專利名稱：唾液酸的去除方法及去唾液酸促紅細胞生成素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及唾液酸的去除方法及去唾液酸促紅細胞生成素的制備方法。
背景技術(shù)：
促紅細胞生成素(以下也稱為"EPO")具有促進紅細胞系前體細胞的
分化、增殖的功能，是主要從腎臟產(chǎn)生的酸性糖蛋白激素。血液中存在最 為豐富的紅細胞在發(fā)揮一定時期功能后在脾臟等被破壞。例如，在人體中，
紅細胞的平均壽命是大約120天。另一方面，紅細胞從骨髓源源不斷地提 供出來，末梢的總紅細胞數(shù)目在正常狀態(tài)下常常保持一定。促紅細胞生成 素在維持這樣的生物體的紅細胞的永久性中擔(dān)任重要的作用。在臨床上， 促紅細胞生成素被用于貧血的治療以及術(shù)前術(shù)后的管理。
近年來，將去除了結(jié)合在促紅細胞生成素上的唾液酸的去唾液酸促紅 細胞生成素代替天然的具有糖鏈的促紅細胞生成素，并用于臨床的相關(guān)問 題正處于研究中(例如，參見專利文獻1 (對應(yīng)于WO2002/053580))。該 去唾液酸促紅細胞生成素通常除了通過用唾液酸酶等酶處理促紅細胞生成 素來制備外，也可用唾液酸轉(zhuǎn)移酶缺損細胞作為宿主細胞來制備(例如， 參見專利文獻1)。經(jīng)去唾液酸化的促紅細胞生成素由存在于肝臟的去唾液 酸糖蛋白受體介導(dǎo)，快速被代謝掉。因此，即使在從給藥部位向血液中漏 出的情況下，也不會引起紅細胞造血，在即使是以多血及血壓升高為障礙 的疾病中進行臨床應(yīng)用也是可能的。
專利文獻1:特表2005-502584號公報。
但是，上述現(xiàn)有的使用酶的唾液酸的去除方法存在操作復(fù)雜、成本高 的問題。而且，使用特殊宿主細胞的方法也同樣地存在操作復(fù)雜、成本高 的問題。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種簡易性、低成本性優(yōu)良的唾液酸的去 除方法，及用該方法制備去唾液酸促紅細胞生成素的方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的唾液酸的去除方法是結(jié)合在促紅細胞生 成素上的唾液酸的去除方法，其包括使含上述促紅細胞生成素的溶液呈酸 性、并且進行加熱的酸性加熱處理工序。而且，還進一步包括在上述酸性 加熱處理工序后中和上述含促紅細胞生成素的溶液、并且進行冷卻的中和 冷卻處理工序。
并且，本發(fā)明的去唾液酸促紅細胞生成素的制備方法是包括通過本發(fā) 明的唾液酸的去除方法來去除結(jié)合在促紅細胞生成素上的唾液酸的唾液酸 去除工序的去唾液酸促紅細胞生成素的制備方法。
本發(fā)明人就去除結(jié)合在促紅細胞生成素上的唾液酸的方法進行了反復(fù) 的銳意硏究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使促紅細胞生成素呈酸性、并且僅加熱即可去除 唾液酸，更進一步發(fā)現(xiàn)其生物學(xué)活性并沒有失去，從而達成了本發(fā)明。
本發(fā)明的唾液酸的去除方法及去唾液酸促紅細胞生成素的制備方法， 由于簡易性和低成本性優(yōu)異，因此能夠簡易、廉價地制備去唾液酸促紅細 胞生成素。而且，用本發(fā)明的制備方法制備的去唾液酸促紅細胞生成素， 因為能夠?qū)崿F(xiàn)與促紅細胞生成素相比毫不遜色的細胞增殖刺激等生物學(xué)功 能，因此，能夠廣泛地用于例如治療及醫(yī)藥組合物的制備等醫(yī)療領(lǐng)域中。


圖1是去唾液酸EPO及天然型EPO進行了 SDS-PAGE的凝膠的照片 (實施例l)。
圖2是去唾液酸EPO及天然型EPO進行了 IEF的凝膠的照片(實施 例1)。
圖3是比較天然型EPO和去唾液酸EPO的細胞增殖刺激功能的曲線 圖(實施例l)。
具體實施例方式
