專利名稱：：促紅細(xì)胞生成素組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，詳細(xì)地講，本發(fā)明提供用于制備具有所需N-糖形的PEG基化促紅細(xì)胞生成素的均質(zhì)組合物的材料和方法。
背景技術(shù)：
：重組體糖蛋白的生產(chǎn)已經(jīng)是生物技術(shù)工業(yè)很活躍的一個(gè)領(lǐng)域。重組體糖蛋白的一個(gè)缺點(diǎn)已經(jīng)是通常使用的細(xì)胞宿主例如CHO細(xì)胞所產(chǎn)生的糖基化的不均一性。相反，本發(fā)明提供已經(jīng)被工程改造成生產(chǎn)包含預(yù)選的所需N-聚糖結(jié)構(gòu)的重組促紅細(xì)胞生成素的低等真核宿主細(xì)胞。因此生產(chǎn)的重組促紅細(xì)胞生成素的組合物在糖形的均勻度方面顯著大于在CHO細(xì)胞中生產(chǎn)的那些促紅細(xì)胞生成素。促紅細(xì)胞生成素是已經(jīng)廣泛地用于需要增加紅細(xì)胞生成的治療適應(yīng)癥包括腎衰或化學(xué)治療引起的貧血的蛋白質(zhì)激素。因?yàn)閷?duì)安全和有效的促紅細(xì)胞生成素的巨大需求，重組人促紅細(xì)胞生成素已經(jīng)成為銷售量最大的重組人蛋白質(zhì)產(chǎn)品。天然人促紅細(xì)胞生成素包含4條糖鏈(3個(gè)N-聯(lián)的和l個(gè)0-聯(lián)的)。為了使體內(nèi)效能最大化，蛋白質(zhì)需要三天線的和四天線的唾液酸化的N-聚糖。然而，體外受體結(jié)合和基于細(xì)胞的分析測(cè)定顯示具有多支化唾液酸化聚糖的促紅細(xì)胞生成素和具有附加的N-糖基化位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素相對(duì)于酶促去糖基化的促紅細(xì)胞生成素呈現(xiàn)減少的結(jié)合。該矛盾可以通過(guò)認(rèn)為從循環(huán)系統(tǒng)清除解釋。四天線唾液酸化促紅細(xì)胞生成素和達(dá)貝泊汀(darbepoetin)呈現(xiàn)比雙天線唾液酸化的促紅細(xì)胞生5成素和非糖基化的促紅細(xì)胞生成素更長(zhǎng)的血清半壽期。(促紅細(xì)胞生成素的主要清除途徑是經(jīng)過(guò)腎濾過(guò)，通過(guò)結(jié)合至脫唾液酸糖蛋白受體，內(nèi)皮細(xì)胞攝取和通過(guò)促紅細(xì)胞生成素受體被輩巴細(xì)胞內(nèi)在化。)目前推向市場(chǎng)的重組促紅細(xì)胞生成素形式包括具有三個(gè)四天線N-聚糖結(jié)構(gòu)的Epogen、和Aranesp、經(jīng)工程改造的包含總共五個(gè)四天線N-聚糖結(jié)構(gòu)的兩個(gè)附加N-糖基化位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素。添加這些額外的N-聚糖連接位點(diǎn)已經(jīng)導(dǎo)致更長(zhǎng)的血清半壽期，并因此提高激素的體內(nèi)活性。這些促紅細(xì)胞生成素由CHO細(xì)胞生產(chǎn)并與N-聚糖結(jié)構(gòu)的不均一混合物分泌。工藝過(guò)程開發(fā)用于富集四天線的唾液酸化的糖形(見(jiàn)圖l)。過(guò)去努力改善促紅細(xì)胞生成素的性質(zhì)已經(jīng)包括努力改變糖基化例如通過(guò)增加糖基化位點(diǎn)，以及努力使蛋白質(zhì)與聚合物例如聚乙二醇綴合。參見(jiàn)，例如EP0640619;WO00/32772、WO01/02017和WO03/029291。盡管有這些嘗試，仍然需要具有改善的性質(zhì)的重組促紅細(xì)胞生成素，例如更易于給藥；給藥方案嚴(yán)格性更低；改善的藥代動(dòng)力學(xué)和生物利用度和更低成本制備重組促紅細(xì)胞生成素。詳細(xì)地講，用于從低等真核細(xì)胞產(chǎn)生具有這些性質(zhì)的促紅細(xì)胞生成素組合物的增強(qiáng)方法和材料仍是難以捉摸和所需目標(biāo)。發(fā)明概述因此，本發(fā)明提供用于制備能夠表達(dá)具有特異定向N-糖基化作用的重組人促紅細(xì)胞生成素的載體和宿主細(xì)胞、以及經(jīng)化學(xué)修飾例如通過(guò)PEG基化化學(xué)修飾的重組工程文造的糖蛋白組合物的方法和材料。本發(fā)明提供低等真核生物，尤其是巴斯德畢赤酵母CPZcAz'a戶。WoW力的工程菌林，該工程菌4朱能夠產(chǎn)生具有雙天線N-聚糖結(jié)構(gòu)的完全唾液酸化的重組體EPO。本發(fā)明也提供具有雙天線聚糖的PEG基化的EPO。這些重組糖蛋白組合物呈現(xiàn)先前在體外所見(jiàn)的增強(qiáng)的體內(nèi)生物活性，同時(shí)維持增加的血清半壽期。因此，本發(fā)明提供用于制備PEG基化的促紅細(xì)胞生成素蛋白組合物的方法和材料，所述組合物包含多種N-聯(lián)糖形，所述N-聯(lián)糖形包含連接至其中的至少一種N-聯(lián)聚糖。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該組合物包含多種N-聯(lián)聚糖，其中大于25摩爾百分率的所述多種N-聯(lián)聚糖基本上由選自以下的所需N-聯(lián)聚糖結(jié)構(gòu)組成GlcNAc2Man3Glc:NAc2Gal2NANA2;GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2;GlcNAc2Man3GlcNAc2;GlcNAc2Man3;GlcNAc2Man5GlcNAcGalNANA;GlcNAc2Man5Glc]SfAcGal;GcNAc2Man5GlcNAc;和GlcNAc2Man5.。在還優(yōu)選的實(shí)施方案中，所需N-聯(lián)聚糖結(jié)構(gòu)包含大于50摩爾百分率；75摩爾百分率或80摩爾百分率的所述N-聯(lián)聚糖結(jié)構(gòu)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所需N-聯(lián)聚糖結(jié)構(gòu)基本上由GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2組成。在還優(yōu)選的實(shí)施方案中，PEG基化的促紅細(xì)胞生成素蛋白組合物包含多種糖形，各糖形包含連接至其中的至少一種N-聯(lián)聚糖，其中糖蛋白組合物因此包含多種N-聯(lián)聚糖，其中大于25摩爾百分率的所述多種N-聯(lián)聚糖基本上由GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2組成。在還優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包含組合物，其中大于50摩爾百分率；75摩爾百分率或80摩爾百分率的所述多種N-聯(lián)聚糖基本上由GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2組成。在還優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包含PEG基化的促紅細(xì)胞生成素的組合物，其中GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2N-聯(lián)聚糖以多于所述多種N-聯(lián)聚糖的下一種最主要的N-聯(lián)聚糖結(jié)構(gòu)約5摩爾百分率-約80摩爾百分率的水平存在。本發(fā)明的另一優(yōu)選的糖形基本上由GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2的結(jié)構(gòu)組成。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，PEG基化的促紅細(xì)胞生成素蛋白組合物包含多種糖形，各糖形包含連接至其中的至少一種N-聯(lián)聚糖，其中糖蛋白組合物因此包含多種N-聯(lián)聚糖，其中大于25摩爾百分率的所述多種N-聯(lián)聚糖基本上由GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2組成。在還優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包含組合物，其中大于50摩爾百分率、大于75摩爾百分率的所述多種N-聯(lián)聚糖基本上由7GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2組成。在還優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包含PEG基化的促紅細(xì)胞生成素的組合物，其中GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2N-聯(lián)聚糖以多于所述多種N-聯(lián)聚糖的下一個(gè)最主要的N-聯(lián)聚糖結(jié)構(gòu)約5摩爾百分率-約80摩爾百分率的水平存在。在本發(fā)明的優(yōu)選的組合物中，聚乙二醇部分和促紅細(xì)胞生成素蛋白的N-末端氨基酸殘基可直接連接或經(jīng)由接頭連接。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，聚乙二醇部分的分子量可為約5-約100kD;更優(yōu)選約20kD-約60kD;約30kD-約40kD的重量。本發(fā)明還提供利用重組促紅細(xì)胞生成素的治療方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將重組促紅細(xì)胞生成素給予需要治療的病人，以減輕貧血。在還優(yōu)選的實(shí)施方案中，治療患者的由腎衰、化療或癌癥引起的貧血。附圖簡(jiǎn)述圖1A-1D表明分泌人重組體EP0的巴斯德畢赤酵母(尸.；。Won》菌抹YGLY3159的分步構(gòu)建，在該人重組體EPO上主要的N-聚糖是表示為GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2的完全唾液酸化的聚糖。圖2分圖A-0顯示用于產(chǎn)生YGLY3159的在圖1中涉及的質(zhì)粒載體的圖。圖3表明用于純化人EPO的三步色i普分離過(guò)程。圖4A-4D通過(guò)以下顯示純化的EPO的特征，分圖4A):顯示樣品總純度的SDS-PAGE;分圖4B):顯示一致單峰的分子排阻色譜法(SEC-HPLC),該一致單峰證明缺乏降解和缺乏聚集；分圖4C):證明EPO的完整性的反相(RP)-HPLC;和分圖4D):證明PNG酶F(PNGaseF)處理的EPO的產(chǎn)品質(zhì)量的LC-MS。圖5顯示結(jié)合至30kDa、40kDa、或60kDa線型PEG或45kDa支化PEG的純化hEPO樣品的SDSPAGE分析。圖6顯示四個(gè)不同的PEG基化的EPO產(chǎn)品的分子排阻色鐠(SECHPLC)分析。圖7顯示從用PNG酶F(PNGaseF)處理的和用2-氨基聯(lián)苯胺(2-AB)標(biāo)記的非PEG基化的EPO和四個(gè)不同的PEG基化的EPO產(chǎn)品釋放的N-聯(lián)聚糖的高效液相色譜。色譜證明雙唾液酸化的糖形GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2的優(yōu)勢(shì)。圖8顯示用四種不同模型的PEG-EPO結(jié)合物注射的小鼠顯示血細(xì)胞比容增加，超過(guò)市購(gòu)的Aranesp。C57B6小鼠每周兩次給予劑量，共五次注射(在2.5周之后停止給劑量)。將小鼠每周放血，測(cè)定血細(xì)胞比容值。聯(lián)的糖形。圖IO顯示重組體人EPO的純化方案的概況。圖11顯示純化的重組體人EPO的考馬斯染色的凝膠。圖12顯示PEG基化化學(xué)物的圖示。取自DowPharmawww.sda.com。圖13顯示在小鼠中每周一次PEG-EPO劑量對(duì)相對(duì)血細(xì)胞比容增力口的影響。序列筒述序列IDNO:l編碼人促紅細(xì)胞生成素的DNA序列。序列IDNO:2編碼人促紅細(xì)胞生成素的氨基酸序列。發(fā)明詳述除非本文另有定義，與本發(fā)明聯(lián)合使用的科學(xué)與技術(shù)術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)將具有通常被本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所理解的含義。此外，除非上下文另有要求，單數(shù)的術(shù)語(yǔ)將包括復(fù)數(shù)而復(fù)數(shù)的術(shù)語(yǔ)將包括單數(shù)。一般來(lái)說(shuō)，與以下技術(shù)聯(lián)合使用的命名是在本領(lǐng)域中熟知的和通常使用的那些命名生物化學(xué)、酶學(xué)、分子和細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)和蛋白質(zhì)與核酸化學(xué)的技術(shù)和本文所述的雜交技術(shù)。通常依照在本領(lǐng)域中熟知的和如在本說(shuō)明書全文中引用和討論的各種一般的與更特殊的參考文獻(xiàn)中所述的常規(guī)方法，來(lái)執(zhí)行本發(fā)明的方法和技術(shù)，除非另有說(shuō)明。見(jiàn)，例如，Sambrook等.Mawwa/,第2版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989);Ausubel等,CW簡(jiǎn)/Pratoco/sz>zMo/ecw/arGreenePublishingAssociates(1992，和2002的增刊)；Harlow和Lane,Jw幼o(hù)(^&sv爿丄aZora,0/7Mawwa/,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1990);Taylor和Drickamer，/"的c/wc"owG7少co&o/。gy,OxfordUniv.Press(2003);『oW/n'wg她E"2"，eM(3"wa/'WorthingtonBiochemicalCorp.,Freehold,NJ;//ow必ooA:o/5/oc/em/WwSec"'o"尸ra^7w，第I巻,CRCPress(1976);//flwc/600A:o/5/0cAew&^7.'Sec"ow爿iVotez>w，第II巻，CRCPress(1976);Es^ew/油o/G/少coZZo/ogv，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1999)。本文所述的所有公開、專利和其它參考文獻(xiàn)均通過(guò)整體引用而結(jié)合到本文中。除非另有說(shuō)明，以下術(shù)語(yǔ)將理解為具有以下含義本文所用術(shù)語(yǔ)術(shù)語(yǔ)'W-聚糖"和"糖形"可互換地使用，指iV-聯(lián)寡糖，例如，通過(guò)天冬酰胺-N-乙酰葡糖胺連接至多肽的天冬酰胺殘基而被連接的iV-聯(lián)寡糖。