專利名稱：促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及以特定方式聚合物修飾的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，及其產(chǎn)生方法和應(yīng)用。
參照相關(guān)申請(qǐng)?jiān)谀撤N程度上，該申請(qǐng)是美國(guó)專利申請(qǐng)系列60/231,330(2000年9月8日提交)和60/236,377(2000年9月29日提交)的延續(xù)，其內(nèi)容均在此完整引入作為參考。
背景技術(shù)：
紅細(xì)胞生成是指產(chǎn)生紅細(xì)胞的過(guò)程，該過(guò)程可以調(diào)節(jié)紅細(xì)胞的更新和損耗。促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種能夠刺激紅細(xì)胞生成的蛋白激素，天然的人EPO是一種含有165個(gè)氨基酸的糖蛋白，該蛋白最初在腎臟中產(chǎn)生，然后被分泌進(jìn)入血流，繼而在骨髓中刺激前體細(xì)胞產(chǎn)生紅細(xì)胞。人EPO編碼基因的預(yù)測(cè)產(chǎn)物是一種含有166個(gè)氨基酸殘基的分子，但是在成熟形式的人EPO中，C端的精氨酸在翻譯后修飾過(guò)程中被去除。
糖基化人EPO在第24、38和83位上帶有3個(gè)N-聯(lián)糖鏈。在第126位上還帶有一個(gè)O-聯(lián)糖鏈。糖基化的影響十分復(fù)雜。非糖基化EPO在體外具有活性。但研究表明，糖基化是EPO在體內(nèi)具有全部活性所必需的。研究還表明，不同的糖基化模式可表現(xiàn)出不同的影響。例如，去唾液酸化EPO在體外的活性增強(qiáng)，但在體內(nèi)的活性減弱，該結(jié)果歸因于暴露的半乳糖殘基被肝細(xì)胞識(shí)別、結(jié)合并清除。此外，完全唾液酸化EPO的分支模式可導(dǎo)致生物活性的差異。主要呈四角分支模式的EPO可表現(xiàn)出與“標(biāo)準(zhǔn)”EPO相同的活性，而主要呈二角分支模式的EPO可在體外具有高出三倍的活性，但在體內(nèi)僅為正常活性的15％。此外，有多項(xiàng)研究表明，對(duì)EPO功能具有重要作用的只有N-聯(lián)糖，而不包括O-聯(lián)糖。
目前有幾種藥品可以使用，這些藥品含有重組產(chǎn)生的糖基化EPO。但目前可用的EPO藥品在血漿中的半衰期較短，并且易于被蛋白酶降解，因而其使用受到限制。由于各N-聯(lián)糖基化位點(diǎn)及位點(diǎn)之間的分支情況和唾液酸含量高度不均一，所以這些藥品還含有糖基化形式不同的復(fù)合混合物。這些缺點(diǎn)都會(huì)阻礙其產(chǎn)生最大的臨床效力。
有人將PEG(聚乙二醇)等水溶性聚合物聯(lián)接于這些EPO蛋白，以改善其循環(huán)半衰期和其他特性，但由于很難將其以受控方式和自定精確方式進(jìn)行連接，所以獲得的是混合產(chǎn)物。例如，已有多種方法被用來(lái)將PEG等聚合物基團(tuán)和相關(guān)聚合物聯(lián)接于蛋白上的活性基團(tuán)(參考美國(guó)專利4,179,337(Davis et al.)和美國(guó)專利4,002,531(Royer))。有關(guān)綜述，可參考”酶類藥物”(J.S.Holcerberg andJ.Robert，eds.pp.367-383(1981)中的Abuchowski et al.以及Zalipsky，S.(Bioconjugate Chemistry(1995)6150-165)。關(guān)于利用PEG和其他聚合物來(lái)修飾蛋白的論述，還可參考Cheng，T.-L.et al.，Bioconjugate Chem.(1999)10520-528；Belcheva，N.etal.，Bioconjugate Chem.(1999)10932-937；Bettinger，T.etal.，Bioconjugate Chem.(1998)9842-846；Huang，S.-Y.et al.，Bioconjugate Chem.(1998)9612-617；Xu，B.et al.Langmuir(1997)132447-2456；Schwarz，J.B.et al.，J.Amer.Chem.Soc.(1999)1212662-2673；Reuter，J.D.et al.，BioconjugateChem.(1999)10271-278；Chan，T.-H.et al.，J.Org.Chem.(1997)623500-3504)。蛋白上的典型連接位點(diǎn)包括伯氨基，如賴氨酸殘基上或N末端的伯氨基，伯巰基，如半胱氨酸側(cè)鏈的伯巰基，以及伯羧基，如谷氨酸殘基或天冬氨酸殘基上或C末端的伯羧基。最常見(jiàn)的連接位點(diǎn)是糖蛋白的糖殘基、半胱氨酸，或靶蛋白的N末端和賴氨酸。
目前已描述過(guò)多種將聚合物聯(lián)接于EPO的不同方法，但聯(lián)接的過(guò)程無(wú)不趨于復(fù)雜。必須注意的是減少由結(jié)合反應(yīng)導(dǎo)致的生物活性損失。例如，通?？衫谜郫B蛋白或重折疊蛋白來(lái)盡量減少結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量。但是，若靶蛋白或靶多肽上結(jié)合了過(guò)多的活性聚合物，其生物活性會(huì)嚴(yán)重降低或喪失。同樣，若使用錯(cuò)誤的連接體來(lái)聯(lián)接聚合物和蛋白，或聯(lián)接于靶蛋白的聚合物量不足，就會(huì)使所得結(jié)合物的治療價(jià)值受到限制，并可能無(wú)法由循環(huán)壽命的延長(zhǎng)來(lái)充分彌補(bǔ)生物活性的損失。修飾聚合物對(duì)蛋白活性位點(diǎn)的封閉也會(huì)帶來(lái)一些問(wèn)題。由于聚合物與蛋白的結(jié)合通常是在基于溶液的反應(yīng)體系中進(jìn)行，因而這種問(wèn)題很難避免。有人建議用磷酸吡哆醛等物質(zhì)對(duì)活性位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)封閉，但產(chǎn)生的結(jié)果并不一致(參考美國(guó)專利4,179,337(Davis et al.))。對(duì)通常帶有少量與生物活性無(wú)關(guān)的結(jié)合位點(diǎn)的低分子量蛋白和肽而言，這些問(wèn)題顯得尤為尖銳。
舉例來(lái)說(shuō)，常見(jiàn)的一種技術(shù)是將水溶性聚合物聯(lián)接于靶蛋白的伯氨基(如N末端氨基和賴氨酸的ε-氨基)。還有使用巰基反應(yīng)性聚合物結(jié)合體將聚合物聯(lián)接于半胱氨酸的巰基側(cè)鏈。這兩種方法都具有明顯的問(wèn)題，因?yàn)榇蠖鄶?shù)蛋白都含有遍布于多肽骨架不同區(qū)域的多個(gè)上述活性基團(tuán)，這些活性基團(tuán)在確定蛋白的活性、折疊、再折疊和穩(wěn)定性方面具有重要的作用。因此，盡管這些方法被普遍使用，但或多或少都會(huì)使蛋白的生物活性出現(xiàn)一定的或不必要的降低，并且通常會(huì)產(chǎn)生難以分離和鑒定的復(fù)合混合物(Delgada et al.，PharmaceuticalSciences(1997)359-66)。
為了減少隨機(jī)結(jié)合，有人嘗試制備了一些將天然賴氨酸去除并在特定聚合物結(jié)合位點(diǎn)添加賴氨酸的蛋白(美國(guó)專利4,904,584)。例如，有人用這種方式對(duì)G-CSF和IL-2進(jìn)行了修飾。為了避免隨機(jī)結(jié)合，還有人嘗試制備了一些將天然半胱氨酸去除并在特定聚合物結(jié)合位點(diǎn)添加半胱氨酸的蛋白，或不將存在的天然半胱氨酸去除而只添加半胱氨酸的蛋白(EP0668353)。例如，有人制備出這樣的EPO。盡管這些半胱氨酸或賴氨酸變異體理論上能夠用于聚合物的位點(diǎn)特異性結(jié)合，但仍不能保證對(duì)所有選定位點(diǎn)進(jìn)行受控修飾。
有一些蛋白包含多個(gè)帶有相同或相似活性功能基團(tuán)的側(cè)鏈的氨基酸，在無(wú)法對(duì)這些蛋白進(jìn)行位點(diǎn)特異性修飾的情況下，目前的工作集中在對(duì)蛋白的氨基或羧基末端進(jìn)行修飾。氨基或羧基末端的修飾依賴于一些能夠?qū)@些位點(diǎn)進(jìn)行單一修飾的化學(xué)結(jié)合技術(shù)(WO90/02136和WO90/02135)。例如，有人用該技術(shù)將PEG鏈與G-CSF和趨化因子IL-8的N-端殘基相結(jié)合(Gaertner et al.，Bioconjug.Chem.(1996)7(1)38-44；和WO96/41813)。但N-端或C-端修飾通常會(huì)降低蛋白的活性(可參考，例如，美國(guó)專利5,985,265中關(guān)于將PEG聯(lián)接于G-CSF的N-端和賴氨酸側(cè)鏈的論述)。盡管用水溶性聚合物對(duì)蛋白進(jìn)行修飾的方法存在一些缺陷，但是將蛋白聚乙二醇化以及與其他水溶性聚合物聯(lián)接的研究仍在繼續(xù)。例如，還有人描述了將PEG聯(lián)接于促紅細(xì)胞生成素(EPO)的糖鏈和賴氨酸等內(nèi)部氨基酸的方法(EP0605963和WO00/32772)，以及聯(lián)接于N-末端的方法(美國(guó)專利6,077,939和WO00/32772)。遺憾的是，產(chǎn)生的這些聚乙二醇化EPOs是難以分離和鑒定的復(fù)合混合物。
另一個(gè)問(wèn)題是上述聚合物具有高度非均一性，從而難以對(duì)聚合物修飾蛋白的混合物進(jìn)行分析鑒定和純化(Delgada et al.，Pharmaceutical Sciences(1997)359-66)。舉例來(lái)說(shuō)，用于制備PEG鏈或PEG型鏈的技術(shù)都涉及一個(gè)難以控制的聚合步驟，甚至分子量為3400等相對(duì)較低的值時(shí)也是如此，該步驟會(huì)使制備產(chǎn)物的鏈長(zhǎng)分散在某一平均值附近；也就是說(shuō)，這些技術(shù)涉及制備出(CH2CH2O)n的聚合物，其中的n不是一個(gè)離散值，而是在平均值附近的一個(gè)范圍。衍生蛋白的這種不均一性通常會(huì)使其具有不易鑒定的一系列特性，更不用說(shuō)將其分離。
但遺憾的是，目前用于治療性應(yīng)用的所有EPO蛋白都是由DNA重組技術(shù)獲得，這使鑒定并采用適當(dāng)聚合物的難題更加嚴(yán)重。DNA重組技術(shù)的使用嚴(yán)重限制了性能促進(jìn)性基團(tuán)與重組產(chǎn)生的EPO蛋白之間形成聯(lián)接的類型和特異性。其原因首先是適用于聯(lián)接的功能基團(tuán)數(shù)量非常有限，其次是在被修飾的蛋白中通常含有若干個(gè)活性功能基團(tuán)，從而使修飾不可能具有任何的特異性。例如，已有研究表明，當(dāng)超氧化物歧化酶與PEG非選擇性聯(lián)接時(shí)，被修飾的酶的一些組分完全失活(P.McGoff et al.，Chem.Pharm.Bull.(1988)363079-3091)。此外，若隨機(jī)聯(lián)接了不同數(shù)量的這些基團(tuán)，就會(huì)無(wú)法精確預(yù)測(cè)這種治療性蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)，從而使定量給藥成為一個(gè)很大的難題。無(wú)法對(duì)連接進(jìn)行控制還會(huì)導(dǎo)致(a)效能降低、(b)需要用煩瑣的純化方法來(lái)分離大量的混合衍生物，以及(c)修飾基團(tuán)的聯(lián)接可能不穩(wěn)定。此外，一些該領(lǐng)域已知的聯(lián)接還具有免疫原性，如基于tresylchloride的聯(lián)接。
因此，可以將PEG等水溶性聚合物聯(lián)接于由生物學(xué)方法產(chǎn)生的蛋白，以延長(zhǎng)這些蛋白的循環(huán)半衰期，并降低其蛋白水解作用和免疫原性，同時(shí)改善這些蛋白的其他特性，但由于很難將其以受控方式和自定精確方式進(jìn)行連接，所以獲得的是混合產(chǎn)物。并且在自定的精確位點(diǎn)進(jìn)行聚合物聯(lián)接的成果有限，因而對(duì)普遍適用于蛋白聯(lián)接的優(yōu)選位點(diǎn)的了解還十分缺乏。此外，由于聯(lián)接的隨機(jī)性以及PEG和普遍用于聯(lián)接的其他水溶性聚合物的異向擴(kuò)散性，目前還難以對(duì)PEG-蛋白結(jié)合物進(jìn)行純化和分析鑒定。因此，難以對(duì)可重復(fù)性聯(lián)接進(jìn)行控制以及聚合物不均一性的問(wèn)題都是聚合物修飾蛋白被例行批準(zhǔn)為治療劑的嚴(yán)重障礙(19世紀(jì)70年代早期即出現(xiàn)，但迄今只有少數(shù)被批準(zhǔn)用于治療性應(yīng)用)。
因此，人們需要一些方法來(lái)形成生物活性促紅細(xì)胞生成蛋白，這些方法要不同于修飾天然EPO和重組EPO的DNA重組技術(shù)和聚合物技術(shù)。此外還需要一些臨床特性被改進(jìn)的促紅細(xì)胞生成蛋白。本發(fā)明即可滿足這些需要以及其他需要。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及促紅細(xì)胞生成性合成蛋白及其產(chǎn)生方法和應(yīng)用。具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及聯(lián)接有一種或多種水溶性聚合物的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白。此外還提供含有本發(fā)明所述促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的藥用組合物。
本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明的聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行治療的方法。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種方法，用于提高哺乳動(dòng)物體內(nèi)的紅細(xì)胞產(chǎn)量。另一實(shí)施方案則涉及一種方法，用于提高哺乳動(dòng)物體內(nèi)的血紅素。還有一項(xiàng)實(shí)施方案涉及一種方法，用于提高哺乳動(dòng)物體內(nèi)的網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)。這些方法包括將本發(fā)明的聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白以有效的劑量給藥于該哺乳動(dòng)物，以獲得所需的效果。
此外還提供一些方法，用于產(chǎn)生本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白及其中間體，其中包括優(yōu)選的聚合物修飾形式。該方法包括，將含有促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的非重疊性多肽鏈氨基酸序列的一些肽段進(jìn)行化學(xué)連接，從而產(chǎn)生一種含有促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的多肽鏈。
附圖簡(jiǎn)述

圖1A-1E顯示本發(fā)明的聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的制備方法示意圖。
圖2A-2C顯示本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的制備方法示意圖。
圖3A-3B顯示多片段連接方法的示意圖，該方法涉及將3種或3種以上的非重疊肽段進(jìn)行化學(xué)連接，即相對(duì)于全長(zhǎng)連接終產(chǎn)物而言，至少有一個(gè)肽段為中間片段。
圖4A-4C說(shuō)明所得側(cè)鏈巰基的天然化學(xué)連接和化學(xué)修飾方法。
圖5A-5B描述一種固相方法，用于產(chǎn)生本發(fā)明所述水溶性聚合物U-B-Polymer-J*的分支核心(B)和單一化學(xué)選擇性功能基團(tuán)(U)。
圖6A-6D描述一種固相方法，用于產(chǎn)生本發(fā)明優(yōu)選的基本不具有抗原性的水溶性聚酰胺Polymer-J*組分，該組分可隨后用于聯(lián)接U-B核心。
圖7描述一種方法，用于使U-B組分與Polymer-J*組分結(jié)合，以產(chǎn)生本發(fā)明優(yōu)選的具有通式U-B-Polymer-J*的聚合物合成構(gòu)成體。
圖8描述一種替代方法，用于將水溶性聚合物精確聯(lián)接于一種肽段，該肽段可用于連接并產(chǎn)生本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白。
圖9顯示本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的整個(gè)制備過(guò)程。