在本發(fā)明的唾液酸的去除方法中，上述酸性優(yōu)選是pH4.0以下，而且， 上述加熱優(yōu)選是將上述溶液的溫度加熱到6(TC以上。
在本發(fā)明的唾液酸的去除方法中，上述酸性加熱處理工序的處理時間
優(yōu)選是15分鐘以上。
本發(fā)明的唾液酸的去除方法優(yōu)選在上述酸性加熱處理工序后進一步包 括中和上述含促紅細胞生成素的溶液、并且進行冷卻的中和冷卻處理工序。
上述中和優(yōu)選將上述溶液的pH中和至pH5.0 10.0的范圍內(nèi)。而且， 上述冷卻優(yōu)選將上述溶液的溫度冷卻至0°C 50'C的范圍內(nèi)。
在本發(fā)明中，"去唾液酸促紅細胞生成素(以下也稱為去唾液酸EPO)" 是指去除了結(jié)合在促紅細胞生成素(以下也稱為EPO)分子上的唾液酸的 EPO。
通常，在從重組動物細胞生產(chǎn)的EPO和從尿中獲得的EPO中的任意 —個，EPO均作為含有不同糖鏈結(jié)構(gòu)的多種EPO的EPO組合物而獲得。 對于唾液酸也是同樣，雖然加成在上述EPO組合物中的EPO分子上的唾 液酸的數(shù)目根據(jù)各個EPO分子的不同而不同，但通常1個EPO分子上加 成有11個 15個唾液酸。在本發(fā)明中，去唾液酸EPO是指這些唾液酸中 至少去除了一個的物質(zhì)。通過上述唾液酸的去除從EPO去除的唾液酸的數(shù) 目沒有特別的限制，例如可以去除全部的唾液酸，也可以除去1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13或14個唾液酸。作為本發(fā)明的去唾液酸 EPO，優(yōu)選結(jié)合在EPO分子上的唾液酸的數(shù)目是10個以下，更優(yōu)選是5 個以下，特別優(yōu)選是2個以下。
再者，結(jié)合在EPO及去唾液酸EPO上的唾液酸的數(shù)目可以用EPO組 合物中含有的每1分子EPO的平均數(shù)來表示，其每1分子的唾液酸的平均 數(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，用現(xiàn)有公知的方法能夠測定(例如，特開平 8-151398號、EP0428267號公報)。例如，可以列舉出下述方法等將EPO 用0.35M的硫酸在80"C進行30分鐘的水解，將唾液酸全部從EPO切下， 分別定量EPO的蛋白質(zhì)及唾液酸，計算每1摩爾EPO的唾液酸的摩爾數(shù)。
本發(fā)明中使用的EPO雖然無論什么樣的EPO均可使用，但是優(yōu)選是 高度精制了的EPO。更具體地，例如優(yōu)選是哺乳類EPO、特別優(yōu)選人EPO 和實質(zhì)上具有相同生物學(xué)活性的物質(zhì)。
作為上述EPO的制備方法，沒有特別的限制，例如可以列舉出將來自 人的提取物精制而獲得天然的人EPO的方法(例如、參見特公平1-38800
號公報(對應(yīng)于WO86/04068)),或者使用通過包括基因重組法的基因工程 方法使之在大腸桿菌、酵母菌、中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)、C127細 胞、COS細胞、骨髓瘤細胞、BHK細胞、昆蟲細胞等細胞內(nèi)表達，并采用 各種方法提取、分離精制而得到的人EPO等的方法。這些方法當中，在本 發(fā)明使用的EPO，優(yōu)選為通過基因工程的方法制備的EPO、優(yōu)選為使用哺 乳動物細胞、尤其優(yōu)選使用CHO細胞制備的EPO (例如，參見特公平 1-44317號公報(對應(yīng)于WO86/03520)), Kenneth Jacobs et al., Nature, 313, 806-810(1985))。
