一種重組豬干擾素α1基因工程菌的高密度發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種重組豬干擾素α1基因工程菌的高密度發(fā)酵方法，屬于發(fā)酵工程【技術領域】。采用自行構建并表達rPoIFNα1的重組大腸埃希菌BL21/pET-32a-rPoIFNα1作為生產(chǎn)菌種，在37℃發(fā)酵2~3h后，按每升發(fā)酵液一次性添加濃度為50g/L~100g/L的誘導劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)后，再32℃培養(yǎng)4~5h結束此過程。本發(fā)酵方法可以實現(xiàn)rPoIFNα1的高效表達，目的蛋白表達量占菌體總蛋白的40%以上，效價高達1×106IU/ml以上，且為可溶性蛋白，避免了包涵體表達需要變復性難題，縮短了生產(chǎn)周期，為rPoIFNα1的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅實基礎。
【專利說明】—種重組豬干擾素α1基因工程菌的高密度發(fā)酵方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明主要涉及一種重組豬干擾素α I基因工程菌的高密度發(fā)酵方法，屬于發(fā)酵過程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]干擾素(interferon，IFN)是病毒感染誘導機體產(chǎn)生的一種具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和具有免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)，主要通過抑制病毒基因轉錄和降解病毒RNA來抑制病毒的生長繁殖及發(fā)揮抗腫瘤的活性。按照干擾素的產(chǎn)生細胞、生化特征及在機體免疫方面所發(fā)揮的作用不同，分為α、β、Υ三類。α型干擾素在體內(nèi)外能發(fā)揮廣譜、高效抗病毒作用的機制主要是抑制病毒蛋白質(zhì)的合成，并能選擇性地作用于受感染細胞，且在使用后無任何藥物殘留。目前全球已有60多個國家和地區(qū)應用人基因工程重組干擾素制劑治療大約30多種病毒性疾病。
[0003]動物用干擾素的研究目前已得到不少成果，畜牧業(yè)生產(chǎn)上的研究及應用已受到高度關注。最早在國內(nèi)應用于獸醫(yī)臨床的是動物白細胞干擾素，由于這種干擾素需采用生化分離的方法獲得，工藝成本高，規(guī)?；a(chǎn)困難等。而基因工程技術的發(fā)展為動物用干擾素大量生產(chǎn)提供了新的平臺。自1986年Lefevre首次克隆出豬α干擾素(porcineinterferon alpha,PoIFNα )基因以來,迄今已有多種獸用干擾素基因被克隆、表達和進行生物學功能研究。我室采用基因工程技術獲得了一種重組豬干擾素α(重組豬α干擾素的制備方法，專利號2008100201804)，臨床試用結果表明其可有效治療豬病毒性腹瀉等疾病。
[0004]目前基因工程重組豬干擾素α規(guī)?；l(fā)酵生產(chǎn)技術存在如下問題:1)表達的豬干擾素α蛋白多是以無活性的包涵體形式存在，必須在純化過程中增加變復性步驟，既增加了生產(chǎn)成本，又影響了蛋白質(zhì)生物學活性；2)基因工程重組豬干擾素0表達量低，效價不高難以達到產(chǎn)業(yè)化要求。
[0005]本發(fā)明以自行構建的重組大腸埃希菌BL21/ PET-32a-rPoIFNa I作為生產(chǎn)菌種，采用本發(fā)酵方法，在發(fā)酵細菌破碎上清中獲得目的蛋白，不產(chǎn)生包涵體，省去了包涵體變性、復性等步驟，最大程度上保證了 rPoIFNa I生物學活性，并采用超濾濃縮技術粗純蛋白，縮短了生產(chǎn)周期。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的就是為了彌補已有技術的缺陷，提供一種。