iV-聯(lián)糖蛋白包含連接至蛋白質(zhì)中天冬酰胺殘基的酰胺氮的W-乙酰葡糖胺殘基。在糖蛋白上發(fā)現(xiàn)的主要的糖是葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、乙酰半乳糖胺(GalNAc)、iV-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如，A/"-乙酰神經(jīng)氨酸(NANA))。糖基的加工與翻譯同時(shí)發(fā)生在ER的內(nèi)腔中，而對(duì)于N-聯(lián)的糖蛋白而言在高爾基體中繼續(xù)進(jìn)行翻譯后力口工。N-聚糖具有共同的Man3GlcNAc2戊多糖核心("Man"指甘露糖；"Glc"指葡萄糖；和"NAc"指iV-乙?；?；GlcNAc指W-乙酰葡糖胺)。就支化(天線)的數(shù)目而論，各N-聚糖有所不同，該支化包含添加至Man3GlcNAc2("Man3")核心結(jié)構(gòu)的外周糖(例如，GlcNAc、半乳糖、巖藻糖和唾液酸)，所述核心結(jié)構(gòu)也稱為"三甘露糖核心"、"五糖核心"或"少甘露糖核心"。N-聚糖根據(jù)其支化成份分類(例如，高甘露糖、復(fù)10雜或雜合)。"高甘露糖"型W-聚糖具有五個(gè)或更多個(gè)甘露糖殘基。"復(fù)雜"型N-聚糖通常具有連接至l,3甘露糖臂的至少一個(gè)GlcNAc和連接至"三甘露糖"核心l,6甘露糖臂的至少一個(gè)GlcNAc。復(fù)雜N-聚糖也可以具有任選用唾液酸或衍生物(例如，"NANA"或"NeuAc",其中"Neu"指神經(jīng)氨酸而"Ac"指乙?；?修飾的半乳糖("Gar)或7V-乙酰半乳糖胺("GalNAc")殘基。復(fù)雜N-聚糖也可以具有包含"二等分"GlcNAc和核心巖藻糖("Fuc")的鏈內(nèi)取代。復(fù)雜N-聚糖也可以在"三甘露糖核心"上具有多個(gè)天線，經(jīng)常被稱為"多天線聚糖"。"雜合"N-聚糖在三甘露糖核心1，3甘露糖臂的末端上具有至少一個(gè)GlcNAc和在三甘露糖核心的1,6甘露糖臂上具有零或多個(gè)甘露糖。各種N-聚糖也被稱為"糖形"。本文使用的縮寫是在本領(lǐng)域中常用的縮寫，參見(jiàn)，例如，以上的糖的縮寫。其它常用的縮寫包括"PNG酶"、或"聚糖酶"或"葡萄糖苷酶"，它們均指肽N-糖普酶F(EC3.2.2.18)。"分離的"、"純化的"或"基本上純化的"核酸或多核苦酸(例如，RNA、DNA或混合的聚合體)是從其天然宿主細(xì)胞中與天然多肽天然相伴的其它細(xì)胞成分中基本上分離的核酸或多核苷酸，所述細(xì)胞成分例如為與其自然締合的核糖體、聚合酶和基因組序列。該術(shù)語(yǔ)包含以下的核酸或多核苷酸(l)已經(jīng)從它的天然存在的環(huán)境中移出，(2)在自然界中不與在其中發(fā)現(xiàn)"分離的多核苷酸"的所有或部分多核苷酸締合，(3)可操作地連接至在自然界中不與其連接的多核苷酸，或(4)自然界中不存在。術(shù)語(yǔ)"分離的"、"純化的"或"基本上純化的"也可以用于指重組體或克隆DNA分離物、化學(xué)合成的多核苷酸類似物、或由異源系統(tǒng)生物合成的多核普酸類似物。然而，"分離的"不必要求上述核酸或多核苷酸自身已經(jīng)從其自然環(huán)境中物理上地移出。例如，假如異源序列在鄰近內(nèi)源性核,列的位置，致使該內(nèi)源性核S吏序列的表達(dá)被改變，則在生物體基因組中的內(nèi)源性核酸序列在本文中被認(rèn)為是"分離的"。在該上下文中，異源序列為非天然接近內(nèi)源性核酸序列的序列，不管該異源序列自身是內(nèi)源性的(起源于相同的宿主細(xì)胞或其后代)或外源性的(起源于不同的宿主細(xì)胞或其后代)。經(jīng)由實(shí)施例，啟動(dòng)子序列可以置換宿主細(xì)胞基因組中基因的天然啟動(dòng)子(例如，通過(guò)同源重組)，致使該基因具有改變的表達(dá)方式。該基因現(xiàn)在將變成"分離的"，因?yàn)樗鼜钠涮烊粋?cè)翼的至少一些序列中分離出來(lái)。假如核酸包含對(duì)基因組中相應(yīng)核酸而言非天然的任何修飾，那么它也被認(rèn)為是"分離的"。例如，假如內(nèi)源性編碼序列包含人工導(dǎo)入的插入、缺失或點(diǎn)突變(例如通過(guò)人為介入)，那么它被認(rèn)為是"分離的"。"分離的核酸"也包括在異源位點(diǎn)整合入宿主細(xì)胞染色體中的核酸和作為附加體存在的核酸結(jié)構(gòu)。此外，"分離的核酸"當(dāng)由重組技術(shù)產(chǎn)生時(shí)，可以基本上不含其它細(xì)胞物質(zhì)或基本上不含培養(yǎng)基，或當(dāng)被化學(xué)合成時(shí)，基本上不含化學(xué)前體或其它化學(xué)試劑。指核酸序列的本文所用短語(yǔ)"簡(jiǎn)并變體"包括以下核酸序列可以依照遺傳密碼翻譯，以提供與從所指核酸序列翻譯的氨基酸序列同一的氨基酸序列的核酸序列。術(shù)語(yǔ)"簡(jiǎn)并寡核苷酸"或"簡(jiǎn)并引物"用于表示能夠與以下耙核酸序列雜交的寡核苷酸在序列中不必同一，但與一個(gè)或多個(gè)特定區(qū)段內(nèi)彼此同源的靶核苷酸序列。在核酸序列的上下文中，術(shù)語(yǔ)"百分比序列同一性"或"同一的"指當(dāng)按最大對(duì)應(yīng)性進(jìn)行比對(duì)時(shí)相同的兩個(gè)序列中的殘基。序列同一性比較的長(zhǎng)度可以是至少約9個(gè)核苷酸，通常至少約20個(gè)核苷酸，更通常至少約24個(gè)核普酸，典型地至少約28個(gè)核苦酸，更典型地至少約32個(gè)核苷酸，和優(yōu)選至少約36個(gè)或更多個(gè)核苷酸。有本領(lǐng)域已知的許多不同的算法可以用于測(cè)量核苷酸序列的同一性。例如，可以使用FASTA、Gap或Bestfit(是在WisconsinPackage第10.0版,GeneticsComputerGroup(GCG),Madison,Wisconsin中的程序)來(lái)比較多核苷酸序列。FASTA提供查詢序列(querysequence)和查找序列(searchsequence)之間最佳重疊區(qū)i或的比對(duì)和百分比序列同一性。Pearson,MeAodsE"z;;mo/.183:63-98(1990)(通過(guò)整體引用結(jié)合到本文中)。例如，可以使用FASTA用其缺省參數(shù)(字長(zhǎng)(Wordsize)為6和用于計(jì)分矩陣的NOPAM因子)或使用Gap用如在GCG第6.1版中所提供的其缺省參數(shù)，12來(lái)測(cè)定核酸序列之間的百分比序列同一性，該FASTA和Gap通過(guò)引用結(jié)合到本文中?；蛘?，可以使用以下計(jì)算機(jī)程序來(lái)比較序列BLAST(Altschul等，J!Mo/.說(shuō)o/.215:403-410(1990);Gish和States.7Va加re3:266-272(1993);Madden等，Me仇266:131-141(1996);Altschul等，M/c/e/c」"A7仏25:3389-3402(1997);Zhang和Madden,Ge"ome7:649-656(1997))，尤其是blastp或tblastn(Altschul等，M/c/dc爿"'^/仏25:3389-3402(1997))。當(dāng)涉及核酸或其片段時(shí)，術(shù)語(yǔ)"基本上同源"或"基本上類似"指當(dāng)任選用另一核酸(或其互補(bǔ)鏈)與合適的核苦酸插入或缺失進(jìn)行比對(duì)時(shí)，根據(jù)任何已知的序列同一性算法進(jìn)行測(cè)量，在至少約50%，更優(yōu)選60%的核苷酸堿基，通常至少約70%，更通常至少約80%,優(yōu)選至少約90%，和最優(yōu)選至少約95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸堿基中存在核苷酸序列同一性，所述算法例如如上所述的FASTA、BLAST或Gap?；蛘?，當(dāng)核酸或其片段在嚴(yán)格雜交條件下與另一核酸，與另一核酸的鏈，或與其互補(bǔ)鏈雜交時(shí)，存在基本上同源或類似。在核酸雜交實(shí)驗(yàn)的上下文中，"嚴(yán)格雜交條件"和"嚴(yán)格漂洗條件"取決于許多不同的物理參數(shù)。核酸雜交將受這樣的條件如鹽濃度、溫度、溶劑、雜交種類的堿基組成、互補(bǔ)區(qū)域的長(zhǎng)度、和在雜交的核酸之間核苷酸堿基錯(cuò)配的數(shù)量影響，正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所容易理解的。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員知道如何改變這些參數(shù)，以完成特定的雜交嚴(yán)格性。一般來(lái)說(shuō)，為了在一系列特定條件下實(shí)現(xiàn)特異性DNA雜交，"嚴(yán)格雜交"在低于熱熔點(diǎn)(TJ約25。C下進(jìn)行。為了在一系列特定條件下實(shí)現(xiàn)特異性DNA雜交，"嚴(yán)格漂洗"在比Tm低約5。C的溫度下進(jìn)行。L為50%的靶序列與完全配對(duì)的探針雜交時(shí)的溫度。見(jiàn)Sambrook等，Mo/ecw/a/-C7om'wg:爿丄a60n3to7A/owwa/,第2片反,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1989)，第9.51頁(yè)，該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。為了本文的目的，對(duì)于溶液相的雜交而言，"嚴(yán)格條件"定義為在6XSSC(其中20XSSC包含3.0MNaCl和0.3M檸13檬酸鈉)，1。/。SDS中在65。C下持續(xù)8-12小時(shí)的水性雜交(即，不含曱酰胺)，接著在0.2XSSC,0,1%SDS中在65。C下持續(xù)20分鐘漂洗兩次。為技術(shù)人員所了解的是65"雜交將以不同的速率進(jìn)行，取決于許多因素包括雜交序列的長(zhǎng)度和百分比同一性。當(dāng)應(yīng)用至核酸序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)"突變的"指可以與參考核酸序列比較而插入、缺失或改變核酸序列中的核苷酸。可以在基因座進(jìn)行單個(gè)變更(點(diǎn)突變)或可以在單個(gè)基因座插入、缺失或改變多個(gè)核苷酸。另外，可以在核酸序列內(nèi)任何數(shù)目的基因座中進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)變更?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法使核酸序列突變，所述方法包括但不限于以下誘變技術(shù)例如"易錯(cuò)PCR"(在低DNA聚合酶拷貝保真度的條件下執(zhí)行PCR,致使沿著PCR產(chǎn)物全長(zhǎng)獲得高比例點(diǎn)突變的方法；參見(jiàn)例如，Leung等，rec/mz々we，1:11-15(1989)和Caldwell和Joyce，尸C7M^Ao&々/7"c.2:28-33(1992));和"寡核苦酸定向突變"(能夠在任何目標(biāo)克隆DNA區(qū)段中產(chǎn)生位點(diǎn)特異性突變的方法；參見(jiàn)例如，Reidhaar-Olson和Sauer,5We"ce241:53-57(1988))。本文所用術(shù)語(yǔ)"載體"意指能夠?qū)⒘硪缓怂徂D(zhuǎn)運(yùn)至已經(jīng)連入宿主細(xì)胞內(nèi)的核酸的核酸分子。載體的一個(gè)類型是"質(zhì)粒"，指可以連入另外的DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。其它載體包括粘粒、細(xì)菌的人造染色體(BAC)和酵母人造染色體(YAC)。載體的另一個(gè)類型是病毒載體，其中附加的DNA片段可以連接入病毒基因組內(nèi)(在下面更詳細(xì)地討論)。某些載體能夠在導(dǎo)入該載體的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有在宿主細(xì)胞內(nèi)起作用的復(fù)制起始區(qū)的載體)。其它載體可以在導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)被整合入宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)，并因此連同宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些優(yōu)選的載體能夠引導(dǎo)它們經(jīng)才乘作所連接的基因的表達(dá)。這樣的載體在本文中稱為"重組表達(dá)載體"(或簡(jiǎn)單地稱為"表達(dá)載體")。本文所用術(shù)語(yǔ)"目標(biāo)序列"或"目標(biāo)基因"指典型地編碼在宿主細(xì)胞內(nèi)非正常表達(dá)的目標(biāo)蛋白或目標(biāo)多肽的核^列。目標(biāo)序列或目標(biāo)基因包括與宿主細(xì)胞異源的基因和序列。目標(biāo)蛋白和目標(biāo)多肽也常常與宿主細(xì)胞異源。本文所公開的方法允許一種或多種目標(biāo)序列或目標(biāo)基因被穩(wěn)定地整合入宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)。目標(biāo)序列的非限制性實(shí)例包括編碼具有酶活性的一種或多種目標(biāo)多肽，例如影響宿主中iV-聚糖合成的酶例如甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、W-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶、UDP-iV-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、UDP-iV-乙酰半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶和巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，的序列。術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記序列"或"標(biāo)記基因"指能夠表達(dá)以下活性的核酸序列巴斯德畢赤酵母URA5基因是標(biāo)記基因，因?yàn)榭梢酝ㄟ^(guò)含該基因的細(xì)胞在缺乏尿嘧啶下生長(zhǎng)的能力來(lái)選擇它的存在。也可以通過(guò)含該基因的細(xì)胞在5-FOA下不能生長(zhǎng)來(lái)反向選擇它的存在。標(biāo)記序列或基因不必需要顯示陽(yáng)性的和陰性的選擇能力。來(lái)自巴斯德畢赤酵母(尸.;aWo^)的標(biāo)記序列或基因的非限制性實(shí)例包括^^7、///W和WL4丄對(duì)于抗生素抗性標(biāo)記基因，卡那霉素、新霉素、遺傳霉素(或G418)、巴龍霉素和潮霉素抗性基因通常用于允許在這些抗生素的存在下生長(zhǎng)。"