通過上述基因工程的方法制備的EPO包括和天然來源的EPO的氨基 酸序列相同的物質(zhì)、或者是上述氨基酸序列中的1個或多個氨基酸發(fā)生了 缺失、置換、增加等、且具有與天然來源的EPO相同的生物學(xué)活性的物質(zhì)。 氨基酸的缺失、置換、增加等是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過公知的方法進行 的。例如、用部位特異性突變誘發(fā)法(Gotoh， T. et al.(1995) Gene 152,271-275; Zoller， M丄and Smith, M. (l卯3) Methods Enzymol. 100， 468-500; Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12， 9441-9456; Kramer, W. and Fritz, H. J. (1987) Methods Enzymol. 154， 350-367; Kunkel， T. A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82,488-492; Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766)等、 通過向EPO的氨基酸序列中導(dǎo)入適當?shù)耐蛔?、能夠制備與EPO功能相同 的多肽。而且，氨基酸的突變在自然界也可發(fā)生。 一般地，被置換的氮基 酸殘基優(yōu)選置換為保持氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)的其它的氨基酸。例如，作為氨基 酸側(cè)鏈的性質(zhì)，可以列舉出疏水性氨基酸(A、 I、 L、 M、 F、 P、 W、 Y、 V;以上是用一個字母來表示氨基酸，下文相同)、親水性氨基酸(R、 D、 N、 C、 E、 Q、 G、 H、 K、 S、 T);具有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸(G、 A、 V、 L、 I、 P);具有含羥基側(cè)鏈的氨基酸(S、 T、 Y)、具有含有硫原子的側(cè)鏈 的氨基酸(C、 M)、具有含羧酸及酰胺側(cè)鏈的氨基酸(D、 N、 E、 Q)、具 有含堿側(cè)鏈的氨基酸(R、 K、 H)、具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(H、 F、 Y、 W)等。具有通過對某個氨基酸序列上的1個或多個氨基酸殘基的缺失、 增加、置換等而經(jīng)修飾的氨基酸序列的多肽能夠保持其生物學(xué)活性已是公 知的(Mark, D. F. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81， 5662-5666; Zoller， M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10， 6487-6500; Wang，
A. et al., Science 224,1431-1433; Dalbadie-McFarland， G. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413 )。
本發(fā)明中使用的EPO也可以是EPO與其它蛋白質(zhì)的融合蛋白質(zhì)。制 備融合多肽時，例如將編碼EPO的DNA和編碼其它蛋白質(zhì)的DNA按照框 架(曰文原文為7P—厶)一致的方式進行連接，導(dǎo)入表達這些DNA的載 體中，在宿主中使之表達即可。作為上述其它的蛋白質(zhì)，沒有特別的限制。 而且，作為本發(fā)明中使用的EPO,也可以使用經(jīng)化學(xué)修飾的EPO及糖鏈經(jīng) 修飾、改變的EPO等。作為經(jīng)化學(xué)修飾的EPO，例如可以列舉出結(jié)合了聚 乙二醇、維生素B12等有機或無機化合物的EPO等。另外，作為本發(fā)明中 使用的EPO，還可以使用分子中的氨基酸經(jīng)修飾的EPO等。作為EPO分 子中的氨基酸的修飾，例如可以列舉出氨基甲?；?、生物素化、脒化、乙 ?；?、胍化等。