[0007]本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的:
一種重組豬干擾素a I基因工程菌的高密度發(fā)酵方法，包括以下步驟:
(1)種子菌培養(yǎng):將-18-_20°C保存的工作種子菌的菌種接種種子培養(yǎng)基中，使用回轉恒溫調(diào)速搖床進行培養(yǎng)；控制轉速215~220r/min，培養(yǎng)溫度37°C，初始pH值6.8^7.2，培養(yǎng)時間9.5~IOh ；
(2)發(fā)酵:將培養(yǎng)好的種子液按接種量f2%接入發(fā)酵罐進行發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基量為18^22L,即向發(fā)酵罐中通入無菌空氣，通氣量為1.4~1.6L/min,保持發(fā)酵罐內(nèi)的含氧量在10~20%，設定培養(yǎng)溫度35~38°C，機械攪拌轉速為210~230r/min，加入2~4mol/L的氨水，控制發(fā)酵pH在7.0-7.1 ；
(3)補料:發(fā)酵2~3h，紫外分光光度儀測定OD600為0.4~1.0后，每隔一小時添加蛋白胨20~l00g，酵母粉l0~40g，葡萄糖5~20g，(NH4)2SO4 1~5g，添加2~4次；
(4)誘導:補料2~3h后，紫外分光光度儀測定0D600為1.0時，一次性添加濃度為50~l00g/L異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)補料液5-40ml，蛋白胨10_50g，酵母粉l0~50g，甘油20~l00ml，(NH4)2SO4 2~10g，然后將溫度調(diào)至32°C進行目的蛋白的誘導表達4~6h ；
(5)革蘭染色及菌體濕重的測定:誘導表達4~6h后，發(fā)酵結束，收集菌液，經(jīng)革蘭染色初步檢測菌體形態(tài)，并在轉速為7000r/min，溫度為4°C的條件下離心12~16min后，取菌體沉淀物，測定菌體濕重，范圍應在0.0200~0.0250g/ml ；
(6)第一次離心:在轉速為7000r/min，溫度為4°C的條件下離心13~16min后留取菌體沉淀；
(7)重懸沉淀的菌體:重懸時每100g濕重菌體加1L的1XPBS(NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L, Na2HPO4 2.9g/L, KH2PO4 0.2g/L)；
(8)破碎菌體:用機械破碎的方法，破碎時用800bar的壓力連續(xù)對菌體沖撞3_4遍，經(jīng)革蘭氏染色，檢測破菌率達到95%以上；
(9)第二次離心:在轉速為12000r/min，溫度為4°C的條件下離心14~16min后取上清
液；
(10)超濾濃縮:將第二次離心得到的上清液使用0.22 μ m孔徑的膜包進行超濾收集通過膜包的下游液體，再用30kD孔徑的膜包進行10倍濃縮，收集未通過膜包的上游液體，即為rPoIFNa I的粗制品。
所述種子培養(yǎng)基的組成為:工業(yè)級蛋白胨1-lOg/L，工業(yè)級酵母粉1~5g/L，NaCl1~10g/L, ρΗ5.1~7.1。
[0008]所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:工業(yè)級蛋白胨1~10g/L，工業(yè)級酵母粉1~5g/L，葡萄糖
0.1-1g/L, NaCl 1~10g/L，甘油 0.1~3.33ml/L,消泡劑 0.01-0.33ml/L。
[0009]本發(fā)明的優(yōu)點是:
本發(fā)酵方法可以實現(xiàn)rPoIFNa 1的高效表達，目的蛋白表達量占菌體總蛋白的40%以上，效價高達1 X 1061U/ml以上，且為可溶性蛋白，避免了包涵體表達需要變復性難題，縮短了生產(chǎn)周期，為rPoIFNa 1的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅實基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1:發(fā)酵結束的工程菌菌液革蘭染色結果(X1000)
