Rga法檢測重組人促紅細胞生成素生物學活性的制作方法
【專利摘要】一種新的重組人促紅細胞生成素(Recombinant?Human?Erythropoietin，rhEPO)生物活性測定方法。它的基本原理是：利用STAT5的反應(yīng)元件(sis?inducible?element，SIE；the?gamma?response?region，GRR；the?interferon?γ-activated?sequence，GAS)構(gòu)建報告基因載體，轉(zhuǎn)染UT-7細胞，加壓篩選和單克隆分離培養(yǎng)得到穩(wěn)定單克隆細胞株UT-7／G7。rhEPO與配體結(jié)合后，經(jīng)過一系列信號轉(zhuǎn)導，激活報告基因螢光素酶的表達，通過檢測rhEPO刺激后螢光素酶表達的變化來對rhEPO活性進行定量。具體檢測步驟為：UT-7／G7細胞用DPBS洗3次后，分析培養(yǎng)基培養(yǎng)17-20小時，以60,000個／孔鋪96孔板，加入系列濃度的rhEPO，作用4h，檢測螢光素酶活性。該方法操作簡單，反應(yīng)靈敏，變異性小，對于rhEPO的質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用具有重要意義。
【專利說明】RGA法檢測重組人促紅細胞生成素生物學活性
【技術(shù)領(lǐng)域】:
[0001]本發(fā)明涉及生物藥物活性檢測領(lǐng)域，針對重組人促紅細胞生成素(rhEPO)的生物學活性測定建立了一種更加快速、準確的報告基因定量方法(report gene assay, RGA)。
【背景技術(shù)】:
[0002]重組人促紅細胞生成素(rhEPO)是一種應(yīng)用基因工程技術(shù)，將人的促紅細胞生成素基因轉(zhuǎn)入哺乳動物細胞內(nèi)，高效表達的能夠刺激紅細胞生成的糖蛋白類激素，用于治療慢性腎功能衰竭和癌癥化療產(chǎn)生的貧血。目前常用的活性測定方法為網(wǎng)織紅細胞計數(shù)法和MTT法，網(wǎng)織紅細胞計數(shù)法需要用小鼠，涉及到動物福利問題，而且實驗操作復雜，實驗結(jié)果變異性大；MTT法實驗周期為4天，操作復雜。rhEPO生物學效應(yīng)的發(fā)揮是通過與EPOR結(jié)合，激活JAK2,進而激活STAT5轉(zhuǎn)錄因子,后者與其DNA反應(yīng)元件(sis inducible element,SIE ；the gamma response region,GRR:the interferon y-activated sequence,GAS)結(jié)合，激活下游基因的轉(zhuǎn)錄。報告基因法(report gene assay,RGA)是一種快速、簡便的檢測方法，利用藥物作用后報告基因表達的變化來反映藥物的活性。結(jié)合rhEPO的具體作用機制和RGA的優(yōu)勢，我們將報告基因質(zhì)粒(Importer gene, R-G)轉(zhuǎn)染UT-7細胞，建立了一種更加簡便，低成本的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】
:
[0003]1.發(fā)明目的:
[0004]建立一種更加快速，簡便，準確客觀的rhEPO活性測定報告基因法，促進該產(chǎn)品的研究開發(fā)，質(zhì)量控制以及臨床應(yīng)用。
[0005]2.技術(shù)方案:
[0006]本發(fā)明通過將STAT5反應(yīng)元件(SIE，GRR，GAS)構(gòu)建報告基因質(zhì)粒(Importergene, R-G)轉(zhuǎn)染UT_7細胞，并加壓篩選分離培養(yǎng)出單克隆細胞株，再建立相應(yīng)的檢測方法來對rhEPO活性進行定量。其技術(shù)流程為:UT-7 / R-G細胞株的建立(報告基因載體單克隆細胞株)一RGA測定方法建立及方法學驗證。
[0007]3.有益效果:
[0008]該檢測方法的建立有利于rhEPO藥品的研究開發(fā)，質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用，具有較高的應(yīng)用價值。
[0009]通過與現(xiàn)有的方法比較，有如下優(yōu)點:
[0010](I)成本較低，不需要進行動物實驗；
[0011]⑵操作簡單 ；
[0012](3)周期短，可以在24h內(nèi)完成全部實驗；
[0013](4)結(jié)果客觀可靠，準確度高，變異小。
【專利附圖】

【附圖說明】:[0014]圖1-1單克隆細胞株的反應(yīng)性
[0015]圖2-1 rhEPO不同稀釋比例
[0016]圖2-2不同細胞密度的比較
[0017]圖2-3 rhEPO不同作用時間的比較