圖10顯示優(yōu)選的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的基本結(jié)構(gòu)。pPEG＝“精確型PEG”圖11顯示循環(huán)置換型SEP類似物的總體結(jié)構(gòu)，該類似物帶有重新定位的氨基端和羧基端。
圖12顯示優(yōu)選的水溶性聚合物的結(jié)構(gòu)及其不同的線性結(jié)構(gòu)和分支結(jié)構(gòu)。
圖13顯示支鏈pPEG聚合物的形成示意圖。
圖14顯示合成細(xì)胞因子SEP1-L30的合成方法，該細(xì)胞因子是按實(shí)施例2所述制備的人EPO經(jīng)聚合物精確修飾的合成類似物。
圖15顯示合成的細(xì)胞因子SEP1-L30，該細(xì)胞因子是按實(shí)施例2所述制備的人EPO經(jīng)聚合物精確修飾的合成類似物。
圖16顯示合成的細(xì)胞因子SEP1-L26，該細(xì)胞因子是按實(shí)施例3所述制備的人EPO經(jīng)聚合物精確修飾的合成類似物。
圖17顯示用于聯(lián)接合成細(xì)胞因子SEP1-B50的優(yōu)選支鏈水溶性聚合物的形成示意圖，該細(xì)胞因子是按實(shí)施例4所述制備的人EPO經(jīng)聚合物精確修飾的合成類似物。
圖18顯示合成的細(xì)胞因子SEP1-B50，該細(xì)胞因子是按實(shí)施例4所述制備的人EPO經(jīng)聚合物精確修飾的合成類似物。
圖19顯示合成細(xì)胞因子SEP3-L42的合成方法，該細(xì)胞因子是按實(shí)施例5所述制備的人EPO經(jīng)聚合物精確修飾的合成類似物。
圖20顯示合成的細(xì)胞因子SEP3-L42，該細(xì)胞因子是按實(shí)施例5所述制備的人EPO經(jīng)聚合物精確修飾的合成類似物。
圖21顯示用于聯(lián)接合成細(xì)胞因子SEP1-B51的優(yōu)選水溶性聚合物的合成方法，該細(xì)胞因子是按實(shí)施例7所述制備的人EPO經(jīng)聚合物精確修飾的合成類似物。
圖22顯示合成的細(xì)胞因子SEP1-B51，該細(xì)胞因子是按實(shí)施例7所述制備的人EPO經(jīng)聚合物精確修飾的合成類似物。
圖23顯示用于聯(lián)接合成細(xì)胞因子SEP1-B52的優(yōu)選水溶性聚合物的合成方法，該細(xì)胞因子是按實(shí)施例8所述制備的人EPO經(jīng)聚合物精確修飾的合成類似物。
圖24顯示合成的細(xì)胞因子SEP1-B52，該細(xì)胞因子是按實(shí)施例8所述制備的人EPO經(jīng)聚合物精確修飾的合成類似物。
圖25顯示按實(shí)施例2-5和7-8所述制備的人EPO經(jīng)聚合物精確修飾的合成類似物的典型分析數(shù)據(jù)。如圖所示，典型的等電聚焦凝膠(IEF)結(jié)果和非還原性SDS-PAGE凝膠結(jié)果說(shuō)明，折疊的純化SEP1-B51具有相當(dāng)于單體的分子量。
圖26顯示SEP化合物SEP0、SEP1-L26、SEP1-L30、SEP1-B50、SEP1-B51和SEP3-L42在因子依賴性細(xì)胞系中的體外活性。
圖27顯示SEP1-L42和SEP1-B50的血漿濃度對(duì)時(shí)間的典型藥代動(dòng)力學(xué)曲線，濃度單位為納克每毫升(ng/ml)，時(shí)間單位為小時(shí)。
圖28顯示在缺氧大鼠模型中根據(jù)72小時(shí)紅細(xì)胞(RBC)-59Fe攝取量(劑量百分率)測(cè)定的SEP1-B51以及CHO細(xì)胞產(chǎn)生的糖基化重組人促紅細(xì)胞生成素(“rhEPO”)的體內(nèi)活性的線性回歸分析結(jié)果。
圖29顯示以5μg/kg劑量用SEP1-B51和rhEPO對(duì)大鼠進(jìn)行單次靜脈內(nèi)給藥后，大鼠體內(nèi)每種化合物的血漿濃度對(duì)時(shí)間的典型藥代動(dòng)力學(xué)清除率曲線。
圖30顯示一種循環(huán)置換型聚合物修飾SEP構(gòu)建體。
優(yōu)選實(shí)施方案描述本發(fā)明涉及促紅細(xì)胞生成性合成蛋白及其產(chǎn)生方法和應(yīng)用。
I.本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及帶有一種或多種與其聯(lián)接的水溶性聚合物的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白?！按偌t細(xì)胞生成蛋白”是指具有在體外促進(jìn)促紅細(xì)胞生成素依賴性細(xì)胞系生長(zhǎng)的生物活性的蛋白。在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白具有在體內(nèi)促進(jìn)紅細(xì)胞增殖的生物活性。蛋白的促紅細(xì)胞生成活性可通過(guò)多種方法中的任一種方法來(lái)檢測(cè)，例如在體內(nèi)給藥之后進(jìn)行紅細(xì)胞生成跟蹤測(cè)定，檢測(cè)該蛋白對(duì)EPO一依賴性細(xì)胞系增殖的介導(dǎo)能力，等等。
“水溶性聚合物”是指可溶于水的基本不具有抗原性的聚合物。
按照文中的描述，若一種蛋白的某些，最優(yōu)選的是全部，氨基酸殘基是通過(guò)非重組技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)聚合，則該蛋白被稱為“合成”蛋白。術(shù)語(yǔ)“非重組技術(shù)”是指涉及有機(jī)化學(xué)方法和其他合成聚合方法的技術(shù)，從而將這些技術(shù)與涉及RNA在體內(nèi)或體外翻譯成蛋白的技術(shù)區(qū)別開(kāi)來(lái)。合成蛋白包括完全合成蛋白和半合成蛋白。完全合成蛋白的所有連接成分都是通過(guò)化學(xué)合成方法，即不依賴于核糖體的合成方法，人工產(chǎn)生的。半合成蛋白至少有部分連接成分是生物合成的，即利用細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中的核糖體合成的，而其他部分是化學(xué)合成的。
在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白包含一段具有核糖體特定促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列的多肽鏈，以及通過(guò)一種或多種化學(xué)連接位點(diǎn)共價(jià)結(jié)合的一種或多種非重疊肽段。特別優(yōu)選的促紅細(xì)胞生成素是哺乳動(dòng)物的促紅細(xì)胞生成素，更優(yōu)選的是人促紅細(xì)胞生成素或其衍生物。舉例來(lái)說(shuō)，有多種促紅細(xì)胞生成素的氨基酸序列為已知，并且已制備出多種人促紅細(xì)胞生成素的活性變異體(可參考，例如，美國(guó)專利5,856,298；5,955.422；8,888,772；5,858,347；5,614,184；5,457,098和6,077,939,以及WO0/32772)，因此，本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白可以包含已知具有上述氨基酸序列的多肽。
在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，核糖體特定促紅細(xì)胞生成素含有一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)，而水溶性聚合物是通過(guò)與核糖體特定促紅細(xì)胞生成素的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)聯(lián)接于促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的多肽鏈。在一項(xiàng)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，水溶性聚合物只通過(guò)與一個(gè)或多個(gè)上述糖基化位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)聯(lián)接于多肽鏈。本發(fā)明的該方面包括一些促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中的核糖體特定促紅細(xì)胞生成素是通過(guò)重組方法產(chǎn)生的。因此，核糖體特定促紅細(xì)胞生成素可以是天然的促紅細(xì)胞生成素，也可以是非天然的促紅細(xì)胞生成素，其中，非天然促紅細(xì)胞生成素還可包含一個(gè)或多個(gè)非天然的糖基化位點(diǎn)。
“糖基化位點(diǎn)”是指一種蛋白氨基酸序列，該序列可編碼寡糖(糖)鏈與該蛋白氨基酸序列上一種氨基酸殘基側(cè)鏈的酶促連接；例如N-聯(lián)和O-聯(lián)糖基化位點(diǎn)。應(yīng)該了解的是，經(jīng)突變而去除了一個(gè)或多個(gè)上述糖基化位點(diǎn)的促紅細(xì)胞生成素也包含在該“糖基化位點(diǎn)”的定義中，因?yàn)榫酆衔镄揎棜埢稽c(diǎn)與其位置相同?！疤烊惶腔稽c(diǎn)”是指自然界中存在的促紅細(xì)胞生成素糖蛋白上的糖基化位點(diǎn)?！胺翘烊惶腔稽c(diǎn)”是指經(jīng)過(guò)改造而引入促紅細(xì)胞生成素的糖基化位點(diǎn)。例如，目前已利用這種方式對(duì)重組人EPO進(jìn)行了改造(可參考，例如，美國(guó)專利5,856,298)在某種程度上，本發(fā)明所述實(shí)施方案的基礎(chǔ)是，當(dāng)利用水溶性聚合物，如上文描述的聚合物，在一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)上對(duì)含有人促紅細(xì)胞生成素多肽鏈的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白進(jìn)行修飾時(shí)，該水溶性聚合物可用來(lái)實(shí)現(xiàn)通常存在于相應(yīng)天然促紅細(xì)胞生成素糖蛋白的同一位置上的糖鏈的一種或多種生物學(xué)效應(yīng)。這些生物學(xué)效應(yīng)包括調(diào)節(jié)抗蛋白酶能力、免疫原性、受體特異性、比活、效力和藥代動(dòng)力學(xué)。而去除存在的糖鏈并將其替換成本發(fā)明優(yōu)選的水溶性聚合物的方法會(huì)帶來(lái)明顯的好處，其中包括，避免了在去除糖鏈的懸垂唾液酸殘基等情況下可能導(dǎo)致的酶促降解和清除，并且解決了不穩(wěn)定性、循環(huán)半衰期有限、分布、難以處理性等問(wèn)題。此外，值得注意的是，本發(fā)明的這些聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白與未修飾的對(duì)應(yīng)合成蛋白相比，能夠在基本不喪失生物活性的條件下保持這些有利的生物學(xué)特性，其中包括生物活性增強(qiáng)，甚至在合成蛋白的單體分子量大于25kDa時(shí)也是如此。
因此，在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，該蛋白包含一段具有核糖體特定促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列的多肽鏈，其中，該多肽鏈聯(lián)接有一種或多種水溶性聚合物，并且其單體分子量大于25kDa，同時(shí)，這種促紅細(xì)胞生成性合成蛋白與所含多肽鏈不帶有上述水溶性聚合物的對(duì)應(yīng)合成蛋白相比具有相同或更高的生物活性。該生物活性可以是體外生物活性，也可以是體內(nèi)生物活性，還可以是二者兼?zhèn)?。在一?xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，該生物活性為體內(nèi)生物活性。在另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，該蛋白包含一段具有核糖體特定促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列的多肽鏈，其中，該多肽鏈聯(lián)接有一種或多種水溶性聚合物，并且其單體分子量大于25kDa，同時(shí)，這種促紅細(xì)胞生成性合成蛋白與所述核糖體特定促紅細(xì)胞生成素相比具有相同或更高的生物活性。同樣，該生物活性可以是體外生物活性，也可以是體內(nèi)生物活性，還可以是二者兼?zhèn)洹Ｔ谝豁?xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，該生物活性為體內(nèi)生物活性。最優(yōu)選的是，這些聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白應(yīng)聯(lián)接有離散數(shù)量的水溶性聚合物。
“化學(xué)連接位點(diǎn)”是指第一種肽或多肽的N-端氨基酸和第二種肽或多肽的C-端氨基酸，這兩種氨基酸之間通過(guò)化學(xué)連接會(huì)形成或能夠形成不可逆的共價(jià)鍵。文中使用的“化學(xué)連接”是指一種化學(xué)選擇性反應(yīng)，其中包括兩種化學(xué)基團(tuán)的共價(jià)連接，每種化學(xué)基團(tuán)帶有一種可彼此反應(yīng)并形成特定不可逆共價(jià)鍵的功能基團(tuán)?；瘜W(xué)連接包括(1)具有特定的C-端反應(yīng)性基團(tuán)的第一種肽或多肽與(2)具有特定的N-端反應(yīng)性基團(tuán)的第二種肽或多肽的共價(jià)連接，其中，該C-端反應(yīng)性基團(tuán)和N-端反應(yīng)性基團(tuán)之間會(huì)形成不可逆的共價(jià)鍵。具體地說(shuō)，化學(xué)連接包括任何可用于連接未保護(hù)肽段的化學(xué)選擇性反應(yīng)。
就水溶性聚合物而言，優(yōu)選的水溶性聚合物可表示為通式Un-s1-B-s2-Polymer-s3-J*U是一種具有與促紅細(xì)胞生成性合成蛋白多肽鏈共價(jià)結(jié)合的特定功能基團(tuán)的殘基。具體地說(shuō)，U基團(tuán)結(jié)合于促紅細(xì)胞生成性合成蛋白內(nèi)一種或多種非重疊肽段的一個(gè)或多個(gè)氨基酸側(cè)鏈n上可彼此特定反應(yīng)的功能基團(tuán)，其中，n是1-6的離散整數(shù)。更優(yōu)選的是側(cè)鏈n為1-4的離散整數(shù)，最優(yōu)選的是為1-2的離散整數(shù)。文中使用的術(shù)語(yǔ)“氨基酸”包括20種遺傳編碼氨基酸、自然界中存在的稀有氨基酸或非常見(jiàn)氨基酸，以及任何非天然氨基酸，如不規(guī)則氨基酸；當(dāng)用于肽、多肽或蛋白質(zhì)的描述中時(shí)，是指氨基酸殘基。U和側(cè)鏈n的優(yōu)選實(shí)施方案是由彼此能夠特定反應(yīng)的基團(tuán)形成共價(jià)鍵，其中，這些鍵選自肟、酰胺、胺、氨基甲酸乙酯、醚、硫醚、酯、酰肼、惡唑烷、噻唑烷、硫醚、醚和酯。U和n的最優(yōu)選連接是，U通過(guò)化學(xué)連接形成的一種選自酰胺、肟、硫醚、酰肼、噻唑烷和惡唑烷的鍵而與側(cè)鏈n共價(jià)結(jié)合。
B是一種具有三個(gè)或更多個(gè)相同或不同臂的分支核心，該核心可以存在，也可以缺失。最優(yōu)選的是B存在，并且含有三個(gè)或更多個(gè)臂，再更優(yōu)選的是含有四個(gè)或更多個(gè)臂。具體地說(shuō)，B的一個(gè)臂與U聯(lián)接(可選擇性地通過(guò)間隔物或連接物s1聯(lián)接)，B的第二個(gè)臂與Polymer聯(lián)接(可選擇性地通過(guò)間隔物或連接物s2聯(lián)接)。優(yōu)選的是，聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白中的B基團(tuán)上至少有一個(gè)分支臂含有選自肟、酰胺、胺、氨基甲酸乙酯、硫醚、酯、酰肼、惡唑烷和噻唑烷的殘基鍵。本發(fā)明的聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的優(yōu)選B分支基團(tuán)可包含一種選自氨基、羧酸酯和混合氨基-羧酸酯的分支核心。優(yōu)選的氨基分支核心包括賴氨酸或其衍生物，優(yōu)選的羧酸酯分支核心包括谷氨酸或天冬氨酸或其衍生物，而優(yōu)選的混合氨基-羧酸酯分支核心包括γ-谷氨酸或其衍生物。
Polymer組分是一種基本不具有抗原性的水溶性聚合物，當(dāng)B存在時(shí)，該聚合物可以相同，也可以不同?！八苄跃酆衔铩笔侵缚扇苡谒囊环N基本不具有抗原性的聚合物，其原子分子量大于約1,000道爾頓。優(yōu)選的是Polymer的有效水力分子量大于約10,000Da，更優(yōu)選的是約為20,000-500,000Da，最優(yōu)選的是約為40,000-300,000Da?！坝行Ψ肿恿俊笔侵咐盟猿叽缗抛鑼游龇?SEC)測(cè)定的聚合物鏈的有效水溶化尺寸。當(dāng)水溶性聚合物包含的聚合物鏈中帶有環(huán)氧乙烷重復(fù)單元等聚環(huán)氧烷重復(fù)單元時(shí)，優(yōu)選的是每條鏈的原子分子量約為200-80,000Da，更優(yōu)選的是約為1,500-42,000Da，最優(yōu)選的是約為2,000-20,000Da。在沒(méi)有特別提及的情況下，分子量均指原子分子量。