圖2:工程菌菌液破碎后革蘭染色結果(X1000)
圖 3: rPoIFNa 1 SDS-PAGE 檢測結果 M:蛋白分子標準；
泳道1:本工藝發(fā)酵生產(chǎn)rPoIFNa 1I工程菌總蛋白；
泳道2:本工藝發(fā)酵生產(chǎn)rPoIFNa 1工程菌包涵體蛋白；
泳道3:本工藝發(fā)酵生產(chǎn)rPoIFNa 1工程菌細菌破碎上清蛋白；泳道4:BL21空菌總蛋白對照。
【具體實施方式】
[0011]實施例1
(1)種子菌培養(yǎng):將-20°C保存的工作種子菌的菌種接種種子培養(yǎng)基中，使用回轉恒溫調(diào)速搖床進行培養(yǎng)；控制轉速220r/min，培養(yǎng)溫度37°C，初始pH值7.1，培養(yǎng)時間IOh ；
(2)發(fā)酵:將培養(yǎng)好的種子液按接種量1%接入30L發(fā)酵罐進行發(fā)酵(發(fā)酵培養(yǎng)基量20L)，即向發(fā)酵罐中通入無菌空氣，通氣量1.5L/min,保持發(fā)酵罐內(nèi)的含氧量在10~20%，設定培養(yǎng)溫度37 °C，機械攪拌轉速為220r/min，流加3mol/L氨水控制發(fā)酵pH在7.0~
7.1 ；
(3)補料:發(fā)酵2~3h，紫外分光光度儀測定OD6tltl為0.4~1.0后，每隔一小時添加蛋白胨20~100g，酵母粉10~40g，葡萄糖5~20g, (NH4) 2S04 I~5g,添加3次；
(4)誘導:補料2~3h后，紫外分光光度儀測定OD6tltl為1.0時，一次性添加濃度為50~100g/L異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)補料液5~40ml，蛋白胨10~50g，酵母粉10~50g，甘油20~100ml，(NH4)2SO4 2~10g，然后將溫度調(diào)至32°C進行目的蛋白的誘導表達4~6h ；
(5)革蘭染色及菌體濕重的測定:誘導表達4~6h后，發(fā)酵結束，收集菌液，經(jīng)革蘭染色初步檢測菌體形態(tài)(如圖1所示)，并在轉速為7000r/min，溫度為4°C的條件下離心15min后，取菌體沉淀物，測定菌體濕重，范圍應在0.0200~0.0250g/ml ；
(6)第一次離心:在轉速為700 0r/min，溫度為4°C的條件下離心15min后留取菌體沉
淀；
(7)重懸沉淀的菌體:重懸時每100g濕重菌體加IL的IXPBS(NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L, Na2HPO4 2.9g/L, KH2PO4 0.2g/L)；
(8)破碎菌體:用機械破碎的方法，破碎時用800bar的壓力連續(xù)對菌體沖撞3遍，經(jīng)革蘭氏染色，檢測破菌率達到95%以上(如圖2所示)；
(9)第二次離心:在轉速為12000r/min，溫度為4°C的條件下離心15min后取上清液；
(10)膜包超濾濃縮:將第二次離心得到的上清液使用0.22 μ m孔徑的膜包進行超濾收集通過膜包的下游液體，再用30kD孔徑的膜包進行10倍濃縮，收集未通過膜包的上游液體，即為rPoIFNa I的粗制品。
[0012](ll)rPoIFNa I粗制品的總蛋白含量的測定:采用Lowry法測定總蛋白含量為
4~5mg/ml ；
(12)rPoIFNa I粗制品的目的蛋白含量測定:采用非還原性SDS-PAGE電泳法測定目的蛋白表達量占菌體總蛋白的40%以上(如圖3所示)；
(13)rPoIFNa I粗制品的效價測定:
材料:rhIFN a I國豕標準品:購自中國食品藥品檢定研究院，干擾素ct I國豕標準品；細胞:人傳代羊膜細胞(WISH)和人喉癌傳代細胞(Hep-2)均由中國科學院上海細胞所提供；病毒:攻擊病毒為水皰性口炎病毒(VSV)。
[0013]測定方法:微量細胞病變抑制法，用rhIFNa I國家標準品為對照，檢測出生產(chǎn)的rPoIFNa I粗制品效價可達到lX106IU/ml以上。