[0018]圖3-1樣品I的回收率檢測
【具體實施方式】:
[0019]1.材料與方法:
[0020]1.1研究對象:重組人促紅細胞生成素
[0021]1.2pGL4.26 載體:購買于 Promega。
[0022]UT-7 細胞:購買于 ATCC。
[0023]rhEPO標準品與樣品:中國食品藥品檢定研究院重組藥物室留存。
[0024]1.3 試劑:
[0025]生長培養(yǎng)基:MDM(GIBC0，#12440)+10% 胎牛血清(GIBCO，#10099)+1 % 雙抗(GIBC0, #15240)
[0026]潮霉素:Amresco,K547
[0027]HEPES:GIBC0,15630
[0028]白色底部透光96孔板:C0RNING，3903
[0029]選擇培養(yǎng)基:生長培養(yǎng)基+500 μ g / ml潮霉素
[0030]分析培養(yǎng):無酚紅RPM1-1640 (GIBC0, #11835) 500ml+5ml 胎牛血清 +6ml HEPES
[0031]熒光素酶底物:Promega，E2650
[0032]1.4 儀器:
[0033]電轉(zhuǎn)儀，Bio-Rad, Gene Pulser Xcell
[0034]酶標儀，SpectraMaxM5
[0035]1.5數(shù)據(jù)分析軟件:
[0036]SoftMax Pro 軟件
[0037]sigmaPlotl2.0 軟件
[0038]1.6實驗流程:
[0039]1.6.lpGL4.26-R-G 的構(gòu)建
[0040]化學合成DNA反應(yīng)元件,序列如下:
[0041 ]5，-GTCGACATTTCCCGTAAATCAAGGATGTATTTCCCAGAAAAGGTATTTCCCAGAAAAGGAAC
[0042]GTCGACATTTCCCGTAAATCAAGGATGTATTTCCCAGAAAAGGTATTTCCCAGAAAAGGAAC
[0043]GTCGACATTTCCCGTAAATCAAGGATGTATTTCCCAGAAAAGGTATTTCCCAGAAAAGGAAC-3，正負鏈退火后連入PGL4.26載體，送至奧科鼎盛生物科技公司測序，完全正確。
[0044]1.6.2 轉(zhuǎn)染
[0045]I)收集細胞，計數(shù)，200 μ I重懸，轉(zhuǎn)移至4mm電擊杯；
[0046]2)取100 μ I質(zhì)粒，加入電擊杯中，與細胞懸液混勻；
[0047]3)設(shè)置電擊參數(shù)，電壓250V，電容950 μ F，電擊杯4mm ；
[0048]4)電擊后轉(zhuǎn)移至6孔板,加3ml完全培養(yǎng)基；[0049]5) 48h后檢測熒光素酶的表達。
[0050]1.6.3加壓篩選及單克隆細胞株分離培養(yǎng)
[0051](I)轉(zhuǎn)染后48h，更換潮霉素選擇培養(yǎng)基，篩選3周左右，每3-4天更換一次潮霉素選擇培養(yǎng)基；
[0052](2)待克隆長出后，消化計數(shù)，稀釋至I個細胞/ 200μ 1,200μ1 /孔鋪至96孔板；
[0053](3)用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)4周，顯微鏡下觀察，挑選單克隆的細胞孔，并轉(zhuǎn)移至24孔板，長滿后再傳至6孔板擴大培養(yǎng)。
[0054]1.6.4單克隆細胞株對rhEPO反應(yīng)性檢測
[0055]分離培養(yǎng)得到10個單克隆細胞株，分別檢測對rhEPO反應(yīng)性，細胞密度為40，000個/孔，rhEPO預稀釋濃度為250 IU / ml，4倍比系列稀釋12個梯度，各設(shè)3個復孔。rhEPO藥物作用4h檢測熒光素酶活性。
[0056]1.6.5RGA活性測定方法建立:
[0057]1.6.5.1倍比稀釋比例
[0058]根據(jù)前面的試驗結(jié)果，細胞密度為40，000個/孔，rhEPO預稀釋濃度為10IU /ml，藥物作用時間為4h，檢測rhEPO倍比稀釋倍數(shù)分別為3倍和2倍的劑量反應(yīng)曲線。
[0059]1.6.5.2比較不同細胞密度的線性反應(yīng)
[0060]根據(jù)前面的試驗結(jié)果，rhEPO預稀釋濃度為2IU / ml，調(diào)整倍比稀釋倍數(shù)為2倍，藥物作用時間為4h，檢測細胞密度分別為20，000,40, 000,60, 000,80, 000個/孔的劑量反
應(yīng)曲線。
[0061]1.6.5.3不同藥物刺激時間的線性反應(yīng)
[0062]根據(jù)前面的試驗結(jié)果，細胞密度為60，000個/孔，調(diào)整rhEPO預稀釋濃度為2IU / ml，倍比稀釋倍數(shù)為2倍，檢測分別作用3，4，5和6h的劑量反應(yīng)曲線。