操作連接的"表達(dá)控制序列指以下連接其中表達(dá)控制序列與目標(biāo)基因鄰接以控制目標(biāo)基因，以及表達(dá)控制序列反向或在一段距離處起作用以控制目標(biāo)基因的表達(dá)控制序列的連接。本文所用術(shù)語(yǔ)"表達(dá)控制序列"指影響它們經(jīng)操作所連接的編碼序列表達(dá)的多核苷酸序列。表達(dá)控制序列是控制核酸序列的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后事件和翻譯的序列。表達(dá)控制序列包括合適的轉(zhuǎn)錄起始、終止、啟動(dòng)子、和增強(qiáng)子序列；有效的RNA力口工信號(hào)例如剪接和多腺苷酸化信號(hào)；穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)mRNA的序列；提高翻譯效率的序列(例如，核蛋白體結(jié)合位點(diǎn))；提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列；和當(dāng)需要時(shí)，提高蛋白質(zhì)分泌的序列。這樣的控制序列的性質(zhì)根據(jù)宿主生物體而不同；在原核生物中，這樣的控制序列一般包括啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、和轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語(yǔ)"控制序列"有意至少包括表達(dá)所必需存在的所有成分，和也可以包括其存在是有益的附加成分，例如，前導(dǎo)序列和融合伙伴序列。本文所用術(shù)語(yǔ)"重組宿主細(xì)胞"("表達(dá)宿主細(xì)胞"、"表達(dá)宿主體系"、"表達(dá)體系"或簡(jiǎn)單地"宿主細(xì)胞")意指重組載體已經(jīng)被導(dǎo)入其中的細(xì)胞。應(yīng)該理解這樣的術(shù)語(yǔ)不僅意指特別的受試細(xì)胞而且意指這樣的細(xì)胞的后代。因?yàn)橛捎谕蛔兓颦h(huán)境影響某些修飾可能發(fā)生于后代中，所以這樣的后代實(shí)際上不可能與母細(xì)胞同一，但還被包括于如本文所使用的術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"的范圍內(nèi)。重組宿主細(xì)胞可以是生長(zhǎng)于培養(yǎng)物中的分離細(xì)胞或細(xì)胞系，或可以是存在于活組織或活生物體內(nèi)的細(xì)胞。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是酵母和真菌。術(shù)語(yǔ)"真核的"指有核細(xì)胞或有核生物體，并包括昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和低等真核細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"低等真核細(xì)胞"包括酵母、真菌類、領(lǐng)鞭毛蟲類、微孢子蟲類、嚢泡蟲類(alveolates)(例如，溝鞭藻類)、原生藻菌類(stramenopiles)(例如，褐藻、原生動(dòng)物)、紅藻植物(例如，紅藻)、植物(例如，綠藻、植物細(xì)胞、苔蘚)和其它的原生生物。術(shù)語(yǔ)"酵母"和"真菌"包括，但不限于畢赤酵母CPz'c/n'a^J、巴斯德畢赤酵母(尸ZcA/a;astonW、芬蘭畢赤酵母(尸/cAz'a^"/flw/^^、喜海藻糖畢赤酵母(乃'c/n'a^e/w/o^/n'/a)、尸z'c/n'atoc/amae、膜醭畢赤酵母(尸/c/^.a/we/w6rawaey^C7'ews)、孩i小畢赤酵母(尸z'cA/a/w7mto)(Qga,aefl畢赤酵母(尸z'c/n'a>sa//c/an'a)、尸Zc/n力gwe/rwwn、皮,杰普畢赤酵母CP/c/n'a、樹干畢赤酵母(尸/c/n'"、嗜甲畢赤酵母(尸z'c/n'a、酵母菌(iSacc/^raw少cess/.)、酉良酒酵母(Sacc/wrawjcescerev^'ae)、多形漢遜酵母(//a"5e"w/a;70/少附0/77/w)、克魯維酵母(A7w_ywro，ce"/.)、乳酸克魯維酵母(A7w"erom少ces/acfe」、白色念珠菌(Ca"&V/aa仿Zc""力、曲霉(^w^gi〃wss/.)、構(gòu)巢曲霉(y^/erg/〃w5w油/(ms)、黑曲霉(^/ergi〃wi1m.ger)、米曲霉(/ls/7erg〃/t^o，ae)、里氏木審(7Wc/ofife/7Wflre&sez.)、C7/9AS(w/7on.i/m/wcAzowewse、嫌孑包(尸wsan'wnsp.)、禾谷錄孑包(/^ksar/ww、Fwsan.wwvewewc^w附、尸/^C,re〃a/"&"s和粗輕脈胞菌(JVewms;oracmwa)。本文所用術(shù)語(yǔ)"肽"指短的多肽，例如典型地少于約50個(gè)氨基酸長(zhǎng)度且更典型地少于約30個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的多肽。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以制備衍生物、突變體、類似物和模擬結(jié)構(gòu)并因此模擬生物學(xué)功能的模擬物。術(shù)語(yǔ)"多肽"包括天然的和非天然的蛋白質(zhì)及其片段。多肽可以是單體或聚合體。此外，多肽可以包含各具有一種或多種不同活性的許多不同的域。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以制備或分離多肽的突變體、衍生物和類似物。術(shù)語(yǔ)"純化的"或"分離的"蛋白質(zhì)或多肽指由于其衍生的起源或中^發(fā)現(xiàn):純化物;:t，其中可以就其它細(xì)胞成份而論判斷純化物l例如，不含來(lái)自同一物種的其它蛋白質(zhì))，(3)由來(lái)自不同物種的細(xì)胞表達(dá)，或(4)在自然界中不存在(例如，它是在自然界中發(fā)現(xiàn)的多肽的片段或它包括在自然界中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的氨基酸類似物或衍生物或不是標(biāo)準(zhǔn)肽鍵的連接)的蛋白質(zhì)或多肽。因此，化學(xué)合成的多肽或在與多肽所來(lái)源的細(xì)胞體系不同的細(xì)胞體系中合成的多肽將從其天然締合的成分中"分離"。也可以使用本領(lǐng)域熟知的蛋白純化技術(shù)，通過(guò)分離，使多肽或蛋白質(zhì)基本上不含或純化天然締合的成分。如這樣所定義的，"分離的"不必要求這樣描述的蛋白質(zhì)、多肽、肽或寡肽已經(jīng)從其自然環(huán)境中物理地移出。本文所用術(shù)語(yǔ)"多肽片段"指具有缺失，例如，與全長(zhǎng)多肽比較的氨基端和/或羧基端缺失的多肽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽片段是鄰接的序列，其中片段的氨基酸序列與在天然存在的序列中的相應(yīng)位置同一。片段的長(zhǎng)度典型地為至少5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸，優(yōu)選至少12、14、16或18個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少20個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少25、30、35、40或45個(gè)氨基酸，甚至更優(yōu)選至少50或60個(gè)氨基酸，和甚至更優(yōu)選至少70個(gè)氨基酸。"修飾的衍生物"指在一級(jí)結(jié)構(gòu)序列中基本上同源的，但包括，17例如，在體內(nèi)的或在體外的化學(xué)修飾和生物化學(xué)修飾的、或摻入在天然多肽中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的氨基酸的多肽或其片段。這樣的修飾包括，例如，乙?；?、羧化、磷酰化、糖基化、泛素化、標(biāo)記例如用方文射性核素、和各種酶的修飾，如將容易被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所了解的。標(biāo)記多肽的多種方法和用于此目的的多種取代物或標(biāo)記物為本領(lǐng)域所熟知，并包括放射性同位素例如1251、32P、35S、和3仏結(jié)合至標(biāo)記的抗配體(例如，抗體)的配體，熒光團(tuán)，化學(xué)發(fā)光劑，酶，和可以用作標(biāo)記的配體的特異性結(jié)合配對(duì)成員的抗配體。標(biāo)記物的選擇依賴于所需要的靈敏度、與引物結(jié)合的容易程度、穩(wěn)定性要求、和可利用的儀器。用于標(biāo)記多肽的方法為本領(lǐng)域所熟知。見(jiàn)，例如，Ausubel等，CwreW尸rotoco/jZwMo/ecw/ar說(shuō)o/ogy,GreenePublishingAssociates(1992，和2002的增刊)(通過(guò)引用結(jié)合至本文中)。術(shù)語(yǔ)"融合蛋白"指包含與異源氨基酸序列偶聯(lián)的多肽或片段的多肽。融合蛋白是有用的，因?yàn)樗鼈兛梢员粯?gòu)建以包含來(lái)自兩個(gè)或多個(gè)不同蛋白的兩個(gè)或多個(gè)所需功能元件。融合蛋白包含來(lái)自多肽的至少10個(gè)鄰接氨基酸，優(yōu)選至少20或30個(gè)氨基酸，更優(yōu)選至少40、50或60個(gè)氨基酸，和常常更優(yōu)選至少75、100或125個(gè)氨基酸。包括整個(gè)目標(biāo)蛋白的融合體具有特殊的效用。包含于融合蛋白內(nèi)的異源多肽的長(zhǎng)度為至少6個(gè)氨基酸，常常至少8個(gè)氨基酸，和有用地為至少15、20、和25個(gè)氨基酸。融合體還包括較大的多肽、或甚至整個(gè)蛋白質(zhì)，例如綠色焚光蛋白("GFP"),具有特殊效用的含發(fā)色團(tuán)的蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)將編碼多肽或其片段的核酸序列在框內(nèi)與編碼不同蛋白質(zhì)或多肽的核,列一起構(gòu)建，然后表達(dá)融合蛋白，來(lái)重組產(chǎn)生融合蛋白?；蛘?，可以通過(guò)交聯(lián)多肽或其片段至另一蛋白質(zhì)，來(lái)以化學(xué)方法產(chǎn)生融合蛋白。術(shù)語(yǔ)"非肽類似物"指具有與那些參考多肽類似的性質(zhì)的化合物。非肽化合物也可以稱為"肽模擬物"("peptidemimetic"or"pepidomimetic，，)。見(jiàn)，i"列i口，Jones,爿wz'"o爿c/d尸e;"c/e^S少w^ew's,OxfordUniversityPress(1992);Jung,ComW虛o"'a/尸e/"'c/eawdA/o";e/"WeZ^'ZraWwi7aw必oo&,JohnWiley(1997》Bodanszky等，尸—V/eC7em&吵-j尸racto/rex必ooA:,SpringerVerlag(1993);S少wA"/c尸e;"t/es..爿t/seraGwWe，(Grant,纟扁!辱,W.H.FreemanandCo"1992);Evans等，丄Met/.CAem.30:1229(1987);Fauchere,/Wv.Z>wgA&y.15:29(1986);Veber和Freidinger,7Ve"^siVewcwc/"8:392-396(1985);和在以上各出版物中所引用的參考文獻(xiàn)，它們通過(guò)引用結(jié)合到本文中。這樣的化合物經(jīng)常在計(jì)算機(jī)分子模擬的幫助下開發(fā)。在結(jié)構(gòu)上與本發(fā)明的有用肽相似的肽模擬物可用于產(chǎn)生同等作用并因此被考慮為本發(fā)明的一部分。氨基酸置換可以包括以下的那些置換(1)降低對(duì)蛋白質(zhì)水解的敏感性，(2)降低對(duì)氧化的敏感性，(3)改變形成蛋白復(fù)合體的親和力，(4)改變結(jié)合親和力或酶活性，和(5)賦予或修飾這樣的類似物的其它物理化學(xué)或功能性質(zhì)。本文所用術(shù)語(yǔ)二十種常規(guī)氨基酸及其縮寫遵循常規(guī)用途。見(jiàn)/w腿wo/。gy-jiS^"欲e^(Golub和Gren編輯，SinauerAssociates,Sunderland,Mass.,第2版，1991),該文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。這20種常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸例如a-，a-二置換的氨基酸、N-烷基氨基酸、和其它非常規(guī)氨基酸也可能是適合于本發(fā)明的多肽的成分。非常規(guī)氨基酸的實(shí)例包括4-羥基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、s-WWW-三曱基賴氨酸、s-N-乙酰賴氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲酰曱硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、iV-曱基精氨酸、和其它相似的氨基酸和亞氨基酸(例如，4-羥基脯氨酸)。依照標(biāo)準(zhǔn)用途和慣例，在本文使用的多肽符號(hào)中，左手末端對(duì)應(yīng)氨基末端而右手末端對(duì)應(yīng)羧基末端。假如編碼蛋白質(zhì)的核酸序列具有與編碼第二蛋白質(zhì)的核酸序列相似的序列，那么蛋白質(zhì)與第二蛋白質(zhì)具有"同源性"或是"同源的"，。或者，如果兩種蛋白質(zhì)具有"相似的"氨基酸序列，那么該蛋白質(zhì)與第二蛋白質(zhì)具有同源性。(因此，術(shù)語(yǔ)"同源性蛋白質(zhì)"定義為指兩種蛋白質(zhì)具有相似的氨基酸序列)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，同源性蛋白質(zhì)是對(duì)野生型蛋白質(zhì)呈現(xiàn)至少65%的序列同源性，更優(yōu)選至少70%的序列同源性的蛋白質(zhì)。甚至更優(yōu)選是對(duì)野生型蛋白質(zhì)呈現(xiàn)至少75%、80%、85%或90%序列同源性的同源性蛋白質(zhì)。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，同源性蛋白質(zhì)呈現(xiàn)至少95%、98%、99%或99.9%的序列同一性。如在本文中所使用的，在氨基酸序列的兩個(gè)區(qū)域之間的同源性(尤其是就預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)相似性而論)解釋為意味著功能相似性。當(dāng)"同源的"用于指蛋白質(zhì)或肽時(shí)，認(rèn)為不具同一性殘基位置常常隨保守的氨基酸取代而不同。"