Polymer組分可具有很寬的分子量范圍以及不同的聚合物亞基。這些亞基可包括生物學(xué)聚合物、合成聚合物，或其組合。這些水溶性聚合物的實(shí)例包括葡聚糖和葡聚糖衍生物，其中包括磷酸葡聚糖、P-氨基交聯(lián)糊精和羧甲基糊精，纖維素和纖維素衍生物，其中包括甲基纖維素和羧甲基纖維素，淀粉和糊精，以及淀粉的衍生物和羥基化物，聚二醇及其衍生物，其中包括聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇、聚乙二醇同聚物、聚丙二醇同聚物、乙二醇與丙二醇的共聚物，其中，所述同聚物和共聚物的一端可以被或不被烷基取代，肝素和肝素片段、聚乙烯醇和聚乙烯乙醚、聚乙烯吡咯烷酮、天冬酰胺，和聚氧乙烯多元醇酯，以及葡聚糖和葡聚糖衍生物、糊精和糊精衍生物。應(yīng)該了解的是，所列水溶性聚合物的各種衍生物也包括在內(nèi)。
水溶性聚合物，如上述水溶性聚合物，已眾所周知，特別是聚乙二醇“PEG”等聚環(huán)氧烷型聚合物(參見(jiàn)例如＂Poly(ethylene glycol)ChemistryBiotechnical and Biomedical Applications＂，J.M.Harris，Ed.，Plenum Press，New York，NY(1992)；and＂Poly(ethylene glycol)Chemistry and Biological Applications＂，J.M.Harris and S.Zalipsky，Eds.，ACS(1997)；and InternationalPatent ApplicationsWO90/13540，WO92/00748，WO92/16555，WO94/04193，WO94/14758，WO94/17039，WO94/18247，WO94/28937，WO95/11924，WO96/00080，WO96/23794，WO98/07713，WO98/41562，WO98/48837，WO99/30727，WO99/32134，WO99/33483，WO99/53951，WO01/26692，WO95/13312，WO96/21469，WO97/03106，WO99/45964，and US Patents Nos.4,179,337；5；075,046；5,089,261；5,100,992；5,134,192；5,166,309；5,171,264；5,213,891；5,219,564；5,275,838；5,281,698；5,298,643；5,312,808；5,321,095；5,324,844；5,349,001；5,352,756；5,405,877；5,455027；5,446,090；5,470,829；5,478,805；5,567,422；5,605,976；5,612,460；5,614549；5,618,528；5,672,662；5,637,749；5,643,575；5,650,388；5,681,567；5,686,110；5,730,990；5,739,208；5,756,593；5,808,096；5,824,778；5,824,784；5,840,900；5,874,500；5,880,131；5,900,461；5,902,588；5,919,442；5,919,455；5,932,462；5,965,119；5,965,566；5,985,263；5,990,237；6,011,042；6,013,283；6,077,939；6,113,906；6,127355；6,177,087；6,180,095；6,194,580；6,214,966)。
更優(yōu)選的Polymer組分包括聚環(huán)氧烷、聚酰胺環(huán)氧烷，或其衍生物。更優(yōu)選的聚環(huán)氧烷和聚酰胺環(huán)氧烷包括通式-(CH2-CH2-O)-的環(huán)氧乙烷重復(fù)單元。還更優(yōu)選的Polymer組分是具有通式-[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]n-或-[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-的分子量大于約1,000Da的聚酰胺，其中，X和Y為相同或不同的分支型或線型二價(jià)基團(tuán)，n是2-100的離散整數(shù)，更優(yōu)選的是2-50的離散整數(shù)，并且X和Y之一或二者都含有一種線型或分支型水溶性重復(fù)單元，該重復(fù)單元具有生物相容性，并且基本不具有抗原性。最優(yōu)選的水溶性重復(fù)單元包括通式-(CH2-CH2-O)-或-(CH2-CH2-O)-的環(huán)氧乙烷。這些水溶性重復(fù)單元的數(shù)量可以有很大不同，但這些重復(fù)單元的更優(yōu)選數(shù)量為2-500、2-400、2-300、2-200、2-100，最優(yōu)選的為2-50。更優(yōu)選的實(shí)施方案的實(shí)例為，其中的X和Y之一或二者都選自-((CH2)n1-(CH2-CH2-O)n2-(CH2)nl-)-或-((CH2)n1-(O-CH2-CH2)n2-(CH2)n1-)，其中，n1為1-6、1-5、1-4，最優(yōu)選的是1-3，n2為2-50、2-25、2-15、2-10、2-8，最優(yōu)選的是2-5。高度優(yōu)選的實(shí)施方案的實(shí)例為，其中的X為-(CH2-CH2)-，而Y為-(CH2-(CH2-CH2-O)3-CH2-CH2-CH2)-或-(CH2-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-CH2)-。
Polymer組分或一種或多種間隔物或連接物，如果存在，可帶有一些生物穩(wěn)定的或可生物降解的聚合物鏈或單元。例如，帶有重復(fù)結(jié)合鍵的Polymer在生理?xiàng)l件下會(huì)根據(jù)鍵的不穩(wěn)定性而具有不同的穩(wěn)定程度。根據(jù)低分子量類似物的已知水解速率，可按照帶有這些鍵的Polymer在生理?xiàng)l件下的相對(duì)水解速率對(duì)其進(jìn)行分類，例如，穩(wěn)定性從低到高為聚碳酸酯(-O-C(O)-O-)＞聚酯(-C(O)-O-)＞聚氨基甲酸酯(-NH-C(O)-O-)＞聚原酸酯(-O-C((OR)(R’))-O-)＞聚酰胺(-C(O)-NH-)。與此類似，將水溶性聚合物聯(lián)接于靶分子的鍵系統(tǒng)可以是生物穩(wěn)定的或可生物降解的，例如，穩(wěn)定性從低到高為碳酸酯(-O-C(O)-O-)＞酯(-C(O)-O-)＞氨基甲酸乙酯(-NH-C(O)-O-)＞原酸酯(-O-C((OR)(R’))-O-)＞酰胺(-C(O)-NH-)。這些鍵只作為實(shí)例，而不是要限制能夠在本發(fā)明所述水溶性聚合物的聚合物鏈或鍵系統(tǒng)中使用的鍵的類型。
組分J*是一種含有懸垂基團(tuán)的殘基，該基團(tuán)在生理?xiàng)l件下的凈電荷選自負(fù)值、正值和中性值。該殘基包括取代或未取代的烷基、芳基、雜烷基、雜芳基、烷芳基、?；⑼檠趸?、烯基、炔基、酰胺基、氨基、羰基等等，及其鹽類。優(yōu)選的中性基團(tuán)為烷基或烷氧基，其中可包括，但不局限于，帶有1-18個(gè)碳原子的線型或分支型基團(tuán)。J*被作為帶電基團(tuán)提供時(shí)可含有一種可電離的功能基團(tuán)。功能基團(tuán)的實(shí)例包括，但不局限于，羧酸、酯、酰胺、腈、巰基和羥基。J*基團(tuán)可以是氨基酸、核酸、脂肪酸、糖類及其衍生物的一種成分，也可以是殼多糖、殼聚糖、肝素、磷酸乙酰肝素、軟骨素、磷酸軟骨素、皮膚素和磷酸皮膚素、環(huán)糊精、葡聚糖、透明質(zhì)酸、磷脂、唾液酸等基團(tuán)。優(yōu)選的是，J*含有一種選自羧基、氨基、巰基、羥基、磷?；?、胍、咪唑及其鹽類的可電離的基團(tuán)。最優(yōu)選的是，J*含有一種可電離的羧酸酯基團(tuán)，并且在生理?xiàng)l件下的凈電荷為負(fù)值。例如，本發(fā)明優(yōu)選的聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白具有3-7的等電點(diǎn)，因而可利用帶負(fù)電荷的J*基團(tuán)對(duì)pI進(jìn)行精確調(diào)節(jié)。
組分s1、s2和s3是相同或不同的間隔物或連接物，這些組分可以分別存在或缺失。優(yōu)選的間隔物或連接物包括，含有一種或多種用于水溶性聚合物的重復(fù)單元、二元胺和(或)二元酸單元、天然或非天然氨基酸或其衍生物的線型或分支型基團(tuán)，以及脂肪族基團(tuán)，其中包括烷基、芳基、雜烷基、雜芳基、烷氧基等，優(yōu)選的是這些基團(tuán)含有多達(dá)18個(gè)碳原子，甚至含有額外的聚合物鏈。最優(yōu)選的是間隔物或連接物含有一種聚合物鏈。
作為選擇，還可以將上述通式Un-s1-B-s2-Polymer-s3-J*表示為“Un-B-Polymer-J*”，其中，s1、s2和s3基團(tuán)可以存在，也可以不存在。
更優(yōu)選的Polymer組分是，其中的水溶性聚合物Un-s1-B-s2-Polymer-s3-J*完全是由逐級(jí)合成方法產(chǎn)生。這樣可以構(gòu)建出具有精確分子量和特定結(jié)構(gòu)的聚合物。相比之下，常見(jiàn)的聚合物合成是采用聚合方法，該方法產(chǎn)生的是一種鏈長(zhǎng)不同的混合物，其分子量和大小呈分散狀態(tài)，因而其分離即使可能，也非常困難。對(duì)分子純度的控制能力是一種優(yōu)勢(shì)，因?yàn)檫@樣可構(gòu)建出聯(lián)接有水溶性聚合物并且呈單分散狀態(tài)的合成蛋白。這種控制能力可作為一個(gè)明顯的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)檫@樣可避免由異類化合物帶來(lái)的多種特性，同時(shí)可以較容易地只制備和分離那些帶有最優(yōu)選特性的化合物。
在另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白含有一種或多種不規(guī)則氨基酸。文中使用的“不規(guī)則氨基酸”是指具有非遺傳編碼側(cè)鏈、非遺傳編碼骨架、非遺傳編碼Nα或αC(O)取代基團(tuán)或其組合的氨基酸，也就是與利用核糖體組裝的20種遺傳編碼氨基酸不同的氨基酸。優(yōu)選的不規(guī)則氨基酸的實(shí)例包括，側(cè)鏈上帶有一種與遺傳編碼的功能基團(tuán)不同的特定功能基團(tuán)的氨基酸，以及假氨基酸和多種氨基酸衍生物。為此，本發(fā)明在促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的設(shè)計(jì)和(或)構(gòu)建方面允許有很寬的選擇性和靈活性。可根據(jù)本發(fā)明使用的非核糖體組裝氨基酸的實(shí)例包括，但不局限于D-氨基酸、β-氨基酸、假谷氨酸、γ-氨基丁酸、鳥(niǎo)氨酸、高半胱氨酸、N-取代氨基酸(R.Simon et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1992)899367-71；WO91/19735(Bartlett et al.)，美國(guó)專利5,646,285(Baindur))、α-氨基亞甲氧乙酸(一種氨基酸-Gly二肽等排體)，和α-氨基含氧酸，以及具有非遺傳編碼側(cè)鏈功能基團(tuán)的其他氨基酸衍生物，等等。也可以使用含有硫酰胺、乙烯酰胺、肼基、甲叉氧、甲叉硫、磷酰胺、羥酰胺、羥乙烯、還原酰胺和取代還原酰胺等排體，以及β-磺酰胺的肽類似物?！凹侔被帷笔侵腹羌芙Y(jié)構(gòu)和側(cè)鏈基團(tuán)與遺傳編碼氨基酸相同，但側(cè)鏈原子的原子成分不同的氨基酸。
在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白在其多肽鏈的不規(guī)則氨基酸上聯(lián)接有水溶性聚合物。更優(yōu)選的是，用于聯(lián)接水溶性聚合物的不規(guī)則氨基酸帶有化學(xué)選擇性連接基團(tuán)，這些基團(tuán)在遺傳編碼功能基團(tuán)存在的情況下不會(huì)與其發(fā)生反應(yīng)。
如上所述，完全由逐級(jí)組裝方法產(chǎn)生的水溶性聚合物可以呈單分散狀態(tài)，如本發(fā)明優(yōu)選的聚酰胺乙撐氧。因此，另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案是，其中的水溶性聚合物呈單分散狀態(tài)(即分子成分是含有特定結(jié)構(gòu)的單一所需分子的均一狀態(tài))。此外，由于可完全利用化學(xué)合成方法來(lái)制備促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，因而也可以制備單分散狀態(tài)的這些蛋白。這些化合物的優(yōu)勢(shì)是純度高，并且可避免因使用非均向分散聚合物而帶來(lái)的純化和分析鑒定問(wèn)題。這些化合物在可重復(fù)性定量給藥等方面也具有優(yōu)勢(shì)(例如，與糖蛋白和聚乙二醇化重組蛋白的典型混合物狀態(tài)不同的是含有單一種類的分子)。
如上所述，本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成生合成蛋白的單體分子量在25kDa以上。就本發(fā)明而言，這些分子量的測(cè)定是采用變性SDS聚丙烯酰胺電泳法。術(shù)語(yǔ)“單體分子量”是指不同于可能具有多個(gè)蛋白或多肽拷貝的合成蛋白的單體合成蛋白的分子量。更優(yōu)選的是，本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的單體分子量在40kDa以上，更優(yōu)選的是50kDa或更高，最優(yōu)選的是在60-70kDa以上。例如，本發(fā)明優(yōu)選的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白SEP1-B51的單體分子量約為73kDa。但分子量更高的構(gòu)建體也將處在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，該蛋白在其連接位點(diǎn)含有一種假氨基酸，并且可選擇性地聯(lián)接有一種水溶性聚合物。這些化合物的產(chǎn)生方法是，使具有半胱氨酸等包含化學(xué)選擇性活性功能基團(tuán)的N-端氨基酸的第一種肽段或多肽段與具有α-羧基硫酯等化學(xué)連接相容性C-端功能基團(tuán)的第二種肽段或多肽段相連接，從而形成一種在連接位點(diǎn)上帶有未保護(hù)側(cè)鏈功能基團(tuán)的連接產(chǎn)物，再利用化學(xué)方法將連接位點(diǎn)上的未保護(hù)側(cè)鏈功能基團(tuán)轉(zhuǎn)變成假氨基酸，例如將半胱氨酸巰基側(cè)鏈羧甲基化成假谷氨酸。由天然化學(xué)連接位點(diǎn)的半胱氨酸轉(zhuǎn)變而成的假氨基酸在文中被稱為“假天然化學(xué)連接”，下文將對(duì)此進(jìn)行詳細(xì)描述。
此外還提供一種促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，該蛋白在其連接位點(diǎn)的氨基酸側(cè)鏈上聯(lián)接有水溶性聚合物。這些化合物的產(chǎn)生方法是，使具有半胱氨酸等包含化學(xué)選擇性活性功能基團(tuán)的N-端氨基酸的第一種肽段或多肽段與具有α-羧基硫酯等連接相容性C-端功能基團(tuán)的第二種肽段或多肽段相連接，從而形成一種在連接位點(diǎn)上帶有未保護(hù)側(cè)鏈功能基團(tuán)的連接產(chǎn)物，再使水溶性聚合物與連接位點(diǎn)上的未保護(hù)側(cè)鏈功能基團(tuán)相聯(lián)接。
利用本發(fā)明的假氨基酸化學(xué)連接法和化學(xué)連接位點(diǎn)聚合物修飾法會(huì)帶來(lái)一些優(yōu)于先有技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，其中包括，有效合成不含適當(dāng)連接位點(diǎn)的一系列不同的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，擴(kuò)展那些可用于通過(guò)節(jié)約成本的常規(guī)方式進(jìn)行位點(diǎn)特異性聚合物修飾的位點(diǎn)(和聯(lián)接性質(zhì))，以及合成具有相當(dāng)分子量的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，等等。這些方法還特別適用于高通量模擬對(duì)所需生物學(xué)特性的精確調(diào)節(jié)，其中包括搜索用于聯(lián)接水溶性聚合物的單個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)。