下面，就本發(fā)明的唾液酸的去除方法進行說明。
本發(fā)明的唾液酸的去除方法包括將含EPO的溶液在酸性且加熱條件下 進行處理、從而去除結(jié)合在EPO分子上的唾液酸的酸性加熱處理工序。
上述含EPO溶液的EPO濃度沒有特別的限制，例如是0.01mg/L 100.0mg/L，優(yōu)選是0.05mg/L 50.0mg/L，更優(yōu)選是1.0mg/L 10.0mg/L。
上述酸性例如是pH4.0以下，優(yōu)選是pH0.1 pH4.0的范圍，更優(yōu)選是 pH0.5 pH3.0的范圍，更進一步優(yōu)選是pH1.0 pH2.5的范圍。
將上述含EPO的溶液調(diào)至上述酸性范圍的方法沒有特別的限制，可以 采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進行，例如可以將鹽酸溶液、磷酸溶液、 醋酸溶液等酸性溶液添加到上述含EPO的溶液中等來進行。
上述加熱是為了去除唾液酸而處理上述含EPO的溶液的加熱，其溫度 例如是6(TC以上，優(yōu)選是6(TC 100。C，更優(yōu)選是70'C 卯'C，更進一步 優(yōu)選是75'C 85。C。
在上述酸性加熱處理工序中，將上述含EPO的溶液調(diào)成酸性的工序和 加熱工序的順序沒有特別的限制，可以將上述含EPO的溶液調(diào)成酸性后加 熱，也可在將上述含EPO的溶液加熱后調(diào)成酸性，或者，調(diào)成酸性的工序 和加熱工序也可同時進行。其中，在本發(fā)明中，優(yōu)選在將上述含EPO的溶 液調(diào)成酸性的工序后進行加熱的工序。
在本發(fā)明的唾液酸的去除方法中，為了去除結(jié)合在EPO分子上的唾液 酸的上述酸性加熱處理工序的處理時間沒有特別的限制，例如是15分鐘以 上，優(yōu)選是30分鐘以上，更優(yōu)選是45分鐘以上，更進一步地優(yōu)選是60分 鐘以上。上述處理時間的上限沒有特別的限制，例如是24小時，優(yōu)選是360 分鐘，更優(yōu)選是120分鐘。
在本發(fā)明的唾液酸的去除方法中，優(yōu)選上述酸性加熱處理工序后進一 步包括中和上述含EPO的溶液、并且進行冷卻的中和冷卻處理工序。
上述中和是將上述溶液的pH例如調(diào)至pH5.0 pH10.0的范圍的中和， 上述中和的pH優(yōu)選是pH6.0 pH9.0，更優(yōu)選是pH6.5 pH7.5。
中和上述含EPO的溶液的方法沒有特別的限制，可以采用本領(lǐng)域技術(shù) 人員公知的方法進行，例如，可以將氫氧化鈉溶液等堿性溶液加到上述唾 液酸去除工序后的溶液中等來進行。
上述冷卻是將上述溶液的溫度例如調(diào)至0'C 50'C的冷卻，優(yōu)選是 0。C 40。C，更優(yōu)選是0'C 30。C。
在上述中和冷卻處理工序中，中和上述含EPO的溶液的工序和冷卻工 序的順序沒有特別的限制，可以在中和上述含EPO的溶液后冷卻，也可以 在冷卻后中和，或者，中和工序和冷卻工序也可同時進行。其中，本發(fā)明 中，優(yōu)選中和工序后進行冷卻的工序。
下面，就本發(fā)明的去唾液酸促紅細胞生成素的制備方法進行說明。
本發(fā)明的去唾液酸EPO的制備方法包括通過本發(fā)明的唾液酸的去除方 法來去除結(jié)合在促紅細胞生成素上的唾液酸的唾液酸去除工序。
上述唾液酸去除工序中，使含EPO的溶液呈酸性、并且加熱的處理條 件，其方法及它們的順序以及處理時間，如前所述。
同樣，上述唾液酸去除工序中，中和含EPO的溶液、并且冷卻的處理 條件，其方法及它們的順序，如前所述。
通過上述唾液酸去除工序得到的含去唾液酸EPO的溶液中的去唾液酸 EPO例如可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法適當精制，從而得到高純度 的去唾液酸EPO。