保守的氨基酸取代"是其中氨基酸殘基被具有相似的化學(xué)性質(zhì)(例如，電荷或疏水性)的帶側(cè)鏈(驢團(tuán))的另一氨基酸殘基取代。一般而言，保守的氨基酸取代將基本上不改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。在兩個(gè)或多個(gè)氨基酸序列由于保守取代而互不相同的情況下，百分比序列同一性或同源性的程度可向上調(diào)節(jié)以校正取代的保守性。進(jìn)行該調(diào)節(jié)的方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。見(jiàn)，例如，Pearson，1994,MeAoc/jMo/.5z'o/.24:307-31和25:365-89(通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。以下6組各包含互相保守取代的氨基酸l)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);2)門冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);5)異亮氨酸(1)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。多肽的序列同源性，也被稱為百分比序列同一性，典型地使用序列分析軟件測(cè)量。見(jiàn)，例如，GWzWcyComjw^"0ow/(GCG)的&《wewce尸flc&age,UniversityofWisconsinBiotechnologyCenter,910UniversityAvenue,Madison,Wisconsin53705。蛋白質(zhì)分析軟件使用定位各種取代、缺失和其它修飾，包括保守的氨基酸取代的同源性的測(cè)量，來(lái)匹配相似的序列。例如，GCG包含程序例如"Gap"和"Bestfit",該程序可以按缺省參數(shù)使用，以測(cè)定在接近相關(guān)的多肽例如不同種生物體的同源多肽之間的或在野生型蛋白和其突變型蛋白之間的序列同源性或序列同一性。見(jiàn)，例如，GCG第6.1片反。當(dāng)使特定的多肽序列與含大量來(lái)自不同生物體的序列的數(shù)據(jù)庫(kù)比較時(shí)，優(yōu)選的算法是計(jì)算機(jī)程序BLAST(Altschul等，丄Mo/.所o/.20215:403-410(1990);Gish和States,胸騰3:266-272(1993);Madden等，￡""z>wo/.266:131-141(1996);Altschul等，7Vwc/e/c爿c^sWes.25:3389-3402(1997);Zhang和Madden,i仏7:649-656(1997))，尤其是blastp或tblastn(Altschul等，M/c/ez'c爿c^s紐25:3389-3402(1997》。BLASTp的優(yōu)選參數(shù)是期望值IO(缺省)；過(guò)濾器seg(缺省)；空位開放罰分ll(缺省)；空位擴(kuò)展罰分1(缺省)；最大比對(duì)100(缺省)；字長(zhǎng)ll(缺省)；描述的序號(hào)100(缺省)；罰分矩陣BLOWSUM62。用于同源性比較的多肽序列長(zhǎng)度將一般是至少約16個(gè)氨基酸殘基，通常至少約20個(gè)殘基，更通常至少約24個(gè)殘基，典型地至少約28個(gè)殘基，和優(yōu)選多于約35個(gè)殘基。當(dāng)搜索包含來(lái)自大量不同生物體的序列的數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，優(yōu)選比較氨基酸序列?？梢酝ㄟ^(guò)除blastp以外的本領(lǐng)域已知算法來(lái)測(cè)量使用氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)搜索。例如，可以使用GCG第6.1版中的程序FASTA，來(lái)比較多肽序列。FASTA提供查詢序列和搜索序列之間最佳重疊區(qū)域的比對(duì)和百分比序列同一性。Pearson,M^AoA五"^ymo/.183:63-98(1990)(通過(guò)引用結(jié)合到本文中)。例如，可以使用如在GCG第6.1版中所提供的FASTA用其缺省參數(shù)(字長(zhǎng)為2和PAM250計(jì)分矩陣)測(cè)定氨基酸序列之間的百分比序列同一性，該GCG第6.1版通過(guò)51用結(jié)合到本文中。本文所用術(shù)語(yǔ)"區(qū)域"指生物分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)的在物理上的鄰接部分。對(duì)于蛋白質(zhì)而言，區(qū)域被定義為該蛋白質(zhì)的氨基酸序列鄰接部分。本文所用術(shù)語(yǔ)"結(jié)構(gòu)域"指提供生物分子已知或未知功能的生物分子結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)域可與區(qū)域或其部分共延伸；結(jié)構(gòu)域也可以包括生物分子的不同的、非連續(xù)的區(qū)域。本文所用術(shù)語(yǔ)"分子"指任何化合物，包括但不限于小分子、肽、蛋白質(zhì)、糖、核苦酸、核酸、脂質(zhì)、等，并且這樣的化合物可以是天然的或合成的。本文所用術(shù)語(yǔ)"包含"或變體例如"包括"或"含有約"，將被理解為指包含規(guī)定的整體或成組的整體但不排除任何其它的整體或成組的整體。當(dāng)提及存在于糖蛋白制劑中的聚糖的"摩爾百分率"時(shí)，該術(shù)語(yǔ)指當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)制劑用PNG酶處理時(shí)釋放的，然后通過(guò)不受糖形組合影響的方法定量的，存在于N聯(lián)寡糖合并中的特定聚糖的摩爾百分率(例如，用熒光標(biāo)記例如2-氨基苯曱酰胺標(biāo)記PNG酶釋放的聚糖庫(kù)(po01)，然后用高效液相色譜或毛細(xì)管電泳分離，再通過(guò)焚光強(qiáng)度定量聚糖)。例如，50摩爾百分率GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA^g:50%的釋放的聚糖是GlcNAc2Mari3GlcNAc2Gal2NANA2，且其余的50%由其它N-聯(lián)寡糖組成。在實(shí)施方案中，特定聚糖在糖蛋白制劑中的摩爾百分率將是20%-100%，優(yōu)選大于25%、30%、35%、40%或45%，更優(yōu)選大于50%、55%、60%、65%或70%，和最優(yōu)選大于75%、80%、85%、90%或95%。本文所用術(shù)語(yǔ)"主要地"或變體例如"主要"或"是主要的"將被理解為指在已經(jīng)用PNG酶處理糖蛋白并由質(zhì)鐠例如MALDI-TOFMS分析釋放的聚糖之后具有最高摩爾百分率(％)的總iV-聚糖的聚糖種類。換句話說(shuō)，短語(yǔ)"主要地"定義為個(gè)體實(shí)體，例如特定糖形，以比任何其它個(gè)體實(shí)體更大的摩爾百分率存在。例如，假如組合物由40摩爾百分率的種類A、35摩爾百分率的種類B和25摩爾百分率的種類C組成，則組合物主要包含種類A。術(shù)語(yǔ)"有效治療量"指本發(fā)明的重組促紅細(xì)胞生成素的量，其給與提供患者益處的血細(xì)胞比容增加。所述量將在個(gè)體之間改變，并將依賴于許多因素，包括患者的整體身體狀況和貧血的潛在原因。例如，用于慢性腎衰患者的本發(fā)明促紅細(xì)胞生成素的有效治療量可以為基于治療適應(yīng)癥的20-300單位/kg或0.5ug/kg-500ug/kg。術(shù)語(yǔ)"單位"指用于評(píng)估促紅細(xì)胞生成素組合物活性的本領(lǐng)域通常已知的單位。l毫克的純促紅細(xì)胞生成素約等價(jià)于150,000單位。給藥時(shí)間表可以為約3次/周-約l次/4或6周。實(shí)際的時(shí)間表將取決于許多因素包括給予患者的促紅細(xì)胞生成素的類型(EPO或PEG基化的EPO)和個(gè)體患者的反應(yīng)。較高的劑量范圍通常不用于貧血應(yīng)用但可以用在其它治療應(yīng)用上。達(dá)到和確立用于患者的促紅細(xì)胞生成素的合適劑量的方法為本領(lǐng)域所熟知并通常在本領(lǐng)域中實(shí)踐。在患者之間給予的量和給藥時(shí)間表的變更包括參考術(shù)語(yǔ)"約"與量或時(shí)間表相結(jié)合。用于治療的促紅細(xì)胞生成素的量給予可接受的血細(xì)胞比容增加速率和使血細(xì)胞比容維持在有益的水平(例如，通常至少約30%和典型地為30%-36%)。由本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用公眾可利用的材料和方法，可容易地確定本發(fā)明組合物的有效治療量。另外，可在治療期間給予患者鐵，以維持增加的紅細(xì)胞生成。通過(guò)本領(lǐng)域的技術(shù)人員通常使用的方法，可能容易地確定給予的量。因此本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成素可以用于刺激紅細(xì)胞產(chǎn)生和矯正降低的紅細(xì)胞水平。促紅細(xì)胞生成素的最通常的治療應(yīng)用是矯正由于貧血而降低的紅細(xì)胞水平。可由本發(fā)明治療的病癥包括與腎功能的減退或喪失(慢性腎衰竭)有關(guān)的貧血，與骨髓抑制治療例如化學(xué)治療藥物或抗病毒藥物(例如AZT)有關(guān)的貧血，與非骨髓癌癥的進(jìn)展有關(guān)的貧血，和與病毒感染(例如HTV)有關(guān)的貧血。另外，本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成素可以用于預(yù)防或減少以下中風(fēng)的神經(jīng)元損傷(尤其是非唾液酸化的epo(促紅細(xì)胞生成素))，充血性心力衰竭、用于脊髓損傷的治療，即，抗炎、抗凋亡和除紅細(xì)胞生成之外干細(xì)胞的募集。也可治療可在其他健康個(gè)體中導(dǎo)致貧血的病癥，例如在手術(shù)期間預(yù)期的失血。一般而言，可用促紅細(xì)胞生成素治療的任何病癥一般可以用本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成素治療。I.糖基化本發(fā)明提供在已經(jīng)經(jīng)過(guò)遺傳工程改造以產(chǎn)生具有作為主要種類特定所需N-聚糖的糖蛋白的低等真核宿主細(xì)胞中，用于轉(zhuǎn)化、表達(dá)和選擇重組蛋白尤其是促紅細(xì)胞生成素的方法和材料。在某些實(shí)施方案所需N-聚糖的促紅細(xì)胞生成素、或促紅細(xì)胞生成素的變體。在優(yōu)選的23實(shí)施方案中，主要的N-聚糖是對(duì)哺乳動(dòng)物尤其是人不致免疫的N-聚糖，或與超甘露糖化的糖蛋白相比具有降低的免疫原性的N-聚糖。例示性的糖基化模式顯示于圖9A-9B中。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，主要的N-聚糖為完全唾液酸化的聚糖，表示為GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，主要的N-聚糖可以是部分唾液酸化的或脫唾液酸化的聚糖；完全半乳糖基化的聚糖；部分半乳糖基化的聚糖；或脫半乳糖基化的聚糖。因此，優(yōu)選的實(shí)施方案包括其中主要的N-聚糖為以下的那些實(shí)施方案GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA;GlcNAc2Man3GlcNAc2GalNANA;GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2;GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal;GlcNAc2Man3GlcNAcGal;GlcNAc2Man3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAci^GlcNAc2Man3。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，主要的N-聚糖為部分半乳糖基化的聚糖，表示為GlcNAc2Man3GlcNAc2Galn,其中n可以是l或2。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，主要的N-聚糖可以為雜合糖形，由下式表示GlcNAc2Man(4.5)GlcNAc(o-,)Gal((M)NANA((M)。優(yōu)選的實(shí)施方案包括其中主要的N-聚糖為以下的那些實(shí)施方案GlcNAc2Man5GlcNAcGalNANA、GlcNAc2Man5GlcNAcGal;和GlcNAc2MansGlcNAc和GlcNAc2Man5。許多野生型低等真核細(xì)胞，包括酵母和真菌，例如巴斯德畢赤酵母(乃'c/^a;Mton'5,產(chǎn)生無(wú)任何核心巖藻糖的糖蛋白。因此，在以上實(shí)施方案中，依照本發(fā)明產(chǎn)生的重組糖蛋白可以缺乏巖藻糖，或基本上不含巖藻糖?；蛘撸谀承?shí)施方案中，重組低等真核宿主細(xì)胞可經(jīng)遺傳修飾以包括巖藻糖基化途徑，因此致使產(chǎn)生重組糖蛋白組合物，在該組合物中主要的N-聚糖被巖藻糖基化。除非特別地指明，可以以脫巖藻糖基化的形式，或呈現(xiàn)核心巖藻糖基化，來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的糖蛋白組合物。在本發(fā)明中，依照上面所述所生產(chǎn)的重組糖蛋白然后被化學(xué)修飾，以改善其物理特征，特別是血清半壽期和藥代動(dòng)力學(xué)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)連接一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇(PEG)部分至所述重組糖蛋白，產(chǎn)生PEG基化的糖蛋白，來(lái)實(shí)現(xiàn)該化學(xué)修飾。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)連接一個(gè)或多個(gè)PEG部分至重組糖蛋白的N-末端氨基酸，產(chǎn)生N-末端PEG基化的糖蛋白，來(lái)修飾重組糖蛋白。II.促紅細(xì)胞生成素促紅細(xì)胞生成素(EPO)為在腎臟中產(chǎn)生的刺激晚期祖紅細(xì)胞分化成成熟紅細(xì)胞的造血糖蛋白。促紅細(xì)胞生成素通過(guò)結(jié)合至紅細(xì)胞前提上的受體而發(fā)揮其生物活性。促紅細(xì)胞生成素基因不是人類特有的。類似的基因已經(jīng)在其它物種，包括許多哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)Wen等，祝oo"(1993);82:1507-16)。因此，人類基因和非人類基因都可以如本文所述表達(dá)，而促紅細(xì)胞生成素的變體也可用于本發(fā)明的方法中。