如上所述，通過(guò)對(duì)聚合物聯(lián)接位點(diǎn)和化學(xué)鍵性質(zhì)的精確調(diào)節(jié)，以及對(duì)水溶性聚合物的分子量、聚合物成分、結(jié)構(gòu)(如線型與分支型的比例，或其混合物)和懸垂基團(tuán)(如帶電與不帶電基團(tuán)的比例，或其混合物)的精確調(diào)節(jié)，可以改變本發(fā)明所述聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的生物學(xué)特性。具體地說(shuō)，促紅細(xì)胞生成性合成蛋白上聯(lián)接的水溶性聚合物可以增加蛋白的分子量以延長(zhǎng)其半衰期，并使蛋白呈分支結(jié)構(gòu)，等等，此外還可以使蛋白帶有精確的電荷，從而使促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的等電點(diǎn)約等于帶有該蛋白氨基酸序列的生物產(chǎn)生的相應(yīng)蛋白。其優(yōu)勢(shì)在于可模擬相應(yīng)核糖體特定蛋白的天然電荷情況。因此，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案涉及一些具有上述組合特性的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，以及所使用的水溶性聚合物，特別是能夠在預(yù)定位置進(jìn)行聯(lián)接的具有特定結(jié)構(gòu)的加合聚合物。
具體地說(shuō)，本發(fā)明優(yōu)選的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白(“SEPs”)是人尿EPO的聚合物修飾合成類似物。在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，這些蛋白含有一種或多種通過(guò)硫醚鍵、肟鍵、酰胺鍵或其他鍵聯(lián)接于一個(gè)或多個(gè)肽殘基的水溶性聚合物。在一項(xiàng)高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，這些連接鍵位于人尿EPO的一個(gè)或多個(gè)天然糖基化位點(diǎn)上(即第24、38、83和126位)。最優(yōu)選的是，SEP分子在兩個(gè)或更多個(gè)這些位點(diǎn)上聯(lián)接有聚合物基團(tuán)。在一項(xiàng)替代實(shí)施方案中，還可以有其他蛋白殘基被聚合物基團(tuán)修飾。本發(fā)明所述促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的修飾位點(diǎn)包括無(wú)規(guī)卷曲中的殘基、蛋白區(qū)域或結(jié)構(gòu)域中的殘基，或潛在蛋白酶剪切位點(diǎn)上或位點(diǎn)附近的殘基。例如，可以在EPO的第9、69和(或)125位中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上引入聚合物修飾。此外，若有一個(gè)或多個(gè)剩余的天然糖基化位點(diǎn)未被聚合物修飾，則可以在需要的情況下將這些區(qū)域內(nèi)的一種或多種氨基酸轉(zhuǎn)換成其他殘基，例如，需要帶正電荷時(shí)可轉(zhuǎn)換成賴氨酸，或需要帶負(fù)電荷時(shí)可轉(zhuǎn)換成天冬氨酸或谷氨酸，或轉(zhuǎn)換成丙氨酸，等等。本發(fā)明所述SEP分子的總分子量約為25-150kDa，更優(yōu)選的是約為30-80kDa。通過(guò)增加或減少用于修飾給定類似物的水溶性聚合物的數(shù)量和結(jié)構(gòu)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)分子量的控制。
舉例來(lái)說(shuō)，聚合物肟聯(lián)SEP類似物的優(yōu)選構(gòu)建方法是，將氨氧基、酮基或醛基功能化水溶性聚合物與SEP蛋白上具有側(cè)鏈氨氧基、酮基或醛基功能的非天然編碼氨基酸相聯(lián)接。例如，SEP-0和1的第89和117位含有假谷氨酸(帶有通式為-CHα-CH2-S-COOH的側(cè)鏈(與谷氨酸側(cè)鏈-CHα-CH2-CH2-COOH相比)的非天然編碼氨基酸)。利用硫醚鍵構(gòu)建SEP類似物的優(yōu)選方法是，通過(guò)帶有含巰基側(cè)鏈的半胱氨酸或非天然氨基酸使其具有巰基功能性。圖10顯示一種優(yōu)選促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的基本結(jié)構(gòu)。
在一項(xiàng)可選實(shí)施方案中，本發(fā)明的SEP分子可包括已將EPO的天然氨基和羧基端重新定位的“循環(huán)置換型”EPO類似物。最優(yōu)選的是通過(guò)這種重新定位將氨基和羧基端移至的結(jié)構(gòu)限制性較低的位置，如移至無(wú)規(guī)卷曲，等等。這種重新定位位點(diǎn)的實(shí)例是第125和126位(相對(duì)于天然EPO的殘基編號(hào)體系)附近的無(wú)規(guī)卷曲。最優(yōu)選的是這些SEPs不含有二硫鍵，并且可通過(guò)化學(xué)修飾而在選定殘基上帶有聚合物基團(tuán)。
作為選擇，還可以將SEP分子的氨基和羧基端重新定位于天然的糖基化位點(diǎn)，或重新定位于可被糖基化的其他位點(diǎn)，如第126和125位。SEP分子還含有氨基和羧基端的修飾，以去除或改變電荷(如羧基端酰胺化，等等)。在這些循環(huán)置換型分子的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例中，新N-端和C-端分別位于第126和125位。優(yōu)選的是將可形成二硫鍵的第7、29、33和161位天然半胱氨酸替換成不能形成二硫鍵的非天然編碼氨基酸L-α-N-丁酸。為了提高產(chǎn)量，優(yōu)選的是將殘基R166、E37和V82替換成丙氨酸。此外，優(yōu)選的是在相對(duì)于天然EPO編號(hào)方案的第1和166位之間插入一個(gè)額外的半胱氨酸，下文將其編號(hào)為“0”。所得分子含有4個(gè)半胱氨酸(在第126、0、38和83位(按N-端至C-端的方向顯示))，這些半胱氨酸可作為(1)連接位點(diǎn)和(2)形成硫醚的pPEG聯(lián)接位點(diǎn)。還可以選擇性地將A125替換成半胱氨酸，以產(chǎn)生一個(gè)額外的pPEG聯(lián)接位點(diǎn)。
本發(fā)明的這些SEP分子的總分子量可約為25-150kDa，更優(yōu)選的是約為30-80kDa。通過(guò)增加或減少用于修飾給定類似物的水溶性聚合物(如pPEG)的數(shù)量和結(jié)構(gòu)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)分子量的控制。較大構(gòu)建體在pPEG介導(dǎo)下的水力MW可大于100kDa?？蛇x的pPEG聯(lián)接位點(diǎn)位于第125、9和24位(按N-端至C-端的方向顯示)。其他SEP類似物設(shè)計(jì)方案是在無(wú)規(guī)卷曲中具有替代的N-和C-末端，以及(或)從新N-末端和(或)C-末端位置帶有截短的殘基。圖11顯示優(yōu)選循環(huán)置換型分子的基本結(jié)構(gòu)。圖12顯示優(yōu)選水溶性聚合物的結(jié)構(gòu)，以及不同的線型和分支型構(gòu)建體。
例如，除本文實(shí)施例中描述的特定SEP構(gòu)建體之外，還通過(guò)對(duì)天然人EPO序列的循環(huán)置換設(shè)計(jì)出一種序列，其方式如下利用額外的Cys殘基使天然的N-端Ala1與C-端Arg166相聯(lián)接，從而產(chǎn)生一種含有167個(gè)氨基酸的多肽；創(chuàng)建新N-端和C-端的方法是使多肽鏈在天然序列的第125-126位殘基處斷裂；將所有天然Cys殘基替換成L-α氨基-n-丁酸殘基；并進(jìn)行如下取代Glu37Ala；Asn38Cys；Val82Ala；Asn83Cys；Ser126Cys；Arg166Ala(所有殘基編號(hào)都是基于天然人EPO序列)。這些設(shè)計(jì)要素的共同結(jié)果是產(chǎn)生所示的SEP-5氨基酸序列。通過(guò)Michael加成反應(yīng)，用馬來(lái)酰亞胺修飾的線型(TTD-Succ)6羧基酯聚合物構(gòu)建體對(duì)SEP-5-L28蛋白的第126、0、24、38和83位Cys殘基(基于人EPO序列的編號(hào)方式)進(jìn)行聚合物修飾。這些變化可用于改善SEP-5-L28蛋白的合成和操作。用4種各含有N-端Cys殘基的肽段制備出所設(shè)計(jì)的序列?；瘜W(xué)連接位點(diǎn)為Cys0、Cys38、Cys83。合成這些肽，其中C-端肽是一種α-羧基酯；另3種肽是α-硫酯，因而N-端Cys殘基的側(cè)鏈被Acm保護(hù)。Cys24的側(cè)鏈未被保護(hù)。從C-端的兩種肽段開(kāi)始，利用天然化學(xué)連接依次使這些肽段相聯(lián)接。然后通過(guò)Michael加成反應(yīng)使連接位點(diǎn)的游離Cys側(cè)鏈與馬來(lái)酰亞胺修飾的線型(TTD-Succ)6羧基酯聚合物構(gòu)建體反應(yīng)，再將Cys側(cè)鏈上的Acm保護(hù)基團(tuán)去除，并以類似方式進(jìn)行下一種肽段的連接和聚合物修飾。在去除Acm基團(tuán)并連接下一種(第4種)肽段之后，以類似方法去除最終的Acm基團(tuán)并進(jìn)行聚合物修飾，從而產(chǎn)生圖30所示的上述循環(huán)置換型聚合物修飾SEP構(gòu)建體。
II.本發(fā)明所述促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的產(chǎn)生盡管聚合物修飾促紅細(xì)胞生成蛋白在此前已有相關(guān)的描述，但本發(fā)明與這些早期成果有明顯的不同。例如，本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白是完全或部分通過(guò)化學(xué)方法合成的。而且本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白上有一個(gè)或多個(gè)特定的、自選的和自定的位點(diǎn)被水溶性聚合物修飾。
此外，本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成蛋白的合成產(chǎn)生方法能夠確保制劑中每個(gè)分子的每個(gè)自選位點(diǎn)和自定位點(diǎn)上都帶有這些修飾。這種合成的一致性和可控性使本發(fā)明與先有技術(shù)中實(shí)現(xiàn)隨機(jī)修飾的方法有顯著的區(qū)別。值得注意的是，本發(fā)明允許設(shè)計(jì)一種促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，該蛋白的任何非關(guān)鍵殘基都可以通過(guò)衍化而包含一種加合聚合物。此外，用戶可以明確規(guī)定所有這些自選位點(diǎn)和自定位點(diǎn)上用于使所述加合物結(jié)合于多肽或蛋白骨架的連接鍵(酰胺鍵、硫酯鍵、硫醚鍵、肟鍵，等等)。而且還可以改變和控制希望在特定位點(diǎn)上出現(xiàn)的特定加合聚合物，從而使終產(chǎn)物中的每種蛋白或多肽都在完全相同的衍化位點(diǎn)上精確含有相同的衍化加合物。因此，本發(fā)明能夠產(chǎn)生均一的聚合物修飾促紅細(xì)胞生成多肽和蛋白制劑。
本發(fā)明不但提供一種方法，用于改變與水溶性聚合物結(jié)合的聯(lián)接位點(diǎn)的位置和數(shù)量，而且還允許改變結(jié)合聚合物的性質(zhì)。在任何特定的自選位點(diǎn)和自定位點(diǎn)上引入的加合聚合物可以是任意規(guī)定的長(zhǎng)度。與本發(fā)明所述方法相同的是，還可以在不同的位點(diǎn)使用不同長(zhǎng)度的聚合物。因此，在一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明的聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白可以被水溶性加合聚合物單重修飾，也可以被多重修飾。當(dāng)在特定多肽或蛋白中引入一種以上的加合聚合物時(shí)，使用的聚合物可以是“單類的”、“復(fù)類的”、“均一類的”或“不同類的”。文中使用的術(shù)語(yǔ)“單類的”是指多肽或蛋白被單一種類的聚合物修飾。相比之下，術(shù)語(yǔ)“復(fù)類的”是指多肽或蛋白被一種以上的單一聚合物修飾。如果復(fù)類多肽或蛋白的每個(gè)修飾位點(diǎn)上存在單一種類的相同聚合物，則可認(rèn)為這些多肽或蛋白是“均一類的”。相比之下，如果復(fù)類多肽或蛋白的修飾位點(diǎn)被不同類型的聚合物修飾，則可認(rèn)為這些多肽或蛋白是“不同類的”。
此外還可以改變每個(gè)自選位點(diǎn)和自定位點(diǎn)上的加合聚合物的線性程度或分支程度。因此，加合聚合物可以是線型的、分支型的或均一分支型的。術(shù)語(yǔ)“均一分支型”是指特定位點(diǎn)上的聚合物的所有分支具有相同的結(jié)構(gòu)和長(zhǎng)度。正如我們所了解的，本發(fā)明可以獨(dú)立地改變?nèi)魏螁我环种У拈L(zhǎng)度，以及出現(xiàn)在該分支點(diǎn)上的聚合物的結(jié)構(gòu)。
總而言之，本發(fā)明可以規(guī)定多肽或蛋白骨架中被聚合物修飾的自選位點(diǎn)和自定位點(diǎn)的(1)位置和(2)頻率，并可以控制所有這些位點(diǎn)上出現(xiàn)的分支的(3)長(zhǎng)度、(4)種類和(5)程度。此外，對(duì)帶有多種聚合物修飾的多肽和蛋白而言，本發(fā)明可以獨(dú)立地規(guī)定每個(gè)位點(diǎn)的上述所有5種變量。此外，對(duì)帶有分支型聚合物修飾的促紅細(xì)胞生成性合成多肽和蛋白而言，本發(fā)明可以獨(dú)立地規(guī)定每個(gè)分支點(diǎn)的上述所有5種變量。這樣就可以合成聚合物精確修飾的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的均一組合物，這些蛋白帶有多個(gè)拷貝的任一種或所有20種不含多余聚合物聯(lián)接的遺傳編碼氨基酸側(cè)鏈。
因此，本發(fā)明在聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的設(shè)計(jì)、合成和應(yīng)用方面提供了很大的靈活性。例如，本發(fā)明所述促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的氨基酸序列與對(duì)應(yīng)的遺傳編碼蛋白的氨基酸序列相比可含有一個(gè)或多個(gè)缺失、插入或取代。該氨基酸序列可以用一種或多種不規(guī)則氨基酸進(jìn)行取代，例如假氨基酸和(或)帶有非天然側(cè)鏈的其他氨基酸，如經(jīng)過(guò)修飾而帶有用于聯(lián)接水溶性加合聚合物的單一化學(xué)選擇性功能基團(tuán)的氨基酸，等等。因此，水溶性聚合物的聯(lián)接可以通過(guò)不規(guī)則氨基酸來(lái)實(shí)現(xiàn)，也可以通過(guò)遺傳編碼的氨基酸來(lái)實(shí)現(xiàn)。該水溶性聚合物可以是線型或分支型的，并且可帶有一種含羧酸、脂肪鏈、酰胺或胺等化學(xué)基的末端基團(tuán)。此外，該水溶性聚合物可以呈單分散狀態(tài)，即含有單一種類的具有明確規(guī)定的結(jié)構(gòu)和成分的分子。因而可以設(shè)計(jì)該水溶性聚合物的性質(zhì)，用于精確調(diào)節(jié)其修飾的靶蛋白的半衰期、免疫原性、效力、保存穩(wěn)定性、劑量、供應(yīng)能力，等等。
具體地說(shuō)，本發(fā)明的聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的產(chǎn)生方法可能包括以下步驟設(shè)計(jì)、肽合成、肽連接、使全長(zhǎng)連接產(chǎn)物折疊以產(chǎn)生蛋白，以及評(píng)定該蛋白的生物活性。我們發(fā)現(xiàn)，聚合物修飾可以在肽合成、肽連接或產(chǎn)物折疊步驟的一個(gè)或多個(gè)步驟中實(shí)現(xiàn)。但優(yōu)選的是在折疊之前將聚合物聯(lián)接于肽或連接產(chǎn)物。在利用該方法產(chǎn)生的蛋白中篩選具有所需生物活性的蛋白，這些蛋白即可作為本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白。
在一種優(yōu)選方法中，含有促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的多肽鏈的制備方法是，將含有促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的非重疊性多肽鏈氨基酸序列的肽段進(jìn)行化學(xué)連接。具體地說(shuō)，本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白分子的制備方法是將含有所需促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的非重疊性多肽鏈氨基酸序列的肽段進(jìn)行化學(xué)連接，其中，用于連接的一種或多種肽段在自定位點(diǎn)和預(yù)定位點(diǎn)上聯(lián)接有水溶性聚合物。然后使聚合物修飾的多肽鏈折疊，以產(chǎn)生本發(fā)明的一種聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白。