[0063]1.6.6方法學驗證
[0064]1.6.6.1 回收率
[0065]用新建RGA法對2批rhEPO樣品進行活性測定，同時做50%加標回收率，每個劑量3個復孔，測定6次。
[0066]1.6.6.2 精密度
[0067]用新建RGA法對2批rhEPO樣品進行活性測定，檢測該方法的精密度，每個劑量3個復孔，測定6次。
[0068]2.結(jié)果與討論
[0069]2.1R-G質(zhì)粒轉(zhuǎn)染UT-7細胞，通過500 μ g / ml潮霉素加壓篩選，得到的穩(wěn)定克隆進行單克隆分離培養(yǎng)，得到10個單克隆細胞株，分別檢測對rhEPO反應(yīng)性，其中7號單克隆信號值較強，信噪比較好，結(jié)果見圖1-1。rhEPO預稀釋濃度為250IU / ml，4倍比稀釋12個梯度，擬以此克隆UT-7 / G7建立rhEPO活性檢測方法。
[0070]2.2檢測方法的建立
[0071]分別對藥物倍比稀釋比例，細胞鋪板密度，藥物作用時間等參數(shù)進行了優(yōu)化，見圖2-1，2-2和2-3。通過比較ED5tl值和信噪比，初步確定了檢測方案:細胞鋪板密度為60，000個細胞/孔，rhEPO藥物預稀釋濃度為2IU / ml, 2倍比稀釋，藥物刺激時間為4小時。[0072]2.3用RGA法對2批rhEPO樣品測定6次，同時做50%加標回收率，其中樣品I的一次回收率結(jié)果見圖3-1。結(jié)果匯總見表2-1。
[0073]表中結(jié)果表明，該方法檢測樣品I的回收率在85.37-96.34%之間，樣品2的回收率在81.71-102.44%之間，結(jié)果證明該方法的準確性較高，適用于作為常規(guī)方法來檢測rhEPO活性。2.4用RGA法對2批rhEPO樣品測定6次，檢測該方法的精密度，結(jié)果匯總見表2-1。該方法檢測樣品I的活性均值為3857.67IU / ml, CV%值為3.50% ;樣品2的活性均值為3564.5IU /結(jié)果證明該方法的重現(xiàn)性較好，適用于作為常規(guī)方法來檢測rhEPO活性。
[0074]表2-1RGA法檢測rhEPO樣品生物學活性
[0075]
【權(quán)利要求】
1.一種應(yīng)用轉(zhuǎn)基因細胞株來檢測重組人促紅細胞生成素(rhEPO)生物活性的非診斷目的的方法，其特征在于包括如下步驟:
(1)將DNA 反應(yīng)兀件 SIE (Sis inducible element, SIE), GRR(the gamma responseregion, GRR)和 GAS (the interferon y -activated sequence, GAS)串聯(lián)后重復三次插入pGL4.26多克隆位點，構(gòu)建Reporter gene (R-G)質(zhì)粒。R-G正鏈:
5’ -GTCGACATTTCCCGTAAATCAAGGATGTATTTCCCAGAAAAGGTATTTCCCAGAAAAGGAAC
GTCGACATTTCCCGTAAATCAAGGATGTATTTCCCAGAAAAGGTATTTCCCAGAAAAGGAAC
GTCGACATTTCCCGTAAATCAAGGATGTATTTCCCAGAAAAGGTATTTCCCAGAAAAGGAAC-3’ (2)根據(jù)rhEPO及其受體的作用機制，構(gòu)建rhEPO反應(yīng)性轉(zhuǎn)基因細胞株:選用UT-7細胞，轉(zhuǎn)染R-G質(zhì)粒，通過加壓篩選，獲得穩(wěn)定細胞株UT-7 / G7，并用于rhEPO活性檢測。 (3)通過檢測rhEPO刺激下熒光素酶含量的變化對rhEPO活性進行定量:(i)檢測用分析培養(yǎng)基為500ml無酚紅RPM1-1640+5ml胎牛血清+6ml HEPES，檢測用細胞培養(yǎng)板為白色底部透光96孔板；(ii)UT-7 / G7細胞用分析培養(yǎng)基培養(yǎng)17-20h，離心收集后用分析培養(yǎng)基調(diào)整至1.2X 1O6個 / ml，將50 μ I細胞懸液與50 μ I rhEPO系列稀釋液同時加入96孔板，培養(yǎng)4h加入100 μ I /孔熒光素酶底物，檢測螢光素酶表達量。 (4)利用SoftMaxPro軟件四參數(shù)方程對rhEPO活性進行定量分析。
【文檔編號】C12Q1/66GK103993066SQ201310547894
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2013年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月8日
【發(fā)明者】王軍志, 饒春明, 楊玉帥, 周勇, 于雷, 史新昌, 李響, 秦璽 申請人:中國食品藥品檢定研究院