天然存在的人促紅細(xì)胞生成素首先被翻譯成包含在166位有精氨酸的166個(gè)氨基酸多肽鏈。在翻譯后修飾中，用羧肽酶切割精氨酸166。165個(gè)氨基酸的人促紅細(xì)胞生成素的一級(jí)結(jié)構(gòu)顯示于SEQIDNO:2中，而該EPO的核酸顯示于SEQIDNO:l中。促紅細(xì)胞生成素的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括Cys7-Cysl61和Cys29-Cys33之間的兩個(gè)二硫鍵。以分子量計(jì)，完全糖基化的EPO包含約40。/o的糖基(Sasaki,H.，等，J.Biol.Chem.262(1987)12059-12076)。沒(méi)有聚糖部分的人促紅細(xì)胞生成素的多肽鏈的分子量為18,236Da。因?yàn)榇偌t細(xì)胞生成素是在紅細(xì)胞形成中所必需的，所以它用于治療特征在于紅細(xì)胞生成低或有缺陷的血液病癥。在臨床上，促紅細(xì)胞生成素用于治療各種疾病，例如，在慢性腎衰患者(CRF)中的和在接受化療的AIDS和癌癥患者中的貧血(Danna,R.P.,等，In:MB,Gamick:尸era;ec"ve.NewYork,N.Y.:MarcelDekker;1990,第301-324頁(yè))。然而，目前可用的蛋白質(zhì)療法如促紅細(xì)胞生成素的生物利用度受限于它們的短血漿半衰期和對(duì)蛋白酶降解的敏感性。這些缺點(diǎn)阻止它們達(dá)到最大的臨床效能。例如，在許多參考文獻(xiàn)包括美國(guó)專利第4,835,260號(hào)；WO94/25055;WO94/24160;WO94/02611;WO95/05465中，已經(jīng)公開了EPO的氨基酸序列的修飾。已經(jīng)使用重組體DNA技術(shù)生物合成制備促紅細(xì)胞生成素(Egrie,J.C,等，/mww"o&o/.72(1986)213-224)。目前用于人類治療的促紅細(xì)胞生成素為插入中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢組織細(xì)胞(CHO細(xì)胞)中并在其中表達(dá)的克隆的人EPO基因的產(chǎn)物。人尿來(lái)源促紅細(xì)胞生成素和重組促紅細(xì)胞生成素(在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá))都包含三個(gè)N-聯(lián)的和一個(gè)O-聯(lián)的寡糖鏈，該寡糖鏈共包含糖蛋白的總分子量的約40%。N-聯(lián)糖基化發(fā)生在位于24、38和83位的天冬酰胺殘基處，而0-聯(lián)糖基化發(fā)生在位于126位的絲氨酸殘基處(Lai，等,/.Ao/.C7^w.261(1986)3116;Broudy，V.C，等，Ac/.所oc/em.所o//^.265(1988)329)。已顯示用末端唾液酸殘基來(lái)修飾寡糖鏈。酶處理糖基化的促紅細(xì)胞生成素以去除所有的唾液酸殘基，致使體內(nèi)活性的損失但不影響體外活性(Lowy等，A^we185(1960)102;Goldwasser，E.,等所o/.C7^m.249(1974)4202-4206)。該行為已被解釋為在與肝臟的脫唾液酸糖蛋白結(jié)合蛋白相互作用時(shí)，脫唾液酸促紅細(xì)胞生成素從循環(huán)中快速清除(Morrell等，《/說(shuō)o/.CAem.243(1968)155;Briggs,D.W.，等，Jm.J.尸/^w'o/.227(1974)1385-1388;Ashwell，G.,和Kawasaki，T.，Me/Zzois￡"2^wo/.50(1978)287-288)。因此，促紅細(xì)胞生成素僅當(dāng)它被唾液酸化以避免與脫唾液酸糖蛋白結(jié)合蛋白結(jié)合時(shí)，才具有體內(nèi)生物活性。在促紅細(xì)胞生成素的寡糖鏈中其它成分的作用還沒(méi)有被充分確定。已經(jīng)顯示部分二糖基化促紅細(xì)胞生成素的體內(nèi)活性與糖基化形式相比大大地降低，但保持體外活性(Dordal，M.S.,等，￡w/ocn>zo/ogv116(1985)2293-2299)。然而，在另一研究中，通過(guò)誘變糖基化位點(diǎn)的天冬酰胺或絲氨酸殘基而單獨(dú)地或一起去除N-聯(lián)寡糖鏈或O-聯(lián)寡糖鏈，急劇地降低哺乳動(dòng)物細(xì)胞中所產(chǎn)生經(jīng)過(guò)改變的促紅細(xì)胞生成素的生物活性(Dube,S.,等，/.則.CA亂263(1988)17516-17521)。寡核苷酸定向突變已被用于制備缺乏糖基化所特有位點(diǎn)的EPO結(jié)構(gòu)突變體(Yamaguchi,K.,等，丄所o/.CAem.266(1991)20434-20439;和Higuchi,M.,等,乂CAew.267(1992)7703-7709)。在以下中描述了非糖基化EPO在大腸桿菌(五.co/Z)中的克隆和表達(dá)Lee-Huang，S,，尸亂扁.爿cW.園61(1984)2708-2712;和美國(guó)專利第5，641，663號(hào)。歐洲專利0640619涉及包含有至少一個(gè)附加糖基化位點(diǎn)的氨基酸序列的人促紅細(xì)胞生成素類似物。該增加的糖基化位點(diǎn)可致使比人促紅細(xì)胞生成素更多的糖鏈，和更高的唾液酸含量。也提供包含有至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)重排的氨基酸序列的促紅細(xì)胞生成素類似物。包含添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸至促紅細(xì)胞生成素羧基末端的類似物也被包括，其中該添加提供至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)。與CHO細(xì)胞產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素相比，畢赤酵母(乃'c/^)產(chǎn)生的具有人源化的糖基化的促紅細(xì)胞生成素在包含N-和O-糖基化的連接的寡糖結(jié)構(gòu)方面更具多很多的一致性。用糖形混合物，包括具有不同量的唾液酸化的二、三和四天線型式，產(chǎn)生CHO來(lái)源的rhEPO。工藝過(guò)程開發(fā)用于富集四天線的唾液酸化的糖形，該糖形包含小部分的N-聚糖予貞富集(Restelli等,200(5A'o/ec/2"o/ogy及.oe/7g^een'"g94(3)第481-494頁(yè))。另外，雖然在人源化的酵母中的唾液酸化不包括N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NGNA),但是CHO細(xì)胞產(chǎn)生的唾液酸化的促紅細(xì)胞生成素包含NANA(N-乙酰神經(jīng)氨酸)和NGNA的混合物。哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素富集包含唾液酸化的N-聯(lián)聚糖的糖。富集四天線的糖形在促紅細(xì)胞生成素的N-聚糖上增加乳糖胺重復(fù)的比率。包含這些重復(fù)的促紅細(xì)胞生成素分子可能具有受損的體內(nèi)效能，因?yàn)榫廴樘前分貜?fù)的存在已經(jīng)與經(jīng)肝臟從循環(huán)快速清除有關(guān)(Fukuta等，(1989)S/ood，第73巻，84)。乳糖胺部分也被報(bào)道與凝集素的半乳凝素家族結(jié)合，糖類結(jié)合蛋白在不同細(xì)胞和組織類型的細(xì)胞表面上不同地表達(dá)。具體地講，半乳凝素-3特異地識(shí)別乳糖胺。已發(fā)現(xiàn)半乳凝素-3在許多不同腫瘤細(xì)胞類型的細(xì)胞表面上過(guò)量表達(dá)，并涉及細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移(Deininger等,(2002)^w"cflwcer7asearc/z，第22巻,1585》因此，包含乳糖胺重復(fù)的糖蛋白可以潛在地靶向在細(xì)胞表面上表達(dá)半乳凝素-3的細(xì)胞。此外，這還呈現(xiàn)以下潛在的風(fēng)險(xiǎn)含乳糖胺的糖蛋白可選擇性地靶向可能碰巧負(fù)有糖蛋白同源受體的肺瘤細(xì)胞。就促紅細(xì)胞生成素而言，包含乳糖胺的部分促紅細(xì)胞生成素可優(yōu)先靶向腫瘤細(xì)胞，且如果存在促紅細(xì)胞生成素受體，則可出現(xiàn)異常的促細(xì)胞分裂信號(hào)，促使具有轉(zhuǎn)移潛力的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。巴斯德畢赤酵母(乃'c/^a戸Won'力產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素缺乏不必要的糖形如乳糖胺重復(fù)。這將可能減緩關(guān)于EPO和其它糖蛋白的致瘤潛在性的憂慮。其它差異包括在畢赤酵母(尸Zc&a)產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素中完全缺乏連接的核心巖藻糖和聚乳糖胺，而在CHO細(xì)胞模型(version)中兩者都存在，且在O-聚糖組合物上有變化，與可在畢赤酵母(A'd^)產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素上發(fā)現(xiàn)的O-甘露糖相比，在CHO產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素上具有O-GalNAc結(jié)構(gòu)的異質(zhì)混合物。在CHO產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素中，唾液酸連接主要為a2,3,并存在一些a2,6,而赤酵母(尸z'c/^)產(chǎn)生的促紅細(xì)胞生成素僅包含a2,6(Hamilton,Sde"ce第313巻，第1441-1443頁(yè))，與主要包含a2,6連接的唾液酸的人尿促紅細(xì)胞生成素相似。促紅細(xì)胞生成素(EPO)是組織保護(hù)性細(xì)胞因子，已經(jīng)顯示預(yù)防血管性痙攣、細(xì)胞凋亡和炎癥應(yīng)答。雖然以其在血細(xì)胞生成上的活性著稱，EPO也影響其它組織，包括神經(jīng)系統(tǒng)。動(dòng)物模型已經(jīng)證明單劑量的rhEPO對(duì)急性損傷(4-6，19)的治療有效。例如，將EPO注入遭受頸總動(dòng)脈閉塞的沙鼠的側(cè)腦室，防止局部缺血誘導(dǎo)的學(xué)習(xí)病廢和使海馬神經(jīng)元從退化中恢復(fù)(Bernaudin等(1999)■/Ce"6F/owMetaZ19,643)。體內(nèi)研究已證明EPO對(duì)各種形式的神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用(Brines等.(2000),iW截97，10526;Celik等.(2002),/W戲99,2258;Junk等,(2002)，/WAS",99,10659)。然而，許多臨床狀況可能需要多劑量的28rhEPO，多劑量的rhEPO很可能導(dǎo)致血細(xì)胞比容潛在性地受損增加，因此對(duì)將重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)作用潛在的神經(jīng)保護(hù)性治療的積極性作出了控制。該論點(diǎn)被動(dòng)物模型支持，后者清楚地顯示血細(xì)胞比容的EPO-依賴式增加可以？1起和放大腦損傷。該矛盾的潛在解決方案可以是通過(guò)使用具有雙天線的糖基化EPO,該EPO對(duì)動(dòng)物模型中的血細(xì)胞比容具有最小的影響(Hamilton等.(2006)5We"ce313,1441)。因此，用于炎癥治療的具有雙天線糖基化的多次高劑量的EPO可對(duì)總血細(xì)胞比容影響很小。可用于炎癥治療的另一受到關(guān)注的糖形為沒(méi)有末端唾液酸化的雙天線的EPO。這也作為不顯著增加血細(xì)胞比容的抗炎劑可用作有效的治療。該分子的附加優(yōu)點(diǎn)將是相對(duì)于脫唾液酸糖蛋白受體的優(yōu)選底物即三天線和四天線的末端半乳糖基化的糖形，它降低與該肝臟受體的親和力。因此，具有雙天線的唾液酸化的糖基化的EPO的優(yōu)點(diǎn)是肝臟清除率降低、對(duì)血細(xì)胞比容和優(yōu)選的神經(jīng)組織分布影響小。可以根據(jù)本發(fā)明，通過(guò)在缺乏本文顯示的糖基化途徑的唾液酸化部分的酵母細(xì)胞中表達(dá)EPO，來(lái)制備脫唾液酸EPO。III.編碼糖蛋白的核酸本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成素由核酸編碼。該核酸可以為DNA或RNA,典型地為DNA。編碼糖蛋白的核酸可操作連接至允許糖蛋白表達(dá)的調(diào)控序列。這樣的調(diào)控序列包括啟動(dòng)子和任選包括上游增強(qiáng)子，或5'至編碼融合蛋白的核酸和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)3'或從編碼糖蛋白的核酸開始的下游區(qū)。該核酸也典型地編碼具有核糖體結(jié)合位點(diǎn)的5'UTR區(qū)和3'非翻譯區(qū)。該核酸通常為將該核酸轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞中的載體的成分，所述宿主細(xì)胞表達(dá)糖蛋白。該載體也可包含標(biāo)記物以允許識(shí)別已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。然而，一些宿主細(xì)胞類型，特別是酵母，可用缺乏外來(lái)載體序列的核酸成功地轉(zhuǎn)化。編碼本發(fā)明的所需促紅細(xì)胞生成素的核酸可從幾個(gè)來(lái)源獲得?？梢允褂帽Ｊ貐^(qū)域引物，從已知表達(dá)該糖蛋白的細(xì)胞系擴(kuò)增cDNA序列(見(jiàn)，例如，Marks等，/Mo/.581-596(1991))。也可根據(jù)科學(xué)文獻(xiàn)中的序列從頭合成核酸。也可以通過(guò)延伸跨越較大核酸(例如基因組DNA)的所需序列的重疊寡核苷酸來(lái)合成核酸(見(jiàn)，例如，Caldas等，E"一固'"g，13,353-360(2000))。本發(fā)明優(yōu)選使用編碼哺乳動(dòng)物促紅細(xì)胞生成素的核酸，最優(yōu)選使用編碼人促紅細(xì)胞生成素的核酸。人促紅細(xì)胞生成素為本領(lǐng)域所熟知，為165個(gè)或166個(gè)氨基酸的蛋白。以下核苷酸序列和氨基酸序列是例示性的優(yōu)選序列，可以用于本發(fā)明。