具有重要的生理功能的非蛋白類氨基酸。在人體中GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中三大抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之一，具有緩解焦慮、降低血壓、安眠鎮(zhèn)定等生理功效，在醫(yī)療保健方面有廣泛的應(yīng)用前景。
[0003]GABA的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、植物富集法和微生物發(fā)酵法。與前兩者相比，后者因條件溫和，安全性好，設(shè)備要求相對(duì)簡(jiǎn)單，不受原料、環(huán)境和空間的限制等，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GABA的原理是利用微生物自身或基因工程手段引入的外援的谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase, GAD, EC 4.1.1.15),催化谷氨酸或谷氨酸鈉脫羧生成Y-氨基丁酸。此外，在眾多微生物中，乳酸菌具有安全性佳、GABA可大量分泌且不被降解的優(yōu)勢(shì)，在藥品功能性食品的開發(fā)方面具有巨大潛力。
[0004]木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)原料是世界上最豐富的可再生的資源，利用木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)原料發(fā)酵得到具有高價(jià)值的產(chǎn)物的研究具有很高的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)意義。木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)主要包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。纖維素是由葡萄糖以β_1，4-糖苷鍵連接的大分子多糖，分布廣泛，占植物界碳含量的50%以上。而半纖維素含量?jī)H次于纖維素，一般由較短且高度分支的雜多糖組 成，不同物料、同一物料的不同部分的半纖維素的單元組成和結(jié)構(gòu)相差較大，其中木糖分布較為穩(wěn)定，約占50%以上。
[0005]目前生物質(zhì)原料在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用多集中于乙醇、木糖醇、乳酸等領(lǐng)域，尚無用于GABA生產(chǎn)的報(bào)道。目前除少數(shù)GABA功能性乳制品利用乳酸菌在其發(fā)酵過程中同步利用乳糖生產(chǎn)極少量GABA之外，供給高產(chǎn)GABA的微生物生長(zhǎng)碳源的報(bào)道僅限于葡萄糖。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的是提供一種能夠以富含纖維素和/或半纖維素的生物質(zhì)原料的水解液為碳源發(fā)酵生產(chǎn)GABA的乳桿菌，以及該菌株利用纖維素和/或半纖維素的生物質(zhì)原料的水解液為碳源發(fā)酵生產(chǎn)GABA的方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種利用生物質(zhì)原料為碳源高產(chǎn)Y-氨基丁酸的乳桿菌，其分類命名為乳桿菌(Lactobacillus sp.) PZW0001，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO: M 2013438。所述乳桿菌CCTCC NO:M 2013438，是從發(fā)酵香腸中分離得到的天然菌株，為兼性厭氧型，革蘭氏染色呈陽性，桿菌。該菌株可高效轉(zhuǎn)化谷氨酸或谷氨酸鈉生成GABA，以生物質(zhì)原料水解液為碳源生長(zhǎng)良好。[0008]用所述的乳桿菌CCTCC NO: M 2013438生產(chǎn)Y -氨基丁酸的方法，利用富含半纖維素和/或纖維素的生物質(zhì)原料的水解液為碳源發(fā)酵生產(chǎn)，所述乳桿菌經(jīng)MRS液體培養(yǎng)基二次活化后，以5%的接種量接種于MRS-G培養(yǎng)基中，靜態(tài)發(fā)酵72-96h ；
MRS-G培養(yǎng)基配方以w/v計(jì)為:全部糖組分為2%的生物質(zhì)原料水解液，蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，牛肉浸膏1%，無水乙酸鈉0.3%，檸檬酸三銨0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，無水硫酸鎂0.01%, 一水硫酸錳0.025 %，吐溫80 0.1%，適量的一水合谷氨酸鈉，以蒸餾水配制。
[0009]本發(fā)明的有益效果:提供了一種以富含半纖維素和/或纖維素的植物原料的水解液為碳源發(fā)酵生產(chǎn)GABA的方法。富含纖維素和/或半纖維素的生物質(zhì)原料的水解液代替乳桿菌通用培養(yǎng)基MRS中的葡萄糖，并在培養(yǎng)基中添加一定量的谷氨酸鈉，以5%的接種量接種于MRS-G培養(yǎng)基中，靜態(tài)發(fā)酵72-96 h，GABA產(chǎn)量達(dá)46.16 g/L。