用于產(chǎn)生本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的另一種優(yōu)選方法包括，將含有本發(fā)明所述聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的非重疊性多肽鏈氨基酸序列的肽段進(jìn)行化學(xué)連接，并在一種或多種化學(xué)連接位點(diǎn)的氨基酸側(cè)鏈上聯(lián)接一種或多種水溶性聚合物。然后使聚合物修飾的多肽鏈折疊，以產(chǎn)生本發(fā)明的一種聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白。
盡管優(yōu)選程度較低，但促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的制備方法還可以是，(1)將含有促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的非重疊性多肽鏈氨基酸序列的肽段進(jìn)行化學(xué)連接，以產(chǎn)生與促紅細(xì)胞生成性合成蛋白相一致的全長(zhǎng)多肽鏈，其中至少有一種肽段含有一個(gè)不規(guī)則氨基酸，該氨基酸帶有第一種化學(xué)選擇性功能基團(tuán)，(2)使多肽鏈折疊，并且(3)使其與含有第二種化學(xué)選擇性基團(tuán)的水溶性聚合物相聯(lián)接，第二種化學(xué)選擇性基團(tuán)能夠與第一種化學(xué)選擇性基團(tuán)彼此特定地反應(yīng)。
具體地說(shuō)，本發(fā)明包括的以及實(shí)施例中例舉的這些用于合成促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的不同方法可以按附圖所示加以說(shuō)明。例如，圖1A-1E顯示在連接前或在連接后使水溶性聚合物(文中定義的U-B-Polymer*)聯(lián)接于部分未保護(hù)肽段或完全未保護(hù)肽段( )的連接方法，或其組合方法。在圖1A-1D中，Yaa表示第一肽段上帶有特定化學(xué)選擇性基團(tuán)的C端氨基酸(如帶有α-羧基硫酯的氨基酸)，該化學(xué)選擇性基團(tuán)可用于與第二肽段的化學(xué)連接，第二肽段上帶有一種能夠與Yaa產(chǎn)生化學(xué)選擇性化學(xué)連接的可彼此反應(yīng)的特定N端氨基酸Xaa(如氨基末端半胱氨酸)基團(tuán)。Yaa與Xaa的化學(xué)選擇性反應(yīng)可在彼此之間產(chǎn)生一種共價(jià)鍵(如酰胺鍵)。因此，Yaa與Xaa可形成一種化學(xué)選擇性配對(duì)連接。圖中的Un-表示另一種被精確摻入到自定位點(diǎn)的氨基酸側(cè)鏈上的特定化學(xué)選擇性基團(tuán)，該基團(tuán)對(duì)水溶性聚合物U-B-Polymer-J*上的U基團(tuán)具有化學(xué)選擇性，并且可彼此反應(yīng)。例如，當(dāng)Un是一種經(jīng)過(guò)修飾而帶有酮基的側(cè)鏈時(shí)，水溶性聚合物U-Polymer-J*上的U-可以是一種能夠與酮基產(chǎn)生化學(xué)選擇性反應(yīng)的基團(tuán)，例如與酮基產(chǎn)生肟鍵的氨氧基。Un-的下標(biāo)“n”表示用于攜帶化學(xué)選擇性基團(tuán)U的氨基酸或其側(cè)鏈的數(shù)量，例如，當(dāng)有兩個(gè)自定的具體位點(diǎn)要被聚合物修飾時(shí)，n＝2，此時(shí)也可以表示為U2或Un-2。n始終是一個(gè)正整數(shù)，通過(guò)設(shè)計(jì)可以精確地控制n的大小。因此，Un和U表示另一種與化學(xué)選擇性基團(tuán)Xaa和Yaa不反應(yīng)并且相容的化學(xué)選擇性配對(duì)連接。圖1A和1B說(shuō)明兩種不同的可能反應(yīng)。在描述的第一種反應(yīng)中，帶有Un功能性的多肽鏈與另一種多肽相連接，然后與U-B-Polymer-J*基團(tuán)反應(yīng)，以產(chǎn)生聚合物修飾的多肽。在描述的第二種反應(yīng)中，帶有Un功能性的多肽鏈與U-B-Polymer-J*基團(tuán)反應(yīng)，以產(chǎn)生聚合物修飾的多肽，然后再與另一種多肽連接，以產(chǎn)生更長(zhǎng)的聚合物修飾多肽。這兩個(gè)圖的區(qū)別在于，圖1A中是帶有Xaa殘基的多肽被聚合物修飾，而圖1B中是帶有Yaa殘基的多肽被聚合物修飾。圖1C說(shuō)明本發(fā)明能夠在連接成較長(zhǎng)多肽之前或在連接之后對(duì)多種多肽進(jìn)行修飾。在圖1D中，PG和PG’代表保護(hù)基團(tuán)，其中PG’表示一種正交保護(hù)基團(tuán)，即PG和PG’能夠在不同的條件下被去除，從而可用于不同的水溶性聚合物通過(guò)相同的化學(xué)鍵聯(lián)接于Un基團(tuán)的情況，或Un基團(tuán)是不希望被聚合物修飾的側(cè)鏈功能基團(tuán)(例如，在水溶性聚合物的U基團(tuán)被設(shè)計(jì)成專門與伯氨基或側(cè)鏈巰基反應(yīng)的條件下，帶有活性-NH2或-SH的側(cè)鏈)的情況。圖1D顯示，可以用保護(hù)基團(tuán)來(lái)保護(hù)按本發(fā)明所述方法進(jìn)行連接的多肽中的特定側(cè)鏈。
圖1E說(shuō)明一些基團(tuán)的差異，這些基團(tuán)可以在用于圖1A-1D所示連接方法和聚合物修飾方法的肽段中存在，也可以不存在。
圖2A-2C顯示本發(fā)明所述促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的其他制備方法的示意圖。具體地說(shuō)，圖2A-2B描述連接的方法，該方法涉及將水溶性聚合物U-B-Polymer-J*聯(lián)接于氨基末端Xaa基團(tuán)側(cè)鏈上的連接位點(diǎn)(如半胱氨酸的側(cè)鏈巰基)。圖2C說(shuō)明一些基團(tuán)的差異，這些基團(tuán)可以在用于圖2A-2B所示連接方法和聚合物修飾方法的肽段中存在，也可以不存在。
圖3A-3B顯示用于實(shí)現(xiàn)多片段連接的其他方法的示意圖，該方法涉及將3種或3種以上的非重疊肽段進(jìn)行化學(xué)連接，即相對(duì)于全長(zhǎng)連接終產(chǎn)物而言，至少有一個(gè)肽段為中間片段。由這種方式制備的肽可用于產(chǎn)生在另一連接反應(yīng)中使用的肽段，例如圖1A-1E、圖2A-2C和圖4A-4C所示的連接反應(yīng)。一般而言，根據(jù)所用的化學(xué)連接方法，用于多片段連接的中間片段帶有被保護(hù)的Xaa基團(tuán)或被保護(hù)的Yaa基團(tuán)，以避免肽發(fā)生環(huán)化或形成多聯(lián)體。在順序連接或連續(xù)連接反應(yīng)中，中間片段的Xaa基團(tuán)被保護(hù)(例如，Cys(Acm))，而其Yaa基團(tuán)則無(wú)保護(hù)(例如，Yaa-COSR，其中-COSR是α-羧基硫酯)。這里的Yaa基團(tuán)可隨意地與帶有無(wú)保護(hù)的Xaa基團(tuán)的第二種肽反應(yīng)，其中第二種肽沒(méi)有游離的Yaa基團(tuán)。連接完成后，去除保護(hù)基團(tuán)以再生出用于下一連接反應(yīng)的Xaa基團(tuán)。該過(guò)程可根據(jù)需要繼續(xù)進(jìn)行，從而產(chǎn)生延伸的多肽鏈。保護(hù)Yaa基團(tuán)對(duì)匯聚化學(xué)連接尤為有用，包括產(chǎn)生由四種或更多種片段構(gòu)成的連接終產(chǎn)物。舉例來(lái)說(shuō)，對(duì)一種由四片段連接(即進(jìn)行三次連接)而定向產(chǎn)生的蛋白而言，可以將對(duì)應(yīng)于蛋白一個(gè)末端的兩種片段以及對(duì)應(yīng)于蛋白另一末端的兩種片段并行連接，而不是順序連接，然后通過(guò)最終連接反應(yīng)使兩個(gè)末端結(jié)合。這種匯聚型化學(xué)連接方案也可以采用正交連接的化學(xué)物。圖1E、2C和4C再次說(shuō)明了肽段中存在或不存在的一些基團(tuán)的差異。
圖4A-4C說(shuō)明如何按照本發(fā)明的原理來(lái)實(shí)現(xiàn)所得側(cè)鏈巰基的天然化學(xué)連接和化學(xué)修飾。具體地說(shuō)，圖4A-4B描述的是利用連接位點(diǎn)上所得半胱氨酸側(cè)鏈巰基的天然化學(xué)連接和化學(xué)修飾方法，通過(guò)巰烷基化并產(chǎn)生含有硫酯鍵的化學(xué)修飾側(cè)鏈(用ψ表示)來(lái)形成一種“假氨基酸”(用ψXaa表示)。在一項(xiàng)未描述的可選實(shí)施方案中，可以通過(guò)脫硫反應(yīng)將該側(cè)鏈巰基轉(zhuǎn)變成丙氨酸(Liang et al，J.Amer.Chem.Soc.(2001)123(4)526-533)。這兩種反應(yīng)的一個(gè)重要方面是，任何不希望被轉(zhuǎn)變或修飾的其他側(cè)鏈巰基都應(yīng)當(dāng)用一種適當(dāng)保護(hù)基團(tuán)(PG)加以保護(hù)，或在多片段連接中用正交保護(hù)基團(tuán)(PG’)加以保護(hù)，其中帶有羧基末端Yaa基團(tuán)的片段包含一種被保護(hù)的氨基末端Xaa基團(tuán)，即PG-Xaa-肽，通過(guò)圖4B中的例子提供說(shuō)明。圖4C說(shuō)明根據(jù)圖4A-4B以及圖1A-1E、圖2A-2C和圖3A-3B，在用于連接和聚合物修飾中的肽段上可能存在或缺失的各種不同基團(tuán)。
結(jié)合設(shè)計(jì)，構(gòu)建用于合成多肽骨架的肽或多肽片段。其中包括根據(jù)選用于組裝各種多肽骨架片段的連接化學(xué)反應(yīng)來(lái)選擇適當(dāng)?shù)倪B接位點(diǎn)、為指定靶蛋白選擇聚合物結(jié)合化學(xué)反應(yīng)，以及選擇特殊的聚合物結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)使用天然化學(xué)連接時(shí)，通過(guò)在靶多肽骨架氨基酸序列中搜索適當(dāng)?shù)奶烊话腚装彼釟埢鶃?lái)確定半胱氨酸連接位點(diǎn)。當(dāng)使用“擴(kuò)展的天然化學(xué)連接”時(shí)，如文中所述，則可以通過(guò)在靶多肽骨架氨基酸序列中搜索允許堅(jiān)固連接的適當(dāng)?shù)奶烊贿B接位點(diǎn)結(jié)合處來(lái)選擇連接位點(diǎn)，如Xaa-Gly位點(diǎn)。由于擴(kuò)展的天然化學(xué)連接不局限于在半胱氨酸殘基處連接，任何氨基酸殘基都可以作為連接位點(diǎn)結(jié)合處。在某些情況下，結(jié)合天然化學(xué)連接和擴(kuò)展的天然化學(xué)連接可能是設(shè)計(jì)的一部分。
在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，可利用天然化學(xué)連接來(lái)產(chǎn)生部分或所有全長(zhǎng)多肽鏈。在與促紅細(xì)胞生成性合成蛋白對(duì)應(yīng)的天然蛋白中存在的半胱氨酸可被用作化學(xué)連接位點(diǎn)。但是當(dāng)優(yōu)選連接點(diǎn)上沒(méi)有適當(dāng)?shù)陌腚装彼釙r(shí)，可以將該位點(diǎn)上的非半胱氨酸氨基酸替換成半胱氨酸，以使該位點(diǎn)能夠發(fā)生天然化學(xué)連接。如果需要，還可以按照文中的描述將新引入的半胱氨酸轉(zhuǎn)變成與該位點(diǎn)的伯氨基酸相對(duì)應(yīng)的假氨基酸殘基。作為選擇，當(dāng)在某個(gè)位點(diǎn)上引入用于聚合物修飾的半胱氨酸時(shí)，可利用其側(cè)鏈巰基來(lái)聯(lián)接巰基反應(yīng)性水溶性聚合物構(gòu)建體，條件是靶多肽上不希望被修飾的其他所有半胱氨酸都已被保護(hù)。
在另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，可利用文中描述的擴(kuò)展的天然化學(xué)連接方法來(lái)產(chǎn)生部分或所有全長(zhǎng)多肽。該方法是使用N-末端的Nα-取代2或3碳鏈的烷基或芳基巰基氨基酸。根據(jù)文中描述的擴(kuò)展的天然化學(xué)連接方法，可以有利地使用這些殘基(當(dāng)存在于用于連接的肽段或多肽段的N-端時(shí))將這種多肽連接于一種帶有C-端α-羧基硫酯基團(tuán)的多肽。
用于合成肽類的常用方法是，用標(biāo)準(zhǔn)的自動(dòng)化肽合成儀進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的Boc和(或)Fmoc逐級(jí)固相肽合成，或按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行手動(dòng)合成，也可以從供應(yīng)商處定制和購(gòu)買。(“合成肽，用戶指南”，G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman & Company，New York，NY，1992；“肽合成原理，第二版”，M.Bodanszky，Ed.，Springer-Verlag，1993；“肽合成準(zhǔn)則，第二版”，M.Bodanszky和A.Bodanszky，Eds.，Springer-Verlag，1994；以及“保護(hù)基團(tuán)”，P.J.Kocienski，Ed.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994；“Fmoc固相肽合成，實(shí)用方法”，Eds.，W.C.Chan和P.D.White，Oxford UniversityPress，2000)。用于硫酯介導(dǎo)型連接連接的肽類，如用于天然化學(xué)連接的肽類，也可以用標(biāo)準(zhǔn)方法制備。(可參考，例如，Dawson et al.，Science(1994)266776-779；Canne et al.，Tetrahedron Lett.(1995)361217-1220；Kent，et al.，WO96/34878；Kent，et al.，WO98/28434；Ingenito et al.，JACS(1999)121(49)11369-11374；and Hackeng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)9610068-10073；Amiato et al.，同上)
在水溶性聚合物的連接和位點(diǎn)特異性聯(lián)接過(guò)程中，肽的合成采用的是化學(xué)正交策略(參考，例如，圖1-4和實(shí)施例)，以便能避免造成不必要聯(lián)接的副反應(yīng)。舉例來(lái)說(shuō)，根據(jù)連接方案和聚合物聯(lián)接方法，可以采用不同的正交合成策略。具體地說(shuō)，應(yīng)該考慮的因素有，用于聯(lián)接的水溶性聚合物的性質(zhì)，特別是其與多肽結(jié)合的功能基團(tuán)，例如下文針對(duì)本發(fā)明優(yōu)選的擬糖聚合物進(jìn)行的論述。
具體地說(shuō)，制成的上述水溶性聚合物包含一種特有的功能基團(tuán)U，該基團(tuán)能選擇性地與用于連接的靶肽、全長(zhǎng)物質(zhì)、甚至折疊多肽上的一種特有的功能基團(tuán)反應(yīng)。由于使用了化學(xué)合成方法，所以制成的肽在精確自定位點(diǎn)含有一種可彼此反應(yīng)的化學(xué)選擇性基團(tuán)。本發(fā)明的該方面包括肽合成原理(保護(hù)基團(tuán)策略)和化學(xué)連接(部分保護(hù)或無(wú)保護(hù)基團(tuán)策略)。在保護(hù)基團(tuán)策略中，除了水溶性聚合物上所需的功能基團(tuán)外，靶分子上所有可能的反應(yīng)性功能基團(tuán)及其可彼此反應(yīng)的功能基團(tuán)都用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)封閉。已知的許多保護(hù)基團(tuán)都適合用于該目的(可參考，例如，“有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)”，第三版，T.W.Greeneand P.G.M.Wuts，Eds.，John Wiley & Sons，Inc.，1999；NovaBiochemCatalog 2000；“合成肽，用戶指南”，G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman& Company，New York，NY，1992；“Advanced Chemtech組合有機(jī)化學(xué)與固相有機(jī)化學(xué)手冊(cè)”，W.D.Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhoded，and H.H.Saneii，Eds.，Advanced Chemtech，1998；“肽合成原理，第二版”，M.Bodanszky，Ed.，Springer-Yerlag，1993；“肽合成準(zhǔn)則，第二版”，M.Bodanszky和A.Bodanszky，Eds.，Springer-Yerlag，1994；以及“保護(hù)基團(tuán)”，P.J.Kocienski，Ed.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994)。