【權利要求】
1.一種重組豬干擾素α I基因工程菌的高密度發(fā)酵方法，其特征在于包括以下步驟: (1)種子菌培養(yǎng):將_18'20°C保存的工作種子菌的菌種接種種子培養(yǎng)基中，使用回轉恒溫調(diào)速搖床進行培養(yǎng)；控制轉速215~220r/min，培養(yǎng)溫度36~38°C，初始pH值6.8^7.2，培養(yǎng)時間9.5~IOh ； (2)發(fā)酵:將培養(yǎng)好的種子液按接種量1-2%接入發(fā)酵罐進行發(fā)酵,發(fā)酵培養(yǎng)基量為.18^22L,即向發(fā)酵罐中通入無菌空氣，通氣量為1.r1.6L/min,保持發(fā)酵罐內(nèi)的含氧量在.10~20%，設定培養(yǎng)溫度37°C，機械攪拌轉速為21(T230r/min，加入2~4mol/L的氨水，控制發(fā)酵pH在7.0~7.I ； (3)補料:發(fā)酵2~3h，紫外分光光度儀測定OD6tltl為0.Π.0后，每隔一小時添加蛋白胨.2(Tl00g，酵母粉l(T40g，葡萄糖5~20g，(NH4)2SO4 I~5g，添加2~4次； (4)誘導:補料2~3h后，紫外分光光度儀測定0D_為1.0時，一次性添加濃度為.5(Tl00g/L異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)補料液5~40ml，蛋白胨l(T50g，酵母粉l(T50g，甘油2(Tl00ml，(NH4)2SO4 2~10g，然后將溫度調(diào)至32°C進行目的蛋白的誘導表達4~6h ； (5)革蘭染色及菌體濕重的測定:誘導表達4~6h后，發(fā)酵結束，收集菌液，經(jīng)革蘭染色初步檢測菌體形態(tài)，并在轉速為7000r/min，溫度為4°C的條件下離心12~16min后，取菌體沉淀物，測定菌體濕重，范圍應在0.0200^0.0250g/ml ； (6)第一次離心:在轉速為7000r/min，溫度為4°C的條件下離心13~16min后留取菌體沉淀； (7)重懸沉淀的菌體:重懸時每100g濕重菌體加IL的IXPBS(NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L, Na2HPO4 2.9g/L, KH2PO4 0.2g/L)； (8)破碎菌體:用機械破碎的方法，破碎時用800bar的壓力連續(xù)對菌體沖撞3~4遍，經(jīng)革蘭氏染色，檢測破菌率達到95%以上； (9)第二次離心:在轉速為12000r/min，溫度為4°C的條件下離心14~16min后取上清液； (10)超濾濃縮:將第二次離心得到的上清液使用0.22 μ m孔徑的膜包進行超濾收集通過膜包的下游液體，再用30kD孔徑的膜包進行10倍濃縮，收集未通過膜包的上游液體，即為rPoIFNa I的粗制品。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種重組豬干擾素aI基因工程菌的高密度發(fā)酵方法方法，其特征在于所述種子培養(yǎng)基的組成為:工業(yè)級蛋白胨f 10g/L，工業(yè)級酵母粉f5g/L，NaClTlOg/L, ρΗ5.1~7.1。
3.根據(jù)權利要求1所述的重組豬干擾素αI基因工程菌的高密度發(fā)酵方法方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為:工業(yè)級蛋白胨f 10g/L，工業(yè)級酵母粉I飛g/L，葡萄糖.0.rig/L, NaCl I~10g/L，甘油 0.1~3.33ml/L,消泡劑 0.θ1~θ.33ml/L。
【文檔編號】C12P21/02GK103589769SQ201310526159
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年10月29日 優(yōu)先權日:2013年10月29日
【發(fā)明者】王明麗, 趙俊, 陳琨 申請人:王明麗, 趙俊