通過本發(fā)明的去唾液酸EPO的制備方法制備的去唾液酸EPO，因為具 有與EPO相同的生物學(xué)活性，例如可以用于醫(yī)藥組合物或試劑等中。本發(fā)
明中，與EPO具有相同的生物學(xué)活性是指EPO具有的活性，沒有特別的 限制，例如可以列舉出細胞增殖剌激活性，促進細胞、組織的再生，細胞、 組織的保護活性等。
將去唾液酸EPO制成醫(yī)藥組合物時，必要時，可以適當?shù)丶尤牖鞈覄?助溶劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、保存劑、防吸附劑、表面活性劑、稀釋劑、賦 形劑、pH調(diào)節(jié)劑、止痛劑、緩沖劑、含硫還原劑、抗氧化劑等。
上述混懸劑沒有特別的限制，例如可以列舉出甲基纖維素、聚山梨酸 酯80、羥乙基纖維素、阿拉伯膠、黃蓍膠粉末、羧甲基纖維素鈉、聚氧乙 烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯等。
上述助溶劑沒有特別的限制，例如可以列舉出聚氧乙烯固化蓖麻油、 聚山梨酸酯80、煙酰胺、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯、聚乙二醇、 蓖麻油脂肪酸乙酯等。
上述穩(wěn)定劑沒有特別的限制，例如可以列舉出葡聚糖40、甲基纖維素、 明膠、亞硫酸鈉、焦亞硫酸鈉等。而且，作為上述穩(wěn)定劑，也可加入某種 氨基酸(例如，參見特開平10-182481號公報)。作為穩(wěn)定劑添加的氨基酸 包括例如游離的氨基酸、其鈉鹽、鉀鹽、鹽酸鹽等鹽等。上述氨基酸可以 添加1種或2種以上的組合，對于其種類沒有特別的限制，作為優(yōu)選的氨 基酸，可以列舉出亮氨酸、色氨酸、絲氨酸、谷氨酸、精氨酸、組氨酸、 賴氨酸。
上述等滲劑沒有特別的限制，例如可以列舉出D-甘露醇、山梨糖醇等。
上述保存劑沒有特別的限制，例如可以列舉出對羥基苯甲酸甲酯、對 羥基苯甲酸乙酯、山梨酸、苯酚、甲酚、氯甲酚等。
上述防吸附劑沒有特別的限制，例如可以列舉出人血清白蛋白、卵磷 脂、葡聚糖、環(huán)氧乙垸-環(huán)氧丙烷共聚物、羥丙基纖維素、甲基纖維素、聚 氧乙烯固化蓖麻油、聚乙二醇等。
上述表面活性劑沒有特別的限制，典型地可以列舉出非離子表面活性 劑、陰離子表面活性劑，天然系表面活性劑等。上述非離子表面活性劑例 如可以列舉出具有HLB6-18的物質(zhì)等，如脫水山梨糖醇單辛酸酯、脫水山 梨糖醇單月桂酸酯、脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯等脫水山梨糖醇脂肪酸酯； 甘油單辛酸酯、甘油單肉豆蔻酸酯、甘油單硬脂酸酯等甘油脂肪酸酯；十
聚甘油單硬脂酸酯、十聚甘油二硬脂酸酯、十聚甘油單亞油酸酯等聚甘油
脂肪酸酯；聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單 油酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單棕 櫚酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇三油酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇三硬脂 酸酯等聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯；聚氧乙烯山梨糖醇四硬脂酸酯、 聚氧乙烯山梨糖醇四油酸酯等聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯；聚氧乙烯甘油 單硬脂酸酯等聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、聚乙二醇二硬脂酸酯等聚乙二醇脂 肪酸酯；聚氧乙烯月桂基醚等聚氧乙烯烷基醚；聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、 聚氧乙烯聚氧丙烯丙醚、聚氧乙烯聚氧丙烯十六烷基醚等聚氧乙烯聚氧丙 烯垸基醚；聚氧乙烯壬基苯基醚等聚氧乙烯烷基苯基醚；聚氧乙烯蓖麻油、 聚氧乙烯固化蓖麻油(聚氧乙烯氫化蓖麻油)等聚氧乙烯固化蓖麻油；聚 氧乙烯山梨醇蜂蠟等聚氧乙烯蜂蠟衍生物；聚氧乙烯羊毛脂等聚氧乙烯羊 毛脂衍生物；聚氧乙烯硬脂酰胺等聚氧乙烯脂肪酰胺等。