[0010]生物材料樣品保藏:一種利用生物質(zhì)原料為碳源高產(chǎn)Y-氨基丁酸的乳桿菌，其分類命名為乳桿菌(Lactobacillus sp.) PZW0001,已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,簡(jiǎn)稱CCTCC，地址:中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC NO: M 2013438。保藏日期2013年9月21日。
【具體實(shí)施方式】
[0011]實(shí)施例1高產(chǎn)Y-氨基丁酸的發(fā)酵乳桿菌的篩選方法 將發(fā)酵食品中篩選得到的乳桿菌，在添加1% MSG的MRS-G培養(yǎng)基中發(fā)酵72 h，取1_2μ L發(fā)酵液，用紙層析法對(duì)GABA產(chǎn)生菌進(jìn)行初步篩選。以5%的GABA和5%的MSG溶液作為對(duì)照，GABA生產(chǎn)菌在GABA標(biāo)樣對(duì)應(yīng)位點(diǎn)出現(xiàn)有紫紅的斑點(diǎn)。
[0012]MRS-G培養(yǎng)基配方:葡萄糖2% (w/v，下同)，蛋白胨1%，酵母提取物0.5 %，牛肉浸膏1%，無水乙酸鈉0.3%，檸檬酸三銨0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，無水硫酸鎂0.01 %，一水硫酸錳0.025%,吐溫80 0.1%，谷氨酸鈉(MSG) 1%，以蒸餾水配制。
[0013]實(shí)施例2以玉米芯稀酸水解液為碳源發(fā)酵生產(chǎn)GABA
將干燥的玉米芯粉碎粒度至20-40目，和0.5%的稀硫酸按照1:6~1:10的質(zhì)量體積比加入反應(yīng)釜中，110°C高溫水解1.5 h ;所得水解液離心過濾，除去不溶性雜質(zhì)。再用NaOH將水解液PH調(diào)整到6.5 ;50°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮水解液2至3倍。濃縮后的水解液121°C20 min滅菌備用。
[0014]MRS-G平板上挑取的單菌落，經(jīng)MRS液體培養(yǎng)基二次活化后，以5%的接種量分別接種于含不同含量MSG的MRS-G發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵72 h。
[0015]MRS-G培養(yǎng)基配方:全部糖組分為2%(w/v,下同)的生物質(zhì)原料水解液,蛋白胨1%,酵母提取物0.5%，牛肉浸膏1%，無水乙酸鈉0.3%，檸檬酸三銨0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，無水硫酸鎂0.01%, 一水硫酸錳0.025%,吐溫80 0.1%，適量的一水合谷氨酸鈉(MSG)，以蒸餾水配制。
[0016]當(dāng)MSG添加量為6 %時(shí)，GABA產(chǎn)量為34.02 g/1，MSG轉(zhuǎn)化率達(dá)93.5 % ;當(dāng)MSG添加量為10 %時(shí)，GABA產(chǎn)量46.16 g/1, MSG轉(zhuǎn)化率達(dá)83.8 %。
[0017]實(shí)施例3以玉米秸桿水解液為碳源發(fā)酵生產(chǎn)GABA 將干燥玉米秸桿粉碎粒度至20-40目，75%濃硫酸常溫處理30 min后，4%稀硫酸110°C高溫處理I h。再用NaOH將水解液pH調(diào)整到6.5 ;50°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮水解液2至3倍。濃縮后的水解液121°C 20 min滅菌備用。
[0018]發(fā)酵方式與實(shí)施例2相同，MSG添加量為10%時(shí)，GABA產(chǎn)量可達(dá)43.28 g/L，MSG轉(zhuǎn)化率為78 .6 %。
【權(quán)利要求】
1.一株利用生物質(zhì)原料為碳源高產(chǎn)Y-氨基丁酸的乳桿菌，其分類命名為乳桿菌(Lactobacillus sp.)PZW0001，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2013438。
2.用權(quán)利要求1所述的乳桿菌CCTCCNO: M 2013438生產(chǎn)Y-氨基丁酸的方法，其特征在于利用富含半纖維素和/或纖維素的生物質(zhì)原料的水解液為碳源發(fā)酵生產(chǎn)，所述乳桿菌經(jīng)MRS液體培養(yǎng)基二次活化后，以5%的接種量接種于MRS-G培養(yǎng)基中，靜態(tài)發(fā)酵72-96h ；MRS-G培養(yǎng)基配方以w/v計(jì)為:全部糖組分為2%的生物質(zhì)原料水解液，蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，牛肉浸膏1%，無水乙酸鈉0.3%，檸檬酸三銨0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，無水硫酸鎂0.01%, 一水硫酸錳0.025 %，吐溫80 0.1%，適量的一水合谷氨酸鈉，以蒸餾水配制。
【文檔編號(hào)】C12P13/00GK103525740SQ201310519881
【公開日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月30日
【發(fā)明者】王小元, 趙安琪, 胡曉清, 潘露 申請(qǐng)人:江南大學(xué)