EPO核苷酸序列[SEQIDNO:l]ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTCCTCCACCAAGATTGATTTGTGACTCCAGAGTTTTGGAGAGATACTTGTTGGAGGCTAAAGAGGCTGAGAACATCACTACTGGTTGTGCTGAACACTGTTCCTTGAACGAGAACATCACAGTTCC八GACACTAAGGTTAACTTCTACGCTTGGAAGAGAATGGAAGTTGGACAACAGGCTGTTGAAGTTTGGCAAGGATTGGCTTTOTTGTCCGAGGCTGTTTTGAGAGGTCAAGCTTTGTTGGTTAACTCCTCCCAACCATGGGAACCATTGCAATTGCACGTTGACAAGGCTGTTTCTGGATTGAGATCCTTGACTACTTTGTTGAGAGCTTTGGGTGCTCAGAAAGAGGCTATTTCTCCACCAGATGCTGCTTCAGCTGCTCCATTGAGAACTATCACTGCTGACACTTTCAGAAAGTTGTTCAGAGTTTACTCCAACTTCTTGAGAGGAAAGTTGAAGTTGTACACTGGTGAAGCTTGTAGAACTGGTGACTAGTAAEPO氨基酸序列[SEQIDNO:2]APPRLICDSRVLERYLLEAKEAENTTTGCAEHCSLNENTTVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDIV.宿主細(xì)胞低等真核細(xì)胞，例如酵母和真菌，優(yōu)選用于本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成素的表達(dá)，因?yàn)樗鼈兛山?jīng)濟(jì)地培養(yǎng)、得到高產(chǎn)率、和當(dāng)適當(dāng)修飾時(shí)能夠合適地糖基化。特別地，酵母提供建立的遺傳學(xué)，允許快速轉(zhuǎn)化、試驗(yàn)蛋白定位策略和簡(jiǎn)易的基因敲除技術(shù)。合適的載體具有表達(dá)控制序列，例如啟動(dòng)子，包括3-磷酸甘油酸酯激酶或其它的糖解酶，和復(fù)制起始區(qū)、終止序列和所需的等等。各種酵母，例如乳酸克魯維酵母(《./acto)、巴斯德畢赤酵母(A'c/^萍,—、嗜曱畢赤酵母CPic/iiame決畫闊和多形漢遜酵母(//a^eww/fl戶o/jmo^7Afl)優(yōu)選用于細(xì)胞培養(yǎng)，因?yàn)樗鼈兡軌蛏L(zhǎng)至高細(xì)胞密度并分泌大量的重組蛋白。同樣地，絲狀真菌，例如里氏木霉(7Wc/ocifer應(yīng)rease()、黑曲霉(^sperg〃/iw"扭r)、鐮孑包(尸W5"".訓(xùn)粗糙脈胞菌(A^wra;^oracmwa)和其它的絲狀真菌可用于制備本發(fā)明的糖蛋白。低等真核生物，尤其是酵母和真菌，可以被遺傳修飾，致使它們表達(dá)其中糖基化方式為與人類相似的或人源化的糖蛋白。這可以通過(guò)消除所選擇的內(nèi)源性糖基化酶和/或提供外源性酶而獲得，如Gerngross等，美國(guó)20040018590和7,029,872所述，該公開通過(guò)引用結(jié)合到本文中。例如，可選擇或工程改造宿主細(xì)胞以使l,6-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶活性缺失，該轉(zhuǎn)移酶將另外添加甘露糖殘基至糖蛋白的N-聚糖上。使用本發(fā)明的方法和材料，可能生產(chǎn)包含多種糖形的糖蛋白組合物，各種糖形包含至少一種與其連接的N-聚糖，其中該糖蛋白組合物因此包含多種N-聚糖，其中主要的糖形包含所需N-聚糖。利用在Gemgross等，美國(guó)20040018590和7,029,872中所述的，加上本發(fā)明的工具，有可能產(chǎn)生許多不同的N-聯(lián)糖形。取決于特定的需要，本發(fā)明的方法可用于獲得糖蛋白組合物，其中主要的N-糖形以比下一種最主要的N-糖形多5-80摩爾百分率的量存在；在優(yōu)選的實(shí)施方案中，主要的N-糖形可以以比下一種最主要的N-糖形多以下摩爾百分比的量存在10-40摩爾百分率；20-50摩爾百分率；30-60摩爾百分率；40-70摩爾百分率；50-80摩爾百分率。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，主要的N-糖形為所需N-糖形，以N-聚糖總數(shù)的大于25摩爾百分率；大于35摩爾百分率；大于50摩爾百分率；大于60摩爾百分率；大于75摩爾百分率；或大于80摩爾百分率的量存在。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，載體可用一個(gè)或多個(gè)選擇標(biāo)記基因，和編碼轉(zhuǎn)化入合適宿主細(xì)胞的促紅細(xì)胞生成素的一個(gè)或多個(gè)所需基因來(lái)構(gòu)建。例如，一個(gè)或多個(gè)基因選擇標(biāo)記基因可與一個(gè)或多個(gè)基因物理連接，后者表達(dá)用于分離的所需促紅細(xì)胞生成素肽或蛋白或具有所需活性的所述促紅細(xì)胞生成素肽或蛋白的片段，可與載體內(nèi)的選擇基因聯(lián)合。所述選擇標(biāo)記基因和促紅細(xì)胞生成素基因可排列在一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)化載體上，致使促紅細(xì)胞生成素基因在轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞中的存在與選擇標(biāo)記基因在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的表達(dá)有關(guān)。例如，兩種基因可以插入同一物理質(zhì)粒內(nèi)，受單個(gè)啟動(dòng)子的控制，或受兩個(gè)分開的啟動(dòng)子的控制。也可能需要將基因插入不同的質(zhì)粒內(nèi)并共轉(zhuǎn)化入細(xì)胞中。在本發(fā)明中可用作宿主細(xì)胞的其它細(xì)胞包括原核細(xì)胞，例如大腸桿菌(五.CO")，和細(xì)胞培養(yǎng)中的真核宿主細(xì)胞，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。V.化學(xué)修飾的促紅細(xì)胞生成素如上所述，為了增強(qiáng)性質(zhì)，可以使聚合物載體與蛋白質(zhì)如促紅細(xì)胞生成素結(jié)合。用于連接用作載體的化學(xué)部分的各種方法都是當(dāng)前可利用的，見(jiàn)，例如，專利合作條約("PCT")國(guó)際公開號(hào)W096/11953，才示題為"A^rerw/""http://^C7ze附/ca/(yMo(^^ed尸ro/dwCbw/os"/o"5M"/iocfe",該文獻(xiàn)通過(guò)整體引用結(jié)合到本文中。該P(yáng)CT說(shuō)明書除了其他內(nèi)容以外還公開了使水溶性聚合物與蛋白質(zhì)的N-末端選擇性連接?；瘜W(xué)修飾的促紅細(xì)胞生成素組合物(即，"衍生物")，其中蛋白質(zhì)或多肽與聚合物連接，包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所選擇的聚合物典型地為水溶性的，致使它所連接的蛋白質(zhì)在水性環(huán)境如生理環(huán)境中不沉淀。所選擇的聚合物通常經(jīng)過(guò)修飾，以具有單個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，例如用于?；幕钚怎セ蛴糜谕榛娜率咕酆隙瓤山?jīng)過(guò)控制提供用于本方法。包括在修飾的促紅細(xì)胞生成素組合物的范圍內(nèi)的有聚合物的混合物。優(yōu)選，為了最終產(chǎn)物制劑的治療用途，該聚合物將是藥學(xué)上可接受的。上述水溶性的聚合物或其混合物可選自例如，聚乙二醇(PEG)、32單甲氧基聚乙二醇、葡糖聚、纖維素、或其它基于糖類的聚合物、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇同聚物、氧化丙烯/環(huán)氧乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如，甘油)、和聚乙烯醇。對(duì)于?；磻?yīng)而言，所選擇的聚合物應(yīng)具有單個(gè)反應(yīng)性酯基。對(duì)于還原性烷化作用而言，所選擇的聚合物應(yīng)具有單個(gè)反應(yīng)性醛基。該聚合物可具有任何分子量，可為支化支化的或不支化支化的。本文使用的特別優(yōu)選的水溶性聚合物為聚乙二醇，縮寫為PEG。本文所用的聚乙二醇指包含已用于衍生其它蛋白質(zhì)的任何形式PEG,如單(d-Qo)烷氧基或芳氧基-聚乙二醇。PAL的PEG基化(即通過(guò)添加PEG或PEG衍生物的修飾)可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何PEG基化反應(yīng)進(jìn)行，例如在以下參考文獻(xiàn)中所描述的F畫5ow尸flc她3:4-10(1992);EP0154316;和EP0401384。優(yōu)選，PEG基化經(jīng)與反應(yīng)性聚乙二醇分子(或類似的反應(yīng)性水溶性聚合物)的?；磻?yīng)或烷化反應(yīng)進(jìn)行，如下所述。一般而言，化學(xué)衍生作用可在用于使生物活性物質(zhì)與活化的聚合物分子反應(yīng)的任何合適的條件下進(jìn)行。用于制備PEG基化的促紅細(xì)胞生成素的方法將一般包括步驟(a)在使促紅細(xì)胞生成素變得可與一個(gè)或多個(gè)PEG基團(tuán)連接的條件下，使促紅細(xì)胞生成素多肽與聚乙二醇(如PEG的反應(yīng)性酯或醛衍生物)反應(yīng)，和(b)獲得反應(yīng)產(chǎn)物。一般而言，用于酰化反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件將基于已知的參數(shù)和所需結(jié)果來(lái)確定。例如，PEG:蛋白質(zhì)的比值越大，聚-PEG基化的產(chǎn)物的百分率越大。飾的促紅細(xì)胞生成素的方法。在該方法中，可因不同的主要氨基有差別的反應(yīng)性來(lái)靶向連接至促紅細(xì)胞生成素的N-末端。對(duì)pH進(jìn)行選擇，其中在蛋白質(zhì)中賴氨酸的s-氨基和N-末端的a-氨基之間的pKa，通過(guò)與羰基或PEG或另一聚合物反應(yīng)，致使在N-末端蛋白質(zhì)的接近選擇性的衍生。優(yōu)選單聚物修飾的促紅細(xì)胞生成素。本發(fā)明的制劑將優(yōu)選為大于50%、55%、60%、65%、70%或75%的單聚合物促紅細(xì)胞生成素，更優(yōu)選為大于80%、85%或90%的單聚合物蛋白質(zhì)綴合物，最優(yōu)選為大于95%的單聚合物-促紅細(xì)胞生成素綴合物。獲得單聚合物衍生的促紅細(xì)胞生成素制劑的方法可為在綴合之后從非衍生的促紅細(xì)胞生成素分子群中純化衍生的材料。例如，下面呈現(xiàn)的是其中使用色譜法分離單PEG基化的促紅細(xì)胞生成素的實(shí)施例?？墒褂么笮∨抛枭珜游?、離子交換層析或兩者的組合和可能的其它常用的純化方法。這些方法可用作分析工具以鑒定純化產(chǎn)物或用作制備型純化工具。優(yōu)選的聚合物載體為聚乙二醇(PEG)。PEG基團(tuán)可為任何合宜的分子量，可為線型線型的或支化支化的。PEG的平均分子量將優(yōu)選為約2千道爾頓("kDa")-約100kDa，更優(yōu)選約5kDa-約60kDa，更優(yōu)選約20kDa-約50kDa;最優(yōu)選約30kDa-約40kDa。這些PEG可由任何供應(yīng)商供應(yīng)，這些供應(yīng)商包括NOFCorporation(Tokyo,Japan)、DowPharma(ChiroTechTechnology,Cambridge,UK)、Nektar(SanCarlos,CA)和SunBio(AnyangCity,SouthKorea)。合適的PEG部分包括，例如，40kDa甲氧基聚(乙二醇)丙醛；60kDa甲氧基聚(乙二醇)丙醛；31kDaa-甲基-co-(3-氧代丙氧基)、聚氧乙烯；30kDaPEG:30kDa曱氧基聚(乙二醇)丙醛和45kDa2,3-二(甲基聚氧乙烯-氧)-1-[(3-氧代丙基)聚氧乙烯-氧]-丙烷。PEG基團(tuán)一般將通過(guò)PEG部分上的反應(yīng)基團(tuán)(例如，醛基、氨基、巰基、或酯基)與蛋目標(biāo)白或多肽上的反應(yīng)基團(tuán)(例如，醛基、氨基、或酯基)經(jīng)?；饔没蜻€原胺化作用，而連接至本發(fā)明的化合物。例如，PEG部分可直接或通過(guò)接頭連接至促紅細(xì)胞生成素的N-末端氨基酸殘基。使肽和PEG部分結(jié)合，該肽和PEG部分各負(fù)有對(duì)彼此有互相反應(yīng)的特異性官能度。該肽可用常規(guī)的固相合成法(見(jiàn)，例如，圖5和圖6及其附文)容易地制備。該肽用合適的官能團(tuán)在特異位點(diǎn)被"預(yù)活化"。在與PEG部分反應(yīng)之前使前體純化并完全鑒定。肽與PEG的連接通常發(fā)生于水相中，并可以通過(guò)反相分析性HPLC容易地監(jiān)測(cè)。經(jīng)PEG基化的肽可以用制備型HPLC容易地純化，并用分析型HPLC、氨基酸分析和激34光解吸質(zhì)譜分析法來(lái)鑒定。多糖聚合物為可用于蛋白修飾的另一類水溶性聚合物。葡糖聚為由主要通過(guò)CX1-6鍵合而連接的葡萄糖的個(gè)體亞基組成的多糖聚合物。葡糖聚本身在許多分子量范圍內(nèi)可利用，并可在約1kD-約70kD的分子量?jī)?nèi)容易地利用。葡糖聚是合適的水溶性聚合物，在本發(fā)明中單獨(dú)或與另一載體(例如，F(xiàn)c)組合用作載體。見(jiàn)，例如，WO96A1953和WO96/05309。與治療性的或診斷性的免疫球蛋白綴合的葡糖聚的用途已被報(bào)導(dǎo)；見(jiàn)，例如，歐洲專利公開第0315456號(hào)，該公開通過(guò)引用結(jié)合到本文中。當(dāng)葡糖聚用作本發(fā)明的載體時(shí)，優(yōu)選約lkD-約20kD的葡糖聚。如上所述，"接頭"基團(tuán)的存在為任選的。當(dāng)存在時(shí)，它的化學(xué)結(jié)構(gòu)不是關(guān)鍵性的，因?yàn)樗饕米鏖g隔物。接頭優(yōu)選由通過(guò)肽鍵連接在一起的氨基酸構(gòu)成。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，接頭由通過(guò)肽鍵連接的l-20個(gè)氨基酸構(gòu)成，其中這些氨基酸選自20種天然氨基酸。這些氨基酸中的一些可被糖基化，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所很好地理解的。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述l-20個(gè)氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和賴氨酸。甚至更優(yōu)選，接頭由大多數(shù)無(wú)空間位阻的氨基酸，如甘氨酸和丙氨酸構(gòu)成。因此，優(yōu)選的接頭為聚甘氨酸(尤其是(Gly)4、(Gly)s、聚(Gly-Ala)、和聚丙氨酸。接頭的其它特別的實(shí)例為(Gly)3Lys(Gly)4;(Gly)3AsnGlySer(Gly)2;(Gly)3Cys(Gly)4;和GlyProAsnGlyGly。