上述陰離子表面 活性劑例如可以列舉出十六烷基硫酸鈉、月桂基硫酸鈉、油基硫酸鈉等具 有碳原子數(shù)為10 18的垸基的烷基硫酸鹽；聚氧乙烯月桂基硫酸鈉等氧乙 烯的平均加成摩爾數(shù)為2-4、垸基的碳原子數(shù)為10 18的聚氧乙烯烷基醚 硫酸鹽；月桂基磺基丁二酸酯鈉等烷基的碳原子數(shù)為8 18的烷基磺基丁 二酸酸酯鹽等。上述天然系的表面活性劑例如可以列舉出卵磷脂、甘油磷 脂、神經(jīng)鞘髓磷脂等鞘磷脂；碳原子數(shù)為12 18的脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯 等。這些表面活性劑也可一種或2種以上組合添加。其中優(yōu)選的表面活性 劑是聚山梨酸酯20、 40、 60或80等聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯、特 別優(yōu)選聚山梨酸酯20和80。另外，也優(yōu)選以泊洛沙姆(PluronicF-68 (注 冊商標)等)為代表的聚氧乙烯聚丙二醇。
上述含硫還原劑沒有特別的限制，例如可以列舉出N-乙?；腚装彼?、 N-乙酰基同型半胱氨酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫代乙醇胺、硫甘油、硫山 梨糖醇、巰基乙酸及其鹽、硫代硫酸鈉、谷胱甘肽、碳原子數(shù)為1 7的硫 代垸酸等含有巰基的物質(zhì)等。
上述抗氧化劑沒有特別的限制，例如可以列舉出異抗壞血酸、二丁基 羥基甲苯、丁基羥基聯(lián)茴香醚、(x-生育酚、乙酸生育酚、L-抗壞血酸及其 鹽、L-抗壞血酸棕櫚酸酯、L-抗壞血酸硬脂酸酯、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、
沒食子酸三戊酯、沒食子酸丙酯、或者乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、焦磷 酸鈉、偏磷酸鈉等螯合劑等。
另外，還可加入常用的添加成分如氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、磷酸鈉、 磷酸鉀、碳酸氫鈉等無機鹽以及檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、醋酸鈉等有機酸等。
將含有上述去唾液酸EPO的醫(yī)藥組合物給藥時，其給藥量，例如去唾 液酸EPO是0.001昭/kg/日 1 OOOpg/kg/日，優(yōu)選是0.01昭/kg/日 100嗎/kg/ 曰，更優(yōu)選是0.1iig/kg/日 3(Hig/kg/日。但是，給藥量并不限于這些，可以 由醫(yī)生根據(jù)患者的年齡、體重、性別、癥狀以及給藥途徑等考慮決定。因 此，本發(fā)明的其它實施方式還可以包括包括通過本發(fā)明的去唾液酸EPO 的制備工藝來制備去唾液酸EPO的工序的含去唾液酸EPO醫(yī)藥組合物的 制造方法、通過該方法制備的上述醫(yī)藥組合物、以及包括投予上述醫(yī)藥組 合物的治療方法，例如貧血的治療和術(shù)前術(shù)后的管理方法。
下面，通過實施例對本發(fā)明進行進一步的說明。
實施例1 (去唾液酸EPO的制備)
準備1卯mL含有天然型的EPO的溶液(1300jig/mL)，在上述溶液中加 入1.0N的HC110nL，然后加熱至80'C，并孵育60分鐘，從而去除結(jié)合在 上述EPO上的唾液酸。之后，加入2.0nL5.0N的NaOH進行中和，同時冷 卻至室溫，得到含有去唾液酸EPO的溶液。上述HCl加入后的溶液的pH 是l.O，上述NaOH加入后的溶液的pH是7.0。此外，上述天然型EPO是 通過培養(yǎng)導(dǎo)入了 EPO基因的CHO細胞而獲得的。