因此，制成的水溶性聚合物可具有各種功能基團(tuán)，例如上文描述的那些功能基團(tuán)。在部分保護(hù)或無(wú)保護(hù)基團(tuán)策略中，所使用的聚合物上的功能基團(tuán)及其可彼此反應(yīng)的存在于靶肽或靶多肽上的功能基團(tuán)是一種化學(xué)選擇性反應(yīng)對(duì)，反應(yīng)系統(tǒng)中即使存在其他功能基團(tuán)也不會(huì)發(fā)生反應(yīng)。其中包括可用于胺捕獲策略(例如通過(guò)半胺形成、亞胺形成和Michael加成反應(yīng)而連接)、巰基捕獲策略(例如通過(guò)硫醇鹽形成、二硫化物交換而連接)、天然化學(xué)連接策略(例如通過(guò)硫酯交換，其中包括側(cè)鏈含有半胱氨酸或巰基的氨基酸衍生物)，以及正交連接耦聯(lián)策略(例如通過(guò)噻唑烷形成、硫酯交換、硫酯形成、二硫化物交換和胺形成而連接)的基團(tuán)(可參考，例如，Coltart，DM.，Tetrahedron(2000)563449-3491)。
該實(shí)施方案中優(yōu)選的化學(xué)選擇性U基團(tuán)應(yīng)包含一種帶有特異功能基團(tuán)的殘基，該功能基團(tuán)可用于水兼容性化學(xué)連接，如天然化學(xué)連接(Dawson，et al.，Science(1994)266776-779；Kent，et al.，WO96/34878)、擴(kuò)展的常規(guī)化學(xué)連接(Kent，et al.，WO98/28434)、肟型化學(xué)連接(Rose，et al.，J.Amer.Chem.Soc.J.Amer.Chem.Soc.(1994)11630-33)、硫酯型連接(Schnlzer，et al.，Science(1992)256221-225)、巰醚型連接(Englebretsen，et al.，Tet.Letts.(1995)36(48)8871-8874)、腙型連接(Gaertner，et al.，Bioconj.Chem.(1994)5(4)333-338)，以及噻唑烷型連接和惡唑烷型連接(Zhang，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1998)95(16)9184-9189；Tam，et al.，WO95/00846)或其他方法(Yan，L.Z.andDawson，P.E.，“利用天然化學(xué)連接與脫硫的組合方法來(lái)合成不含半胱氨酸殘基的肽和蛋白質(zhì)”，J.Am.Chem.Soc.2001，123，526-533，在此引入作為參考；Gieselnan et al.，Org.Lett.20013(9)1331-1334；Saxon，E.et al.，“Traceless”staudingerLigation for the Chemoselective Synthesis of Amide Bonds，Org.Lett.2000，2，2141-2143)。
根據(jù)上文描述的多種聯(lián)接化學(xué)性質(zhì)，在水溶性聚合物與靶肽或靶多肽之間形成的鍵可選自羧酸酯鍵、酯鍵、尿烷鍵、原酯鍵、酰胺鍵、胺鍵、肟鍵、酰亞胺鍵、脲鍵、硫脲鍵、硫醚鍵、硫尿烷鍵、硫酯鍵、醚鍵、噻唑烷鍵、腙鍵、惡唑烷鍵，等等。最優(yōu)選的鍵是肟鍵和酰胺鍵。
上述肽連接反應(yīng)步驟，如圖1-4所示，可以使用固相或液相連接策略。圖8描述了另一種用于將水溶性聚合物與一種肽段精確聯(lián)接的方法，該肽段可用于連接產(chǎn)生本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白。第一步使用了固相肽合成(“SPPS”)(例如Fmoc或Boc SPPS)，其中與聚合物定向連接的氨基酸側(cè)鏈被一種正交保護(hù)基團(tuán)所保護(hù)(例如，如果用Fmoc SPPS，可使用Boc基團(tuán)來(lái)保護(hù)聚合物結(jié)合位點(diǎn)，或者，如果用Boc SPPS，則可以使用Fmoc基團(tuán)作為正交保護(hù)基團(tuán))。在肽合成之后，上述正交保護(hù)基團(tuán)被選擇性地去除，而其余的肽仍被保護(hù)。這樣就為下一步固相聚合物合成提供了單一結(jié)合位點(diǎn)。一旦正交保護(hù)基團(tuán)被去除，聚合物鏈就作為一種前體被結(jié)合。更優(yōu)選的是用圖6A-6D中描述的方法逐輪的合成該聚合物鏈。盡管只顯示了一種單一聚合物結(jié)合位點(diǎn)，但是可提供的多于一種。圖9顯示整個(gè)反應(yīng)的流程圖。
如上所述，化學(xué)連接涉及在第一種化學(xué)成分和第二種化學(xué)成分之間形成一種選擇性共價(jià)鍵的過(guò)程。使用第一種和第二種成分上存在的可彼此反應(yīng)的特異功能基團(tuán)可以使連接反應(yīng)具有化學(xué)選擇性。舉例來(lái)說(shuō)，肽和多肽的化學(xué)連接涉及帶有相容的可彼此反應(yīng)的C-端和N-端特異氨基酸殘基的肽或多肽片段的化學(xué)選擇性?？衫枚喾N不同的化學(xué)反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)該目的，其實(shí)例包括天然化學(xué)連接(Dawson，et al.，Science(1994)266776-779；Kent，et al.，WO96/34878)、肟型化學(xué)連接(Rose，et al.，J.Amer.Chem.Soc.J.Amer.Chem.Soc.(1994)11630-33)、硫酯型連接(Schnlzer，et al.，Science(1992)256221-225)、巰醚型連接(Englebretsen，et al.，Tet.Letts.(1995)36(48)8871-8874)、腙型連接(Gaertner，et al.，Bioconj.Chem.(1994)5(4)333-338)，以及噻唑烷型連接和惡唑烷型連接(Zhang，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(1998)95(16)9184-9189；Tam，et al.，WO95/00846；美國(guó)專利5,589.356)；Gieselman et al.，Selenocysteine介導(dǎo)的天然化學(xué)連接(Org.Lett.(2001)3(9)1331-1334))；以及Staudinger酰胺型化學(xué)連接(Saxon et al.，Org.Lett.(2000)22141-2143)。因此，可以理解，能用于聯(lián)接未保護(hù)肽段的任何化學(xué)選擇性反應(yīng)化學(xué)都適用于該目的。
選擇給定的連接化學(xué)反應(yīng)條件是為了維持連接反應(yīng)中使用的肽或多肽的所需的相互作用。例如，pH和溫度、連接反應(yīng)標(biāo)記物在水中的溶解度、第一種片段與第二種片段的比率、水含量以及反應(yīng)混合物的成分，都可以被改變以優(yōu)化連接。利用添加或去除能使連接片段以不同程度溶解的試劑可進(jìn)一步控制所需連接反應(yīng)的特異性和速率，即通過(guò)操縱肽或多肽片段的溶解度來(lái)控制反應(yīng)基團(tuán)的暴露程度和提供量。通過(guò)對(duì)所需的化學(xué)選擇性反應(yīng)產(chǎn)物與一種或多種內(nèi)部對(duì)照和(或)外部對(duì)照的比較結(jié)果進(jìn)行分析，可以容易地確定反應(yīng)條件。
當(dāng)連接涉及接合具有N-末端半胱氨酸殘基的多肽時(shí)，優(yōu)選使用天然化學(xué)連接方法(Dawson，et al.，Science(1994)266776-779；Kent，et al.，WO96/34878)。該方法被證實(shí)是一種用以在連接位點(diǎn)產(chǎn)生天然酰胺鍵的可靠方法。天然化學(xué)連接涉及在具有C-末端α-羧基硫酯基團(tuán)的第一種肽或多肽片段和具有N-末端半胱氨酸殘基的第二種肽或多肽之間發(fā)生的一種化學(xué)選擇性反應(yīng)。巰基交換反應(yīng)產(chǎn)生了一種初始硫酯-聯(lián)中間體，其自發(fā)地重排以在連接位點(diǎn)上形成一種天然酰胺鍵，同時(shí)再生出半胱氨酸側(cè)鏈巰基。在許多情況下，天然蛋白的序列會(huì)包含位置適當(dāng)?shù)陌腚装彼?，從而可以合成具有N-末端半胱氨酸殘基的多肽片段，并將其用于天然化學(xué)連接。在另外的一些情況下，可以引導(dǎo)肽合成，以便在多肽中引入半胱氨酸殘基以實(shí)現(xiàn)該目的。例如在其標(biāo)準(zhǔn)形式，天然化學(xué)連接涉及在靶多肽序列的半胱氨酸殘基上發(fā)生的硫酯-介導(dǎo)的化學(xué)選擇性反應(yīng)；在連接位點(diǎn)上形成了一種肽鍵，并且再生出天然形式的Cys的側(cè)鏈。
作為選擇，通過(guò)使用“假天然化學(xué)連接”或“擴(kuò)展的天然化學(xué)連接”可以合成出本發(fā)明的蛋白。假天然化學(xué)連接涉及使用在用于蛋白合成的肽類中的預(yù)選位置上的非天然的假氨基酸殘基(例如，見(jiàn)圖4)。該假氨基酸的結(jié)構(gòu)既模擬了半胱氨酸的結(jié)構(gòu)，又模擬了在合成蛋白的這種預(yù)選位置上發(fā)現(xiàn)的天然氨基酸的結(jié)構(gòu)。因此，假天然化學(xué)連接涉及由天然化學(xué)連接在連接位點(diǎn)產(chǎn)生的半胱氨酸的側(cè)鏈的硫烷化。一個(gè)優(yōu)選方面是，在發(fā)生半胱氨酸硫烷化的連接位點(diǎn)處，至少有一種肽含有一個(gè)具有經(jīng)一種適當(dāng)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的巰基的天然半胱氨酸。
在本發(fā)明的一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，半胱氨酸基團(tuán)的巰基部分被修飾成為一種預(yù)期的側(cè)鏈，例如，一種核糖體特異性氨基酸及其類似物的側(cè)鏈，，或一種非核糖體特異性氨基酸的側(cè)鏈。文中所用的核糖體特異性氨基酸是指，在蛋白翻譯過(guò)程中可被核糖體識(shí)別并摻入到核糖體所產(chǎn)生的蛋白中的氨基酸。大量已發(fā)表的文獻(xiàn)中都有關(guān)于對(duì)半胱氨酸側(cè)鏈巰基進(jìn)行化學(xué)修飾的描述(可參考，例如，”蛋白科學(xué)中的通用方法”，由John E.Coligan et al.，John Wiley & Sons主編，NY(2000))。Kaiser，E.T.對(duì)轉(zhuǎn)變半胱氨酸的側(cè)鏈以模擬天然氨基酸側(cè)鏈的特性進(jìn)行了描述(參考，例如，Kaiser，E.T.et al.，“酶活性位點(diǎn)的化學(xué)改變”，Science.1984 Nov 2；226(4674)505-11)。此外，也描述了使用半胱氨酸側(cè)鏈來(lái)將一種標(biāo)記物引入肽或蛋白的方法。關(guān)于半胱氨酸側(cè)鏈修飾的綜述可參考“蛋白接合和交聯(lián)化學(xué)”，S.S.Wong，(1991，CRC Press)；“蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾”，Gary E.Means et al.，(1971，Holden-day)，“蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾精選方法和分析過(guò)程”，Glazer，A.N.et al.，(1975，Elsevier)；“用于蛋白修飾的化學(xué)試劑”，RL Lundblad(1991，CRC Press)。Tam et al.(Biopolymers(1998)46319-327)公開(kāi)了將同型半胱氨酸用于非-Cys天然化學(xué)連接，然后用對(duì)-硝基苯磺酸鹽(甲基化試劑)將同型半胱氨酸側(cè)鏈通過(guò)硫烷化而轉(zhuǎn)變?yōu)樘烊患琢虬彼岬膫?cè)鏈(-CH2-CH2-S-CH3)的方法。此外，本發(fā)明也可被用于將同型半胱氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧侔被?，即轉(zhuǎn)變?yōu)槌琢虬彼嵬獾钠渌被帷５?，根?jù)本發(fā)明，對(duì)至少含有一個(gè)不希望被轉(zhuǎn)變的天然半胱氨酸的肽而言，在配對(duì)形成二硫化物的過(guò)程中必須使用保護(hù)基團(tuán)來(lái)避免其天然半胱氨酸被破壞，這與文中描述的半胱氨酸轉(zhuǎn)變方法相同。適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)將在下文描述。
雖然假天然化學(xué)連接方法無(wú)助于模擬某些核糖體特異性氨基酸的側(cè)鏈(如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸及脯氨酸的側(cè)鏈)(但丙氨酸側(cè)鏈可以通過(guò)脫硫反應(yīng)來(lái)形成(Liang，Z.Y.and Dawson，P.E.，“利用天然化學(xué)連接與脫硫的組合方法來(lái)合成不含半胱氨酸殘基的肽和蛋白質(zhì)”，J.Am.Chem.Soc.2001，123，526-533，在此引入作為參考))，但是可用于形成與多種核糖體特異性氨基酸或非編碼氨基酸類似的側(cè)鏈。按照本發(fā)明的假天然化學(xué)連接方法產(chǎn)生的氨基酸將含有巰醚鍵，而且不具有β-分支(因?yàn)樗鼈兊摩挛簧隙际羌谆碼a-CH2-S-)。因此，β-分支型氨基酸、異亮氨酸和蘇氨酸的假氨基酸形式可以具有懸垂側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，而沒(méi)有β幾何結(jié)構(gòu)和相應(yīng)的幾何約束。
值得注意的是，本發(fā)明的上述方法可用于形成與核糖體特異性氨基酸側(cè)鏈的長(zhǎng)度相同或更長(zhǎng)或更短的氨基酸側(cè)鏈。利用側(cè)鏈長(zhǎng)度的這種變化可以使三維構(gòu)象穩(wěn)定(或不穩(wěn)定)，以增加蛋白的穩(wěn)定性(或增強(qiáng)蛋白改變自身構(gòu)象的能力，從而能接受與天然蛋白的底物、抑制劑、受體、配體等不同的底物、抑制劑、受體、配體)。例如，cys-CH2-SH+Br-CH2-COOH得到Cys-CH2-S-CH2-COOH(這種“假谷氨酸”具有一個(gè)額外的側(cè)鏈原子，即-S-基；作為選擇，如果在上述位置中使用天冬氨酸，所得產(chǎn)物會(huì)具有兩個(gè)額外的側(cè)鏈原子，即-S-CH2-基)。其他側(cè)鏈也具有相同數(shù)量的側(cè)鏈原子，但不同的是摻入了巰醚鍵(-S-)。例如，Cys-CH2-SH+Br-CH2-NH-PG，在去除PG后得到Cys-CH2-S-CH2-NH2。所得結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈中沒(méi)有額外原子，但是一個(gè)-CH2-基團(tuán)被-S-所代替。本文的另一個(gè)實(shí)例是甲硫氨酸，Cys-CH2-SH+I-CH2-CH3得到Cys-CH2-S-CH2-CH3(與天然甲硫氨酸的結(jié)構(gòu)對(duì)比Met-CH2-CH2-S-CH3)；從而巰醚被重定位了。精氨酸也是如此Cys-CH2-SH+Br-CH2-NH-CH((-NH2)(＝NH2+))得到Cys-CH2-S-CH2-NH-CH((-NH2)(＝NH2+))。優(yōu)選的是將反應(yīng)性氨基保護(hù)起來(lái)，具體地說(shuō)，在構(gòu)建假賴氨酸過(guò)程中使用該方法可避免不必要的副反應(yīng)。一旦硫烷化反應(yīng)完成，即可去除保護(hù)基團(tuán)。
總的來(lái)說(shuō)，當(dāng)需要盡可能地模擬天然蛋白時(shí)，最優(yōu)選的是使用與蛋白在該位置正常出現(xiàn)的核糖體特異性氨基酸的側(cè)鏈長(zhǎng)度相同的假氨基酸分子；優(yōu)選程度較低的是使用比核糖體特異性氨基酸的側(cè)鏈長(zhǎng)一個(gè)原子的假氨基酸分子，優(yōu)選程度更低的是使用比核糖體特異性氨基酸的側(cè)鏈長(zhǎng)兩個(gè)原子的假氨基酸分子。此外，在選擇半胱氨酸連接位點(diǎn)時(shí)，優(yōu)選的是不會(huì)發(fā)生遺傳突變而破壞其功能的位點(diǎn)，或該位置上的氨基酸是相關(guān)蛋白中的保守氨基酸的位點(diǎn)。利用丙氨酸掃描、同源性模擬以及其他方法可以確定這些位點(diǎn)。
與天然化學(xué)連接相同，假天然化學(xué)連接也是將含有氨基末端半胱氨酸殘基的肽與含有羧基末端硫酯的肽相連接。然后使半胱氨酸的巰基側(cè)鏈與通式為Raa-X的一種化合物反應(yīng)，其中，X是一種有用的保留基團(tuán)，而Raa是一種基團(tuán)，其結(jié)構(gòu)模擬了核糖體特異性氨基酸或合成氨基酸的側(cè)鏈末端部分。