為了解釋上述命名法，例如，(Gly)3Lys(Gly)4指Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly。也優(yōu)選Gly和Ala的組合。本文顯示的接頭為例示性的；在本發(fā)明范圍內(nèi)的接頭可更長(zhǎng)很多并可包括其它的殘基。也可能為非肽"f妄頭。例如，可使用烷基接頭如-NH-(CH2)s-C(0)-,其中s-2-20。這些烷基接頭還可被任何非空間位阻的基團(tuán)取代，這些基團(tuán)例如低級(jí)烷基(例如，CVC6)、低級(jí)?；?、卣素(例如，Cl、Br)、CN、NH2、苯基等。例示性的非肽接頭為PEG接頭，其中n使接頭的分子量為100-5000kD,優(yōu)選100-500kD。可以以如上所述的同樣方式改變肽接頭以形成衍生物。在WO01/02017中描述了糖基化EPO的PEG基化。這樣的分子顯示提高的生物活性。WO00/32772和Francis,E.，等，乂他附.68(1988)1-18,描述了經(jīng)聚乙二醇修飾的非糖基化的EPO。WO00/32772的該分子另外在166位被修飾。這樣的分子被描述為不引起血細(xì)胞比容的顯著增加。該P(yáng)EG-聚合物部分由l-5個(gè)聚合物鏈組成。WO00/32772建議通過(guò)降低pH和減少PEG:胺的比值，來(lái)控制PEG基化的程度和位點(diǎn)。以pH7和1.5:l摩爾比的PEG-醛胺基時(shí)進(jìn)行的反應(yīng)，優(yōu)先與N-末端a-氨基反應(yīng)。一些有用的PEG基化連接顯示于表1中而一些有用的PEG基化反應(yīng)顯示于圖12中。在優(yōu)選的方法中，N-末端的PEG基化通過(guò)使用mPEG-丙醛及經(jīng)還原胺化作用使其與rhEPO的N-末端共價(jià)綴合來(lái)實(shí)現(xiàn)。通過(guò)利用賴氨酸的s-氨基(pKa10)和N-末端氨基(pKa7.6-8.0)之間的pKa值差異，來(lái)實(shí)現(xiàn)選擇性。在典型的衍生化反應(yīng)中，30%-50。/o的rhEPO被PEG基化。在最優(yōu)化的條件下可達(dá)到更高程度的衍生化。然后使用陽(yáng)離子交換層析步驟純化單-PEG基化的rhEPO。優(yōu)選地，經(jīng)色譜之后純化的單-PEG基化的rhEPO為大于80。/。、85%、90%或最優(yōu)選大于95%的rhEPO。表lPEG基化試劑選擇、PEG-綴合連接和綴合物的穩(wěn)定性胺PEG基化mPEG-,硝基苯基碳酸酯mPEG-丙醛和還原劑mPEG-NHS酉旨綴合物連接形成氨基曱酸酯仲胺(穩(wěn)定的)酰胺斬u醇PEG基化mPEG-馬來(lái)酰亞胺疏醚Mpeg基化mPEG-胺和偶聯(lián)劑酰胺(穩(wěn)定的)一般地，可通過(guò)給予本聚合物/促紅細(xì)胞生成素衍生物而減輕或調(diào)節(jié)的病癥包括一般而言用于促紅細(xì)胞生成素分子的本文所述的那些病癥。然而，本文所公開的聚合物/促紅細(xì)胞生成素和促紅細(xì)胞生成素衍生物分子與非衍生的分子相比，可具有附加的活性、增強(qiáng)的或降低的活性、或其它的特征。實(shí)施例實(shí)施例l.基因工程改造的畢赤酵母(尸z'cA/a)6.0細(xì)胞系的構(gòu)建遵循在Gemgross美國(guó)7，029，872和Gerngross美國(guó)20040018590中公開的方法，可以構(gòu)建用于基因工程文造低等真核宿主細(xì)胞的載體，致使前者能夠表達(dá)具有作為主要種類的所需N-糖形的所需多肽。從巴斯德畢赤酵母(尸/c/n'fl/a^on》的野生型菌抹NRRL-11430開始，依照?qǐng)Dl中描述的系列逐步進(jìn)行基因的導(dǎo)入。本文使用的菌林YGLY3159的基因型為um5A::MET16ochlA::lacZbmt2A::lacZ/KlMNN2-2，mnn4LlA::lacZ/MmSLC35A3ApnolAmnn4A::lacZmetl6A::lacZ,hislA::lacZ/ScGAL10/XB33/DmUGT,arglA::HISl/KD53/TC54,ADE1::lacZ/NA10/MmSLC35A3/FB8,PRO1::lacZ-URA5-lacZ/TrMDS1:A0X1:Shble/AOXlp/ScaMFpre-GFI800，TRP2::ARGl/MmCST/HsGNE/HsCSS/HsSPS/MmST6-33。在圖2中的分圖A至分圖0中闡述了用來(lái)構(gòu)建菌抹YGLY3159的質(zhì)粒。依照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成所需細(xì)胞。Hamilton等，Sc/e"ce313:1441:1443(2006)也指明了用于構(gòu)建細(xì)胞系的合適技術(shù)，該公開通過(guò)引用結(jié)合到本文中。實(shí)施例2用于產(chǎn)生重組EPO的載體的構(gòu)建。將酉良酒酵母(Sfitcc/aram;;cescevWae)oc交配因子前序歹廿的寡核苷酸磷酸化和退火，以產(chǎn)生5'末端的EcoRI突出端和3'末端的平端。然后如圖2所示，將該寡核苦酸對(duì)連接至編碼人促紅細(xì)胞生成素的編碼DNA序列，以形成pGLY2088,如圖1所示，將pGLY2088轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母(尸/cA/a;(xston;s)中。實(shí)施例3.6.0細(xì)胞系的轉(zhuǎn)化和發(fā)酵」樹化酵母菌林。5.發(fā)'發(fā)d程潛迷在Applikon的15L(12L工作容積)可高壓滅菌的玻璃生物反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵過(guò)程。用由冷凍原種瓶生長(zhǎng)起來(lái)的指數(shù)生長(zhǎng)期搖瓶培養(yǎng)液接種入(0.04%v/v)反應(yīng)器。在24-36小時(shí)內(nèi)當(dāng)初始裝料的甘油耗盡時(shí)結(jié)束分批發(fā)酵階段。在分批發(fā)酵階段之后細(xì)胞濕重(WCW)典型地為120±25g/LWCW。在此刻，將包含12mL/LPTM1鹽的500/。w/w甘油溶液?jiǎn)蚊}沖(pulse)補(bǔ)料至發(fā)酵罐，致使在甘油補(bǔ)料分批發(fā)酵階段開始時(shí)最終的甘油濃度為30g/L。按lmL/L添加包含2.6mg/mL真菌0-糖基化的合成抑制劑(PMTi-3)的曱醇溶液。按0.6mL/L添加蛋白酶抑制劑混合液(45mg/mL胃蛋白酶抑制劑A和15mM的胰凝乳蛋白酶抑制素的DMSO溶液)。在4小時(shí)內(nèi)甘油被耗盡，濕細(xì)胞重量已達(dá)到225土25g/LWCW。然后通過(guò)按2.3g/h/L的包含12mL/LPTMl鹽的甲醇補(bǔ)料為開始，誘導(dǎo)基因表達(dá)。在曱醇補(bǔ)料分批發(fā)酵階段開始時(shí)以及誘導(dǎo)的每隔24小時(shí)，添加lml/L的2.6mg/mLPMTi-3曱醇溶液和0.6mL/L的蛋白酶抑制劑混合液。當(dāng)最終的細(xì)胞濕重預(yù)期達(dá)約300士25g/L時(shí)，誘導(dǎo)繼續(xù)40小時(shí)。(I/為在接種之前的初始裝料體積)。通過(guò)離心進(jìn)行發(fā)酵罐培養(yǎng)基的初步澄清。將全部細(xì)胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移入IOOOmL離心瓶中并在13,000xg，4。C下離心15分鐘。實(shí)施例4:純化如下所述通過(guò)三級(jí)色層分離產(chǎn)生用于PEG基化的人EPO(hEPO),其中達(dá)到95%的純度(圖3)。首先，通過(guò)0.2pm膜濾器過(guò)濾無(wú)細(xì)胞的發(fā)酵懸浮液，濃縮和使用具有空心纖維膜的MiniKross切向流分離模塊(separationmodule)進(jìn)行緩沖液更換。在第一步中使用QsepharoseBigBeads以捕獲流通的宿主細(xì)胞蛋白和hEPO。用醋酸將流通池和來(lái)自QsepharoseBigBeads柱的洗脫樣品調(diào)整到pH5.0。測(cè)量電導(dǎo)率以保證其值為約4.5mS/cm。接著，使樣品通過(guò)0.2iim膜濾器過(guò)濾，加樣到已用三倍柱容積的pH5.0的50mM醋酸鈉預(yù)平衡的SPsepharoseFastFlow柱上。應(yīng)用十倍柱容積的從pH5.0的50mM醋酸鈉至pH5.0的20mM醋酸鈉的梯度；500mMNaCl洗脫蛋白質(zhì)，接著用0.5倍柱容積的pH5.0的20mM醋酸鈉；750mMNaCl洗脫。收集(pool)包含hEPO的流分，在pH值7.0的50mMTRIS中透析。將包含hEPO的流分加樣至用三倍柱體積的pH7.0的50mMTRIS預(yù)平衡的BlueSepharose6FF柱上。應(yīng)用十倍柱容積的從pH7.0的50mMTRIS至pH8的50mMTRIS的線性梯度；3MNaCl，接著用2倍柱容積的pH8的50mMTRIS;3MNaCl洗脫。收集顯示EPO帶(平均分子量25kDa)的流分，通過(guò)0.2pm膜濾器過(guò)濾，4。C下在pH6.0的20mMMES中透析，在4。C下貯存。然后將樣品收集液(pool)濃縮，在pH5.2的50mM醋酸鈉緩沖液中透析至lmg/ml的蛋白濃度。已見(jiàn)到使發(fā)酵懸浮液暴露至pH5會(huì)增力口hEP0的損失。因此將捕獲和hEPO純化的中間步驟維持在中性pH是重要的。在圖10中顯示了第二種一般純化方案的概述。在圖ll中顯示了通過(guò)SDS-PAGE來(lái)分析使用該方案所制備的純化的樣品。通過(guò)離心進(jìn)行初步澄清。將全部細(xì)胞培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移入IOOOmL離心瓶，并在13,000xg，4。C下離心15分鐘。對(duì)于較大的發(fā)酵罐(10L-40L和更大)可使用超濾步驟?？衫镁哂?0K孔徑大小的Sartoriuos平板進(jìn)行該步驟至5倍濃度。用pH7的50mMTris-HC1/100mMNaCl平衡的BlueSepharose6fastflow(GEhealthcare)進(jìn)行捕獲步驟。在加樣到柱之前，將懸浮液調(diào)節(jié)至含IOOmMNaCl并通過(guò)死端過(guò)濾器(Whatman,PolycapTC)。在加樣之后，滯留時(shí)間維持到10分鐘，用3倍柱體積(CV)清洗。在用250mMNaCl2CV和1MNaCl3CV的步驟中進(jìn)行洗脫。在lMNaCl中洗脫EPO。在捕獲步驟之后使用Macro-prep陶乾羥基磷灰石I型40|am(Bio-Rad)。用包含1MNaCl和lOmMCaCl2的pH7的50mMMOPS平衡該柱。在加樣之前，添加IOmMCaCh至從藍(lán)色柱收集的EPO。用3CV的平衡溶液接著由pH7的0-200mM磷酸鈉的lOCV線性梯度，來(lái)對(duì)柱進(jìn)行清洗。在60mM-100mM磷酸鈉之間洗脫EPO。Source30S(GEHealthcare)可用作任選的純化步驟。假如是這種情況，那么在羥基磷灰石層析之后，在4。C下通過(guò)pH5的50mM醋酸鈉過(guò)夜透析所收集的樣品，用同樣的緩沖液平衡該柱。應(yīng)用10CV0-750mMNaCl的線性梯度連同350-500mMNaCl之間的EPO洗脫。純化的EPO分析用PNG酶F處理使N-聚糖從純化的EPO釋放(ChoiPNAS，Hamilton2003Science),依照Laemmli(Laemmli1970)由通過(guò)SDS-PAGE分析(圖4)。使用配有以下組件的HitachiD7000儀，通過(guò)大小排阻層析(SEC-HPLC)測(cè)定純化的EPO的完整性和聚集存在情況在280nm處監(jiān)測(cè)的L7420UV檢測(cè)器、在690nm處檢測(cè)的WyattminiDAWN三角光散射檢測(cè)器、在690nm處檢測(cè)的WyattOptilabrEx示差折光率檢測(cè)器、GEHealthcareSuperdex20010/300GL柱(糾7-5175-01)、和WyattASTRAV5.3丄5軟件(圖4A-4D)。將90微升的樣品(>0.1mg/ml)放入樣品瓶中，封蓋，然后注入柱中。HPLC的梯度由以下組成使用IOOmM磷酸鈉(pH值6.8)、150mMNaCl、和0.05%疊氮化鈉的緩沖液，以0.45ml/min的流速，在室溫下等度運(yùn)行60分鐘。使用ASTRA軟件的蛋白質(zhì)綴合分析組件(module)計(jì)算分子量。將示差折光率檢測(cè)器設(shè)置到濃度檢測(cè)器。0.185ml/g的dn/dc用于蛋白質(zhì)，400.136ml/g用于PEG和聚糖。使用配有以下組件的HitachiD7000HPLC儀，通過(guò)RP-HPLC對(duì)純化的EPO的純度定量L-7455二極管陣列檢測(cè)器和Jupiter5(iC4300A150mmx4.6mmID柱(糾0F-4167-E0，Phenomenex)(圖4)。注射90微升，樣品在280nm處監(jiān)測(cè)，用以下緩沖液依照下面的梯度(使柱溫箱預(yù)熱至80。C)分離緩沖液A:0.P/。三氟醋酸(TFA)的HPLC級(jí)水溶液，用氦氣噴射(sparge)緩沖液B:0.08。/oTFA的HPLC級(jí)乙腈溶液，用氦氣噴射表2<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>使用以下儀器，通過(guò)作肽圖(LC-MS)評(píng)估hEPO蛋白的質(zhì)量和評(píng)價(jià)翁3譯后的〈奮飾情況AdvionTriversaNanomate、ThermoElectronFinniganLTQ質(zhì)i普4義、ThermoElectronFinniganSurveyorHPLC系統(tǒng)、Jupiter4(iPeoteo90A柱、250x4.60mm(#00G-4396-E0,Phenomenex)、和具有10kDa分子量截?cái)嗟碾x心柱(spincolumn)(VSOlOl,Vivascience)(圖7)。將100(il樣品(〉1mg/ml)置于1.5mlEppendorf管中，添加150jal10MGuHCl和2.5pl1M二硫蘇糖醇(DTT)。將樣品內(nèi)容物混合，并使樣品在37。C下溫育l小時(shí)。允許樣品在室溫下冷卻，并添加10ji11M碘醋酸(IAA)。通過(guò)用鋁箔包裹樣品管來(lái)避光，并使樣品在室溫下溫育45min。使樣品緩沖液交換到pH7.8的25mM碳酸氫銨(NH4HC03)(6次，每次IO倍稀釋)，最終的體積減少至30pL。添加l(ig胰蛋白酶母液(組成1pg4il凍干的胰蛋白酶的50mM醋酸溶液，等分2nl/管，貯藏于-20。C)和乙腈至5。/。(v/v)。將反應(yīng)溶液置于37。C,溫育過(guò)夜(16小時(shí))。進(jìn)行MALDI-TOF分析以確定胰蛋白酶消化完成和胰蛋白酶的活性被滅活。然后添加甲酸至0.1。/。(v/v)的最終濃度以降低pH。將15微升的消化液與15plHPLC緩沖液A(0.1。/。曱酸(FA)的HPLC級(jí)水溶液)混合，裝入樣品瓶中。HPLC設(shè)置如下1)樣品盤溫度4°C;2)柱溫箱溫度30。