天然型EPO和唾液酸去除后的去唾液酸EPO的分子量及等電點可以 分別用SDS聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)及等電點電泳(正F)進行確認。 其測定結(jié)果分別見圖1和圖2。圖1是SDS-PAGE后進行了蛋白質(zhì)染色的 凝膠的照片，如圖1所示，去唾液酸EPO的分子量與唾液酸去除處理前的 天然型EPO相比減少了。圖2是IEF后進行了蛋白質(zhì)染色的凝膠的照片， 如圖2所示，唾液酸去除處理前的天然型EPO的等電點不足4.55,與此相 對，唾液酸去除處理后的去唾液酸EPO的等電點在7.35以上。這些變化與 從EPO分子中唾液酸的去除相一致。另外，制備后的上述去唾液酸EPO 的每1分子的唾液酸的平均數(shù)目是0。
為了將如此制備的去唾液酸EPO的生物活性與上述天然型EPO的生 物學(xué)活性進行比較，以EPO依賴性細胞株的增殖刺激活性作為指標進行了 研究。本試驗中使用的AS-E2細胞是從人白血病患者的骨髓細胞中建立的 EPO受體表達細胞株，其具有在EPO非存在下不能生存的特點。分別加入 上述去唾液酸EPO和上述天然型EPO，通過WST-l分析來測定它們對細 胞增殖的影響。其結(jié)果見圖3。按照該圖3所示，就細胞增殖刺激功能而言， 兩者具有相同的功能。
按照以上所述，本發(fā)明的唾液酸的去除方法及去唾液酸促紅細胞生成素 的制備方法因為簡易并且成本低，例如可用于制備醫(yī)藥組合物、可用于廣 泛的醫(yī)療領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合在促紅細胞生成素上的唾液酸的去除方法，其包括使含所述促紅細胞生成素的溶液呈酸性、并進行加熱的酸性加熱處理工序。
2. 權(quán)利要求1所述的唾液酸的去除方法，其進一步包^5在所述酸性加 熱處理工序后中和所述含促紅細胞生成素的溶液、并進行冷卻的中和冷卻 處理工序。
3. 權(quán)利要求1或2所述的唾液酸的去除方法，其中，所述酸性是pH4.0 以下。
4. 權(quán)利要求1至3中任意一項所述的唾液酸的去除方法，其中，所述 加熱是將所述溶液的溫度加熱到60'C以上。
5. 權(quán)利要求1至4中任意一項所述的唾液酸的去除方法，其中，所述 酸性加熱處理工序的處理時間是15分鐘以上。
6. 權(quán)利要求2至5中任意一項所述的唾液酸的去除方法，其中，所述 中和是將所述溶液的pH中和至pH 5.0 10.0的范圍內(nèi)。
7.權(quán)利要求2至6中任意一項所述的唾液酸的去除方法，其中，所述 冷卻是將所述溶液的溫度冷卻至0 50'C的范圍內(nèi)。
8. —種去唾液酸促紅細胞生成素的制備方、法，其包括通過權(quán)利要求1 至7中任意一項所述的唾液酸的去除方法來去除結(jié)合在促紅細胞生成素上 的唾液酸的唾液酸去除工序。
全文摘要
本發(fā)明提供一種簡易性和低成本性優(yōu)異的唾液酸的去除方法、及用該方法制備去唾液酸促紅細胞生成素的方法。本發(fā)明的唾液酸去除方法包括使含促紅細胞生成素的溶液呈酸性，并且進行加熱，從而去除結(jié)合在促紅細胞生成素分子上的唾液酸的酸性加熱處理工序。另外，本發(fā)明的去唾液酸促紅細胞生成素的制備方法包括通過本發(fā)明的唾液酸的去除方法，將結(jié)合在促紅細胞生成素分子上的唾液酸去除的唾液酸去除工序。
文檔編號C07K14/435GK101365719SQ200780002120
公開日2009年2月11日 申請日期2007年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月18日
發(fā)明者樋口正人 申請人:中外制藥株式會社