值得注意的是，用于假天然化學(xué)連接的半胱氨酸側(cè)鏈可以是天然的L一型，也可以是D-型。使用D-型可以在連接位點(diǎn)引入蛋白酶抗性，因此，當(dāng)需要增加蛋白酶解穩(wěn)定性時(shí)，可能需要使用D-型半胱氨酸。但使用D-型半胱氨酸時(shí)，該位點(diǎn)的骨架結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變。除蛋白酶抗性外，這種變化還可用于改變生物活性。但是，為了盡可能減小對(duì)生物活性的影響，優(yōu)選的是將D-型半胱氨酸定位于無(wú)序區(qū)等具有高度柔性的位點(diǎn)，例如所得折疊分子表面的無(wú)規(guī)卷曲部位，或分子的無(wú)序末端。理想的是通過(guò)假天然化學(xué)連接將帶電的大側(cè)鏈(如Lys、Arg、Asp或Glu的側(cè)鏈)置于合成分子的表面。
合適的有用保留基團(tuán)X的實(shí)例包括鹵素，特別是碘和溴。Raa基團(tuán)的實(shí)例包括PO4、COOH、COO、CONH2、胍鹽、胺、烷基、取代烷基、芳基、取代芳基、咪唑、烷化咪唑、吲哚或烷化吲哚基團(tuán)。
選擇使用何種Raa取決于需要在特定位置上呈現(xiàn)的氨基酸側(cè)鏈。因此，以具有如下氨基酸序列的一種預(yù)期多肽或蛋白為例 其中Q和W分別表示可以存在或缺失的額外氨基酸殘基，aax和aay表示內(nèi)部相鄰殘基(分別具有側(cè)鏈x和y)，而aaNH2和aaCOOH分別表示多肽或蛋白的氨基(N-)末端殘基和羧基(C-)末端殘基，該多肽或蛋白的合成方法是制備兩種肽段 和Cys-W-aaCOOH其中Cys表示用半胱氨酸替換aay，并且R是與硫酯基團(tuán)相容的任何基團(tuán)，其中包括，但不局限于，芳基、芐基和烷基。R的實(shí)例包括3-羧基-4-硝苯基硫酯、芐酯和巰基丙酸亮氨酸酯(參考，例如，Dawsonet al.，Science(1994)266776-779；Canne et al.，TetrahedronLett.(1995)361217-1220Kent，et al.，WO96/34878；Kent，et al.，WO98/28434；Ingenito et al.，JACS(1999)121(49)11369-11374以及Hackeng et al.，Proc．Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)9610068-10073)。其他實(shí)例包括二硫蘇糖醇、烷基或芳基巰基酯，它們可以通過(guò)眾所周知的intein-介導(dǎo)的生物學(xué)技術(shù)而產(chǎn)生(參考，例如，Chong et al.，Gene(1997)192277-281；Chong et al.，Nucl.Acids Res.，(1998)265109-5115；Evanset al.，Protein Science(1998)72256-2264；and Cotton et al.，Chemistry & Biology(1999)6(9)247-256)；然后使上述片段相連接，以形成
再使連接片段與Ry-X反應(yīng)，其中，Ry是一種能夠模擬y側(cè)鏈結(jié)構(gòu)的側(cè)鏈基團(tuán)。該反應(yīng)是在足以使半胱氨酸的巰基轉(zhuǎn)變?yōu)椤凹?y”側(cè)鏈的條件下進(jìn)行的。舉例來(lái)說(shuō)，如果所選的Raa是CH2-COOH或(CH2)2-COOH，那么該反應(yīng)會(huì)形成一種能夠模擬天冬氨酸或谷氨酸結(jié)構(gòu)和功能的氨基酸殘基(“假-Asp”或“假-Glu”)。如上所述可知，也可以使用兩種以上的肽段來(lái)進(jìn)行更復(fù)雜的合成反應(yīng)。
該方法的一個(gè)重要特征是對(duì)反應(yīng)片段中不希望被修飾的半胱氨酸殘基進(jìn)行側(cè)鏈保護(hù)，以避免連接位點(diǎn)以外的Cys殘基被化學(xué)修飾，或防止反應(yīng)片段中計(jì)劃通過(guò)連接反應(yīng)后化學(xué)修飾來(lái)形成相同“假氨基酸”的其他任何Cys殘基被化學(xué)修飾。
文中所用的符號(hào)表示芐基；IM表示咪唑基團(tuán)，而IN表示吲哚基團(tuán)；PG表示保護(hù)基團(tuán)。下文總結(jié)了可用以合成含有根據(jù)本發(fā)明的假氨基酸殘基的Raa側(cè)部基團(tuán)(其中X是鹵素(I、Br、Cl和F)，并且最優(yōu)選的是I和Br，而F優(yōu)選用于與連接)堿性氨基酸Lys(無(wú)額外原子)-CH2-SH+X-CH2-CH2-NH-PG，然后去保護(hù)形成-CH2-S-CH2-CH2-NH2Arg(無(wú)額外原子)-CH2-SH+X-CH2-NH-C((NH2)(＝NH2+))形成-CH2-S-CH2-NH-C((NH2)(＝NH2+))His(2個(gè)額外原子)-CH2-SH+X-CH2-IM形成-CH2-S-CH2-IM酸性氨基酸Asp(2個(gè)額外原子)-CH2-SH+X-CH2-COOH形成-CH2-S-CH2-COOH
Glu(1個(gè)額外原子)-CH2-SH+X-CH2-COOH形成-CH2-S-CH2-COOH不帶電荷的極性氨基酸Tyr(無(wú)或1個(gè)額外原子)-CH2-SH+F--pOH形成-CH2-S--pOH)(無(wú)額外原子，相同的幾何結(jié)構(gòu))-CH2-SH+Br/l-CH2--pOH形成-CH2-S-CH2--pOH(1個(gè)額外原子)Gln(1個(gè)額外原子)-CH2-SH+X-CH2-C(O)(NH2)形成-CH2-S-CH2-C(O)(NH2)Asn(2個(gè)額外原子)-CH2-SH+X-CH2-C(O)(NH2)形成-CH2-S-CH2-C(O)(NH2)Ser(2個(gè)或3個(gè)額外原子)-CH2-SH+X-CH2OH)形成-CH2-S-CH2OH(2個(gè)額外原子)-CH2-SH+X-CH2-CH2OH)形成-CH2-S-CH2-CH2OH(3個(gè)額外原子)Thr(2個(gè)或3個(gè)額外原子，喪失β分支)-CH2-SH+X-CH((CH3)(O-PG))然后去除PGgives-CH2-S-CH((CH3)(OH))(2個(gè)額外原子)-CH2-SH+X-CH2-CH((CH3)(O-PG))然后去除PGgives-CH2-S-CH2-CH((CH3)(OH))(3個(gè)額外原子)非極性氨基酸Leu(1個(gè)或2個(gè)額外原子)-CH2-SH+X-CH((CH3)(CH3))形成-CH2-S-CH((CH3)(CH3))(1個(gè)額外原子)
-CH2-SH+X-CH2-CH((CH3)(CH3))形成-CH2-S-CH2-CH((CH3)(CH3))(2個(gè)額外原子)Ile(2個(gè)或3個(gè)額外原子，喪失β分支)-CH2-SH+X-CH(CH3)-CH2-CH3形成-CH2-S-CH(CH3)-CH2-CH3(2個(gè)額外原子)-CH2-SH+X-CH2-CH(CH3)-CH2-CH3形成-CH2-S-CH2-CH(CH3)-CH2-CH3(3(3個(gè)額外原子)Phe(1個(gè)或2個(gè)額外原子)-CH2-SH+F-形成-CH2-S-(1個(gè)額外原子)-CH2-SH+Br/l-CH2-形成-CH2-S-CH2-(2個(gè)額外原子)Met(無(wú)額外原子)-CH2-SH+l-CH2-CH3形成-CH2-S-CH2-CH3Trp(1個(gè)額外原子)-CH2-SH+F-IN形成-CH2-S-IN但是，在不便于或不希望對(duì)蛋白序列進(jìn)行修飾以在多肽的特定N-端引入用于連接的半胱氨酸或高半胱氨酸殘基或在連接位點(diǎn)使用假氨基酸的情況下，可以將天然化學(xué)連接方法加以擴(kuò)展，即使用N-端被修飾成含有N-取代的，優(yōu)選的是Nα-取代的，2或3碳鏈的烷基或芳基巰基氨基酸的多肽，從而可以將天然化學(xué)連接的原理應(yīng)用于不含半胱氨酸殘基的多肽(參考美國(guó)專利申請(qǐng)系列60/231,339，在此引入作為參考)。
“擴(kuò)展的天然化學(xué)連接”方法涉及將含有羧基硫酯的，更優(yōu)選的是α-羧基硫酯的，第一種成分與含有N-取代的，優(yōu)選的是Nα-取代的，2或3碳鏈的烷基或芳基巰基氨基酸的第二種成分相連接。第一種成分中的羧基硫酯與第二種成分中N-取代2或3碳鏈的烷基或芳基巰基上的巰基之間可通過(guò)硫酯鍵連接的中間體發(fā)生化學(xué)選擇性反應(yīng)，并形成最初的連接產(chǎn)物。更具體地說(shuō)，COSR硫酯成分與氨基烷基硫成分之間的巰基交換可產(chǎn)生一種硫酯鍵連接的中間連接產(chǎn)物，該產(chǎn)物在自發(fā)重排之后可經(jīng)過(guò)一種5元或6元環(huán)中間體而產(chǎn)生酰胺鍵連接的第一連接產(chǎn)物，中間體的形式取決于氨基烷基硫成分的通式分別為I還是II
J1-C(O)-N(C1(R1)-C2-SH)-J2 IJ1-C(O)-N(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-SH)-J2II其中J1是含有一種或多種可選擇性地被保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈的肽或多肽或其部分、一種聚合物、一種染料、一種適當(dāng)功能化的表面、一種連接物或可檢測(cè)標(biāo)記，或適用于化學(xué)肽合成或擴(kuò)展的天然化學(xué)連接的其他任何化學(xué)基團(tuán)；R1、R2和R3各自是與C1結(jié)合的H或供電子基團(tuán)；條件是R1、R2和R3中的至少一種含有與C1結(jié)合的供電子基團(tuán)；J2是含有一種或多種可選擇性地被保護(hù)的氨基酸側(cè)鏈的肽或多肽或其部分、一種聚合物、一種染料、一種適當(dāng)功能化的表面、一種連接物或可檢測(cè)標(biāo)記，或適用于化學(xué)肽合成或擴(kuò)展的天然化學(xué)連接的其他任何化學(xué)基團(tuán)。
連接位點(diǎn)上的N-取代2或3碳鏈的烷基或芳基巰基[HS-C2-C1(R1)-]或[HS-(C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-)可以在不破壞產(chǎn)物的肽相容條件下被去除，從而在連接位點(diǎn)上產(chǎn)生具有天然酰胺鍵的通式III的最終連接產(chǎn)物J1-C(O)-HN-J2 III其中J1、J2、R1、R2和R3的定義如上文所述。
選擇的R1、R2和R3基團(tuán)有助于在肽相容裂解條件下將N-C1鍵裂解。例如，可利用供電子基團(tuán)，特別是與C1結(jié)合的供電子基團(tuán)，在C1處形成一種能夠促進(jìn)裂解的共振穩(wěn)定性陽(yáng)離子。優(yōu)選的是，化學(xué)連接反應(yīng)包含一種作為賦形劑的巰基催化劑，并且該反應(yīng)是在pH值約為中性的條件下在水相或有機(jī)-水混合相環(huán)境中進(jìn)行。第一種成分與第二種成分可以通過(guò)一種能夠自發(fā)重排而形成N-取代酰胺鍵連接產(chǎn)物的5元或6元環(huán)來(lái)實(shí)現(xiàn)化學(xué)連接。當(dāng)?shù)谝环N成分和第二種成分均為肽或多肽時(shí)，N-取代酰胺鍵連接產(chǎn)物具有通式IV或VJ1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2 IVJ1-C(O)-Nα(C1(R1)-C2(R2)-C3(R3)-HS)-CH(Z2)-C(O)-J2 V文中J1、J2、R1、R2、R3和Z2的定義如上文所述。
在N-取代酰胺鍵連接產(chǎn)物上結(jié)合的供電子基團(tuán)R1、R2或R3可促進(jìn)N-C1鍵的裂解，并有助于將2或3碳鏈烷基或芳基巰基從N-取代酰胺鍵連接產(chǎn)物上去除。在肽相容性裂解條件下將N端烷基或芳基巰基鏈去除后，可產(chǎn)生一種在連接位點(diǎn)上具有天然酰胺鍵的連接產(chǎn)物。當(dāng)?shù)谝环N成分和第二種成分均為肽或多肽時(shí)，N-取代酰胺鍵連接產(chǎn)物具有通式J1-CONαH-CH(Z2)-C(O)-J2 X通式I中的典型的R1取代基顯示在表1中。
表1
通式II中的典型的R1、R2和R3取代基顯示在表2中 與N-取代2碳鏈化合物的情況相同，為了保持與C1碳的電共軛，芐基和吡啶甲基供電子取代基R1’、R3’和R5’必需定位于鄰位或?qū)ξ簧?，以加?qiáng)連接后的Nα-C1鍵裂解。但是當(dāng)R2和R3是與C2和C3形成芐基時(shí)，R1’和R3’中的至少一種應(yīng)含有強(qiáng)供電子基團(tuán)，其中R1’或R3’選自甲氧基(-OCH3)、巰基(-SH)、羥基(-OH)，以及甲硫基(-SCH3)。當(dāng)N-取代3碳硫代鏈中的R2和R3為氫時(shí)，R1可含有一種芐基或吡啶甲基，其中的R1’、R3’和R5’含有強(qiáng)供電子基團(tuán)或中等供電子基團(tuán)，或其組合。與N-取代2碳鏈烷基或芳基巰基的情況相同，強(qiáng)供電子基團(tuán)可加強(qiáng)3碳鏈烷基或芳基巰基對(duì)連接后裂解的靈敏度。因而可相應(yīng)地選擇特定的供電子基團(tuán)或其組合。
與N-取代2碳鏈化合物的情況相似，本發(fā)明的N-取代3碳鏈化合物可以將目的構(gòu)建體R1’和R5’位置上能夠用于取代的R1取代成巰基。在此，該供電子巰基也是與C1結(jié)合，而將其引入這些部位使得化合物能夠通過(guò)兩種途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)6元環(huán)形成性連接。此外還可以提高可用于與α-羧基硫酯反應(yīng)的巰基的局部濃度，并且在結(jié)構(gòu)局限性方面提供了可促進(jìn)連接的額外構(gòu)象。
本發(fā)明的N-端N-取代2或3碳鏈烷基或芳基硫代氨基酸可以按照，例如，方案I和方案II的描述并根據(jù)該領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)化學(xué)技術(shù)來(lái)加以合成。可參考，例如，“高等有機(jī)化學(xué)、反應(yīng)、機(jī)制和結(jié)構(gòu)”，第4版，J.March(Ed.)，John Wiley & Sons，New York，NY，1992；“有機(jī)轉(zhuǎn)換詳解功能基團(tuán)制備指南”，R.Larock(Ed.)，VCH Publishers，New York，NY，1989。其合成可以采用溶液合成法、聚合物支持合成法，或其組合。優(yōu)選的方法是采用Nα保護(hù)的、N-烷基化的、S-保護(hù)的氨基烷基或芳基硫代氨基酸前體。合成所使用的試劑可以從任意的公司購(gòu)買。此外，應(yīng)該充分了解的是，以試劑盒等形式提供的起始成分和多種中間體，如各種氨基酸衍生物，均可以保存以備后用。
在制備本發(fā)明的N-端Nα-取代2或3碳鏈烷基或芳基硫代氨基酸時(shí)，使用的是保護(hù)基團(tuán)策略。一般而言，用于多種合成策略的優(yōu)選保護(hù)基團(tuán)(PG)均適用于固相肽合成(“SPPS”)方法。在某些情況下還必須使用能夠在不同條件下被去除的正交保護(hù)基團(tuán)。這些保護(hù)基團(tuán)中有很多已為該領(lǐng)域所了解，并且可用于該目的(可參考，例如，“有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)”，第3版，T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Eds.，John Wiley & Sons，Inc.，1999；Nova Biochem Catalog 2000；“合成肽使用手冊(cè)”，G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman & Company，NewYork，NY，1992；“Advanced Chemtech組合有機(jī)化學(xué)與固相有機(jī)化學(xué)手冊(cè)”，W.D.Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhodes，and H.H.Saneii，Eds.，AdvancedChemtech，1998；“肽合成原理，第2版”，M.Bodanszky，Ed.，Springer-Yerlag，1993；“肽合成準(zhǔn)則，第2版”，M.Bodanszky andA.Bodanszky，Ed.，Springer-Yerlag，1994；以及“保護(hù)基團(tuán)”，P.J.Kocienski，Ed.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994)。實(shí)例包括芐氧基羰基(Z)、Boc、Bpoc、Trt、Nps、FmocCl-Z、Br-Z；NSC、MSC、Dde，等等。適用于硫基的保護(hù)基團(tuán)的實(shí)例包括，但不局限于，芐基、4-甲芐基、4-甲氧芐基、三苯甲基、ACM、TACAM、氧蒽基、二硫化衍生物、吡啶甲基，和苯甲酰甲基。