C;3)部分環(huán)注射；4)UV檢測(cè)215nm和280nm;5)HPLC梯度:表3<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>質(zhì)譜儀設(shè)置如下1)流過(guò)AdvionTriversaNanomate至LTQ~400nl/min;2)毛細(xì)管溫度115。C,毛細(xì)管電壓5v;管透鏡電壓77v3)掃描設(shè)置為中性丟失前3至MS4，持續(xù)90min。通過(guò)考慮從質(zhì)量檢測(cè)器監(jiān)視基峰軌跡，來(lái)繪制色譜圖。通過(guò)使用Sequest軟件以及手動(dòng)檢查搜索hEPO序列，來(lái)鑒定存在于每一峰值中的肽。實(shí)施例5.用于PEG基化的PEG分子和方法的描述以下PEG分子用于hEPO的PEG基化來(lái)自Dow(Cambridge,UK)的40kDa線型線型曱氧基聚(乙二醇)丙醛來(lái)自Dow(Cambridge，UK)的60kDa線型線型甲氧基聚(乙二醇)丙醛來(lái)自NOF公司(Tokyo,Japan)的30kDa線型線型a-曱基-co-(3-氧代丙氧基)，聚氧乙烯來(lái)自NOF公司的45kDa支化支化的2,3-二(曱基聚氧乙烯-氧)-1-[(3-氧代丙基)聚氧乙烯-氧]-丙烷將不同的活化的PEG(30kDa、40kDa、或60kDa線型PEGs或45kDa支化PEG)，添加至hEPO樣品(濃度lmg/mL)的pH5.2的50mM醋酸鈉緩沖液中，使蛋白質(zhì)PEG比值為1:10。通過(guò)將10mM氰基硼氫化鈉添加至反應(yīng)混合物并整夜攪拌，在還原的條件下，在室溫下進(jìn)行反應(yīng)。通過(guò)添加10mMTRIS停止反應(yīng)。使用SPsepharoseFastFlow柱純化單PEG基化的hEPO，并用SDS-PAGE分析(圖5)。如果期望進(jìn)一步優(yōu)化，可以檢驗(yàn)以下參數(shù)1)不同的pH范圍(pH值4.0、4.5、5.2和6.0)2)hEPO:mPEG-醛的不同摩爾比(l:5、1:10、1:20)3)室溫對(duì)4。C4)不同類型的PEG實(shí)施例6.PEG基化的Epo產(chǎn)物的特征通過(guò)如實(shí)施例4所述的SECHPLC(圖6)，來(lái)分析四種不同的PEG基化的EPO產(chǎn)品。為了對(duì)N-聯(lián)聚糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量(圖7)，使N-聯(lián)聚糖通過(guò)用PNG酶F(ChoiPNAS，Hamilton2003Science)處理，從PEG基化的EPO中釋放，并使用市售的2-AB標(biāo)記試劑盒，用2-氨基聯(lián)苯胺(2-AB)標(biāo)記。使用PrevailCHOES、5微米珠、維持在30。C的連接氨基的二氧化硅柱，進(jìn)行HPLC。洗脫概況如下(溶劑A:100%乙腈，溶劑B:50mM曱酸銨pH值4.4):表4<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>在等滲氯化鈉/檸檬酸鈉緩沖溶液或氯化鈉/磷酸鈉緩沖溶液中，將EPOGEN⑧配制為用于靜脈內(nèi)(IV)或皮下(SC)給藥的無(wú)菌、無(wú)色液體。單劑量，不含防腐劑的瓶每lmL的溶液包含2000、3000、4000或10,000單位的阿法依泊汀(Epoetina)、2.5mg白蛋白(人)、5.8mg檸檬酸鈉、5.8mg氯化鈉、和0.06mg檸檬酸，在注射用水USP(pH6.9士0.3)中。該制劑不含防腐劑。貯存瓶包含1%苯曱醇。實(shí)施例8PEG-EPO的體內(nèi)分析在小鼠中的體內(nèi)試驗(yàn)小鼠的效能研究將在經(jīng)工程改造以產(chǎn)生雙天線的末端唾液酸化的(〉70。/。)人EPO的巴斯德畢赤酵母(尸./a^o^)菌林YGLY3159中產(chǎn)生的四個(gè)不同模型的PEG-EPO,與市售的Aranesp比較它們的增加血細(xì)胞比容的能力。獲得C57B6小鼠(在研究開始時(shí)為7周齡，重量18-20g,每處理組3個(gè)雄性/3個(gè)雌性)，適應(yīng)一周。在給藥之前測(cè)定血細(xì)胞比容值以獲得各動(dòng)物的基線。將動(dòng)物分成六組(1)載體(鹽水+100[ig/mlrHSA);(2)ARANESP@2.5^ig/kgM'J量(達(dá)貝泊汀(darbepoetin)，不含白蛋白)；(3)PEG-EPO[40kDa線型DOW]⑥2.5嗎/kg/劑量；(4)PEG-EPO[60kDa線型DOW]⑥2.5jig/kg/劑量；(5)PEG-EPO[30kDa線型NOF]⑥2.5lag/kg/劑量；(6)PEG-EPO[45kDa支化NOF]⑥2.5pg/kg/劑量。通過(guò)每周兩次(星期一和星期四)腹膜內(nèi)注射給藥給動(dòng)物，總共注射五次(在2.5周之后停止給藥)。每周從小鼠取血(星期一)并測(cè)定血細(xì)胞比容值。用本發(fā)明的PEG-EPO綴合物注射的小鼠顯示比市售的Aranesp增加的血細(xì)胞比容。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)于圖8中。進(jìn)行第二項(xiàng)研究，其中動(dòng)物每周一次給予C57小黑鼠(7周齡；~20g;每組3個(gè)雄性/3個(gè)雌性)2.5(ig/kg/劑量的重組人EPO。在研究期間，星期四注射，星期一從動(dòng)物取血。該研究評(píng)估每周一次腹膜內(nèi)給予四種PEG-EPO結(jié)合物和Aranesp(NESP)對(duì)血細(xì)胞比容水平的影響。數(shù)據(jù)呈現(xiàn)于圖13中。免疫原性研究為了確定(address)PEG-EPO的免疫原性，可以兩次/周，持續(xù)2周皮下注射來(lái)給藥給恒河猴。可明確地鑒定基于ELISA方法，并測(cè)定在恒河猴血中和接著測(cè)定在人血中重組促紅細(xì)胞生成素的抗體。在皮下給予PEG-EPO之后，可隨時(shí)間監(jiān)測(cè)血清樣品的抗促紅細(xì)胞生成素抗體的產(chǎn)生。另外，潛在的抗體應(yīng)答可以與可以同時(shí)監(jiān)測(cè)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和藥效參數(shù)相關(guān)。權(quán)利要求1.基本上均質(zhì)的促紅細(xì)胞生成素蛋白組合物，所述組合物包含連接至促紅細(xì)胞生成素的多種雙天線N-聯(lián)聚糖，所述多種N-聯(lián)聚糖包含基本上由選自以下的結(jié)構(gòu)組成的大于25摩爾百分率的N-聯(lián)聚糖GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2；GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2；GlcNAc2Man3GlcNAc2；GlcNAc2Man3；GlcNAc2Man5GlcNAcGalNANA；GlcNAc2Man5GlcNAcGal；GlcNAc2Man5GlcNAc；和GlcNAc2Man5。2.基本上均質(zhì)的促紅細(xì)胞生成素蛋白組合物，所述組合物包含連接至促紅細(xì)胞生成素的多種雙天線N-聯(lián)聚糖，其中大于25摩爾百分率的所述多種N-聯(lián)聚糖由GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2組成。3.權(quán)利要求2的組合物，其中大于50摩爾百分率的所述多種1^-聯(lián)聚糖基本上由GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2組成。4.權(quán)利要求2的組合物，其中大于75摩爾百分率的所述多種N-聯(lián)聚糖基本上由GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2組成。5.權(quán)利要求2的組合物，其中所述GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2N-聚糖以比所述多種N-聯(lián)聚糖的下一種最主要N-聯(lián)聚糖結(jié)構(gòu)多約5摩爾百分率-約80摩爾百分率的水平存在。6.基本上均質(zhì)的促紅細(xì)胞生成素蛋白組合物，所述組合物包含連接至促紅細(xì)胞生成素的多種雙天線N-聯(lián)聚糖，其中大于25摩爾百分率的所述多種AA-聯(lián)聚糖由GlcNAc2Mari3GlcNAc2Gal2組成。7.權(quán)利要求6的組合物，其中大于50摩爾百分率的所述多種N-聯(lián)聚糖基本上由GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2組成。8.權(quán)利要求6的組合物，其中大于75摩爾百分率的所述多種^聯(lián)聚糖基本上由GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2組成。9.權(quán)利要求6的組合物，其中所述GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2N-聚糖以比所述多種W-聯(lián)聚糖的下一種最主要7V-聯(lián)聚糖結(jié)構(gòu)多約5摩爾百分率-約80摩爾百分率的水平存在。10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的組合物，其中聚乙二醇部分連接至至少50%的促紅細(xì)胞生成素蛋白的N-末端氨基酸殘基，所述連接為直接連接或經(jīng)由接頭連接。11.權(quán)利要求IO的組合物，其中所述聚乙二醇部分的分子量為約20kD-約60kD。12.權(quán)利要求IO的組合物，其中所述聚乙二醇部分的分子量為約30kD-約40kD。13.權(quán)利要求10的組合物，其中所述聚乙二醇部分為線型。14.權(quán)利要求10的組合物，其中聚乙二醇部分連接至至少80%的促紅細(xì)胞生成素蛋白的N-末端氨基酸殘基。15.藥用組合物，該藥用組合物包含權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的組合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑。16.增加哺乳動(dòng)物血細(xì)胞比容的方法，所述方法包括給予有效治療量的權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的組合物。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述制劑是權(quán)利要求10的組合物，每4-6周給藥一次。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述制劑按.05-500pg/kg的劑量給藥。19.制備促紅細(xì)胞生成素組合物的方法，所述方法包括步驟構(gòu)建低等真核宿主細(xì)胞，以將預(yù)選的N-聯(lián)聚糖連接至蛋白質(zhì)，所述預(yù)選的7V-聯(lián)聚糖包含基本上由選自以下的結(jié)構(gòu)組成的大于25摩爾百分率的N-聯(lián)聚糖GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2NANA2;GlcNAc2Man3GlcNAc2Gal2;GlcNAc2Man3GlcNAc2;GlcNAc2Man3;GlcNAc2Man5GlcNAcGalNANA;GlcNAc2Man5GlcNAcGal;GlcNAc2Man5GlcNAc;和GlcNAc2Man5,用載體轉(zhuǎn)化所述低等真核宿主細(xì)胞，所述載體包含可經(jīng)操作連接至所述宿主細(xì)胞可識(shí)別的表達(dá)控制序列的促紅細(xì)胞生成素編碼序列，在順應(yīng)促紅細(xì)胞生成素表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，和分離促紅細(xì)胞生成素。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述宿主細(xì)胞為酵母或絲狀真菌。21.權(quán)利要求20的方法，其中所述宿主細(xì)胞選自畢赤酵母(尸ZcAZa平)、巴斯德畢赤酵母(尸^n'a;flWon》、芬蘭畢赤酵母(A'c/n'a力w/cmcZ/ca)、喜海藻糖畢赤酵母(尸Zc/iZa^Aa/o//u7a)、■P/cAZaA:oc/amae、月莫醭畢赤酵母(尸z'c/^'amem6mwae/aciew)、樣t小畢赤酵母(尸z'c/n-amz'm<to)Aermoto/eraws、杉P畢赤酵母(A.c/n'asa"cton'a)、_P《c/n'agwercMwn、皮杰普畢赤酵母(乃'c/^/砂m')、樹干畢赤酵母(尸z'c/^s印to)、嗜曱畢赤酵母(尸/c/n'am"Aawo/Zca)、酵母菌(5"accAaTOwycass/.)、酉良酒酵母(5"acc/wram少cascereWWae)、多形漢遜酵母(//0"^肌/"/o(ymor;Aa)、克魯維酵母(A7wj;veram7ces取)、乳酸克魯維酵母(A7w少vera，cej/flcto」'白色念珠菌(Cam^/aa/6Zc朋力、曲霉0^;erg/〃wss/.)、構(gòu)巢曲霉(v4j/erg/〃w^"油/""力、黑曲霉(y^e^g7'〃w"—r)、米曲霉(v4j/e/^'〃"5o，fle)、里氏木霉(7WcAoc^"謹(jǐn)reese/)、C7，cw/o"'謂/wcA7zo額m^、嫌孑包(Fwsfln.畫s/.)、禾谷嫌孑包(FwsarZ,gram/weww)、i^ksan'聽vewewa似m、尸/y^c。附""〃"/atow和斗!B4造月永月包菌(iVewn^/oracnzwa)。22.權(quán)利要求19的方法，其中所述宿主細(xì)胞是巴斯德畢赤酵母23.權(quán)利要求22的方法，其中所述巴斯德畢赤酵母(尸/c/n'a/7aWo&」是ura5A::MET16ochlA::lacZbmt2A::lacZ/KlMNN2-2，mnn4LlA::lacZ/MmSLC35A3ApnolAmnn4A::lacZmetl6A::lacZ，hislA::lacZ/ScGAL10/XB33/DmUGT，arglA::HISl/KD53/TC54，ADE1::lacZ綠l0/MmSLC35A3/FB8，PRO1::lacZ-URA5-lacZ/TrMDS1，AOX1:Shble/AOXlp/ScaMFpre-GFI800,TRP2::ARGl/MmCST/HsGNE/HsCSS/HsSPS/MmST6曙33。24.權(quán)利要求1的組合物，其中所述促紅細(xì)胞生成素基本上不含乳糖胺。全文摘要提供用于制備促紅細(xì)胞生成素蛋白組合物的方法和材料，其中所述組合物包含作為主要N-糖形的預(yù)選N-聯(lián)糖基化型。文檔編號(hào)C07K14/505GK101535340SQ200780027322公開日2009年9月16日申請(qǐng)日期2007年5月18日優(yōu)先權(quán)日2006年5月19日發(fā)明者J·內(nèi)特,N·塞舒拉曼,R·戴維森申請(qǐng)人:格利科菲公司