更具體地說(shuō)，可以按照方案I(固相制備Nα-取代前體)、方案II(液相制備Nα-取代前體)來(lái)制備Nα-取代2或3碳鏈烷基或芳基硫。方案I是利用標(biāo)準(zhǔn)的聚合物支持有機(jī)合成方法，直接將Nα-取代2或3碳鏈烷基或芳基硫組裝在固相上，而方案II是利用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)合方法將Nα-保護(hù)的、N-烷基化的、S-保護(hù)的氨基烷基或芳基硫代氨基酸前體結(jié)合在樹(shù)脂上。當(dāng)產(chǎn)生外消旋產(chǎn)物或非對(duì)映體產(chǎn)物時(shí)，可能先要利用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行分離，然后再用于擴(kuò)展的天然化學(xué)連接。
方案IECL輔助衍生分子的固相合成 X＝鹵素方案II α-羧基硫酯的產(chǎn)生可以按照該領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用化學(xué)或生物學(xué)方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如文中描述的方法，其中包括實(shí)施例中描述的方法。在化學(xué)合成方法中，α-羧基硫酯肽可以在溶液中合成，也可以在硫酯-生成樹(shù)脂上合成，這些技術(shù)是眾所周知的(可參考，例如，Dawson etal.，Science(1994)266776-779；Canne et al.，Tetrahedron Lett.(1995)361217-1220；Kent，et al.，WO96/34878；Kent，et al.，WO98/28434；Ingenito et al.，JACS(1999)121(49)11369-11374；and Hackeng et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)9610068-10073；Amiato et al.，同上)。舉例來(lái)說(shuō)，化學(xué)合成的硫酯肽可以用相應(yīng)的α-硫代酸肽來(lái)制備，而α-硫代酸肽可以在硫酯-樹(shù)脂上或在溶液中合成，但是優(yōu)選的是樹(shù)脂方法。肽-α-硫代酸可以被轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)應(yīng)的3-羧基-4-硝苯基硫酯、對(duì)應(yīng)的芐酯，或任何一種烷基硫酯。所有這些硫酯都提供適用于連接的保留基團(tuán)，使用3-羧基-4-硝苯基硫酯比使用相應(yīng)的芐酯的反應(yīng)速率略快，而芐酯的反應(yīng)性又比烷基硫酯更強(qiáng)。另一個(gè)例子，可以用三苯甲基交聯(lián)的巰基丙酸亮氨酸硫酯-生成樹(shù)脂來(lái)合成C-末端硫酯(Hackeng et al.，同上)。此外，還可以用3-羧基丙磺胺保險(xiǎn)栓連接物來(lái)實(shí)現(xiàn)C-末端硫酯的合成，其方法是，通過(guò)用重氮甲烷或碘甲基氰活化，然后用一種適當(dāng)巰基取代(Ingenito et al.，同上；Bertozzi et al.)。
此外，C-末端α-羧基硫酯肽也可以用生物學(xué)方法制備，如intein-介導(dǎo)的生物學(xué)技術(shù)(可參考，例如，Chong et al.，Gene(1997)192277-281；Chong et al.，Nucl.Acids Res.，(1998)265109-5115；Evans et al.，Protein Science(1998)72256-2264；and Cotton et al.，Chemistry & Biology(1999)6(9)247-256)。舉例來(lái)說(shuō)，可利用帶有或不帶有諸如親合標(biāo)簽等標(biāo)記物的intein表達(dá)系統(tǒng)，使用其蛋白-剪接元件的可誘導(dǎo)的自裂解活性來(lái)產(chǎn)生C-末端二硫蘇糖醇(DTT)酯肽或多肽片段。具體地說(shuō)，在DTT、β-巰基乙醇或半胱氨酸等巰醇存在條件下，intein可經(jīng)過(guò)特殊的自裂解過(guò)程，該過(guò)程產(chǎn)生一種帶有C-末端硫酯的肽段?？蓞⒖迹?，chong et al.，(1997)同上；chong et al.，(1998)同上；Evans et al.，同上；and Cotton et al.，同上。但是，當(dāng)使用一種重組產(chǎn)生的片段時(shí)，最終構(gòu)建體的化學(xué)合成部分通常會(huì)含有其加入的聚合物修飾。
將本發(fā)明的N-取代的2或3碳鏈烷基或芳基巰基成分與第一種羧基硫酯成分相連接，可產(chǎn)生一種在連接位點(diǎn)具有N-取代酰胺鍵的連接產(chǎn)物。選擇連接反應(yīng)的條件是為了維持硫酯與N-取代的2或3碳鏈烷基或芳基巰基部分的選擇反應(yīng)性。在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，上述連接反應(yīng)是在一種pH值為6-8的緩沖溶液中進(jìn)行的，并且其優(yōu)選的pH值范圍是6.5-7.5。該緩沖溶液可以是水性的、有機(jī)的或其混合物。此外，上述連接反應(yīng)還可以含有一種或多種催化劑和(或)一種或多種還原劑、脂類、洗滌劑、其他變性劑或增溶劑，等等。優(yōu)選的催化劑的實(shí)例是含有巰基和膦的基團(tuán)，如苯硫酚、芐基硫醇、TCEP和烷基膦。變性劑和(或)增溶劑的實(shí)例包括溶于水或TFE、HFIP、DMF、NMP等有機(jī)溶劑的胍鹽、尿素，混有水的乙腈，或含有胍鹽和尿素的水。此外，還可以用溫度來(lái)調(diào)節(jié)連接反應(yīng)的速率，常用溫度為5-55℃，并且優(yōu)選使用的溫度在15℃和40℃之間。舉例來(lái)說(shuō)，在pH為6.8-7.8時(shí)，在含有6M胍鹽和2％苯硫酚的反應(yīng)體系中可以很好地進(jìn)行連接。
對(duì)N-取代的2碳鏈烷基或芳基巰基而言，連接事件是由COSR硫酯成分和氨基烷基巰基成分之間的巰基交換引起的。這種交換產(chǎn)生一種硫酯連接的中間連接產(chǎn)物，該產(chǎn)物在自發(fā)重排后通過(guò)一種5元環(huán)中間體而產(chǎn)生通式為J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1(R1)-C2-SH)-CH(Z2)-J2的第一連接產(chǎn)物，該第一連接產(chǎn)物在連接位點(diǎn)上具有一種可去除的N-取代的2碳鏈烷基或芳基巰基[HS-C2-C1(R1)-]，其中的取代基如上文所定義。連接位點(diǎn)上的N-取代的2碳鏈烷基或芳基巰基[HS-C2-C1(R1)-]可以在肽相容條件下被去除，從而在連接位點(diǎn)上產(chǎn)生具有天然酰胺鍵的通式為J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2的最終連接產(chǎn)物。
對(duì)N-取代的3碳鏈烷基或芳基巰基而言，在COSR硫酯成分和氨基烷基巰基成分之間的巰基可產(chǎn)生一種硫酯連接的中間連接產(chǎn)物，該產(chǎn)物在自發(fā)重排后通過(guò)一種6元環(huán)中間體而產(chǎn)生通式為J1-HN-CH(Z1)-C(O)-Nα(C1-C2(R2)-C3(R3)-SH)-CH(Z2)-J2的第一連接產(chǎn)物，該第一連接產(chǎn)物在連接位點(diǎn)上具有一種可去除的N-取代的3碳鏈烷基或芳基巰基[HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-]。連接位點(diǎn)上的N-取代的3碳鏈烷基或芳基巰基[HS-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)]可以在肽相容條件下被去除，從而在連接位點(diǎn)上產(chǎn)生具有天然酰胺鍵的通式為J1-HN-CH(Z1)-CO-NH-CH(Z2)-CO-J2的最終連接產(chǎn)物。
優(yōu)選在酸性條件下進(jìn)行N-取代的烷基或芳基巰基的去除，以便促進(jìn)N-C1鍵的裂解，并在連接位點(diǎn)上形成一種穩(wěn)定的未取代的酰胺鍵?！半南嗳萘呀鈼l件”是指適合肽類的物理-化學(xué)條件，并且適于將烷基或芳基巰基部分從連接產(chǎn)物中去除的條件?？偟膩?lái)說(shuō)，根據(jù)所使用的α-取代化合物來(lái)選擇肽相容裂解條件，該條件可以通過(guò)常規(guī)的和眾所周知的方法容易地被推斷出(可參考，例如，“有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)”，第三版，T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Eds.，John Wiley& Sons，Inc.，1999；NovaBiochem Catalog 2000；“合成肽，用戶指南”，G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman & Company，New York，NY，1992；“Advanced Chemtech組合有機(jī)化學(xué)與固相有機(jī)化學(xué)手冊(cè)”，W.D.Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhoded，and H.H.Saneii，Eds.，Advanced Chemtech，1998；“肽合成原理，第二版”，M.Bodanszky，Ed.，Springer-Yerlag，1993；“肽合成準(zhǔn)則，第二版”，M.Bodanszky和A.Bodanszky，Eds.，Springer-Yerlag，1994；以及“保護(hù)基團(tuán)”，P.J.Kocienski，Ed.，Georg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994)。
舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)上述R1、R2或R3取代基含有一個(gè)甲氧基、羥基、巰基或甲硫基、甲基等基團(tuán)時(shí)，更普遍的去除方法涉及肽合成化學(xué)典型的酸裂解條件。該方法包括在含有或不含有還原劑和(或)清除劑系統(tǒng)(例如，諸如氟化氫(HF)、三氟乙酸(TFA)、三甲基磺酰氟乙酸(TMSFA)等酸)的強(qiáng)酸性或含水酸的條件下，進(jìn)行N-C1鍵的裂解。可以選擇更有效的酸裂解系統(tǒng)來(lái)優(yōu)化Nα-C1鍵的裂解，以去除給定構(gòu)建體上的烷基或芳基巰基部分。這些條件是眾所周知的，并有利于維持肽的完整性。此外，還可以加入巰基清除劑，特別是當(dāng)肽或多肽序列中存在色氨酸時(shí)，可以避免色氨酸側(cè)鏈與被釋放的芳基或烷基巰基部分發(fā)生反應(yīng)。巰基清除劑的實(shí)例包括乙二醇、半胱氨酸。B-巰基乙醇和硫代甲酚。
當(dāng)吡啶甲基基團(tuán)作為取代基時(shí)，其他專門的裂解條件包括光或還原性裂解條件。舉例來(lái)說(shuō)，當(dāng)上述R1、R2或R3取代基含有一個(gè)吡啶甲基時(shí)，可以按照標(biāo)準(zhǔn)的方法，利用光分解作用(例如，紫外光)、鋅/乙酸或電解還原作用來(lái)進(jìn)行裂解。當(dāng)N-取代的2碳鏈巰基的R1含有一個(gè)硫代甲烷基團(tuán)時(shí)，就可以利用汞或HF裂解作用。此外，當(dāng)?shù)谝环N或第二種連接成分含有其他保護(hù)基團(tuán)時(shí)，還可以使用上述裂解系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行固相支持物上的同時(shí)裂解，并且(或)可用作為一種去保護(hù)劑。
在本發(fā)明的一項(xiàng)實(shí)施方案中，在肽合成步驟中(特別是在自動(dòng)肽合成和正交連接策略及匯聚連接策略中)使用Nα-取代的2碳或3碳烷基或芳基巰基來(lái)正確地形成N-末端衍生的多肽，該多肽可被用作為擴(kuò)展的化學(xué)連接的底物以產(chǎn)生促紅細(xì)胞生成性合成蛋白。中性化合物包含一種全保護(hù)的、部分保護(hù)的或全未保護(hù)的酸穩(wěn)定性Nα-取代的2碳或3碳烷基或芳基巰基，其通式為(PG1)S-C2-C1(R1)-Nα(PG2)-CH(Z2)-C(O)-J2或(PG1)S-C3(R3)-C2(R2)-C1(R1)-Nα(PG2)-CH(Z2)-C(O)-J2，顯示在表III和表IV中。具體地說(shuō)，在Nα-取代的氨基烷基或芳基巰基轉(zhuǎn)變?yōu)镹α-取代的酰胺烷基或芳基巰基后，R1、R2和R3中的一個(gè)或多個(gè)含有一種與C1結(jié)合的供電子基團(tuán)，該基團(tuán)能在C1上形成一種在肽相容裂解條件下可以促進(jìn)Nα-C1鍵裂解的共振穩(wěn)定性陽(yáng)離子。PG1和PG2是可以單獨(dú)或共同存在的或者缺失的保護(hù)基團(tuán)，并且也可以相同或不同，其中的Z2是與化學(xué)肽合成或擴(kuò)展的天然化學(xué)連接相適合的任何化學(xué)基團(tuán)，并且其中的J2也是與化學(xué)肽合成或擴(kuò)展的天然化學(xué)連接相適合的任何化學(xué)基團(tuán)。PG1(或X1)是一種用以保護(hù)胺的基團(tuán)。PG2(或X2)是一種用以保護(hù)巰基的基團(tuán)。許多這類保護(hù)基團(tuán)都被了解并適用于該目的(可參考，例如，“有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)”，第三版，T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Eds.，John Wiley& Sons，Inc.，1999；NovaBiochem Catalog 2000；“合成肽，用戶指南”，G.A.Grant，Ed.，W.H.Freeman & Company，New York，NY，1992；“Advanced Chemtech組合有機(jī)化學(xué)與固相有機(jī)化學(xué)手冊(cè)”，W.D.Bennet，J.W.Christensen，L.K.Hamaker，M.L.Peterson，M.R.Rhoded，and H.H.Saneii，Eds.，Advanced Chemtech，1998；“肽合成原理，第二版”，M.Bodanszky，Ed.，Springer-Verlag，1993；“肽合成準(zhǔn)則，第二版”，M.Bodanszky和A.Bodanszky，Eds.，Springer-Verlag，1994；以及“保護(hù)基團(tuán)”，P.J.Kocienski，Ed.，Geerg Thieme Verlag，Stuttgart，Germany，1994)。
表III 優(yōu)選的PG1和X1保護(hù)基團(tuán)的實(shí)例包括，但不局限于，Boc(t-丁基氨基甲酸酯)、Troc(2，2，2-三氯乙基氨基甲酸酯)、Fmoc(9-芴甲基氨基甲酸酯)、溴-Z或氯-Z(溴-或氯-芐基甲酸酯)、Dde(4，4-二甲基-2，6-dioxocycloexl-ylidene)、MsZ(4-甲基亞磺?；?甲酸酯)、Msc(2-甲基硫乙基甲酸酯)、Nsc(4-硝基苯基磺?；?乙氧甲酸酯)。優(yōu)選的PG1和X1保護(hù)基團(tuán)選自“有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)”，Greene and Wuts，第三版，Wiley-Interscience，(1999)，而最優(yōu)選的是Fmoc和Nsc。優(yōu)選的PG2保護(hù)基團(tuán)包括，但不局限于，Acm(乙酰氨基甲基)、MeoBzl或Mob(對(duì)-甲氧基芐基)、Meb(對(duì)-甲基芐基)、Trt(三苯甲基)、Xan(噸基)、tButhio(s-t-丁基)、Mmt(對(duì)-甲氧三苯甲基)、2或4吡啶甲基(2或4吡啶基)、Fm(9-芴甲基)、tbut(t-丁基)、Tacam(三甲基乙酰氨基甲基)。優(yōu)選的PC2和X2保護(hù)基團(tuán)選自“有機(jī)合成中的保護(hù)基團(tuán)”，Greene and Wuts，第三版，Wiley-Interscience，(1999)，，并且最優(yōu)選的是Acm、Mob、MeB、Picolyl。
表IV 可以按照上文的方案I和方案II來(lái)制備本發(fā)明的Nα-取代的2碳或3碳鏈烷基或芳基巰基的保護(hù)形式。
本發(fā)明所述化合物的產(chǎn)生可采用多種不同的方法，其中包括鹵素介導(dǎo)的氨基烷化作用、還原性氨化作用，并且還可以通過(guò)制備與固相氨基酸合成方法相適應(yīng)的Nα-保護(hù)的、N-烷化的、S-保護(hù)的、氨基烷基或芳基硫代氨基酸前體來(lái)產(chǎn)生。如果需要，還可利用標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)外消旋產(chǎn)物或非對(duì)映體產(chǎn)物進(jìn)行分離，以使化合物的手性純度達(dá)到可接受的程度。
III.本發(fā)明優(yōu)選的水溶性聚合物的合成和產(chǎn)生文中所用的術(shù)語(yǔ)“分子異質(zhì)性”是指蛋白制劑中的每一種蛋白所聯(lián)接的聚合物分子數(shù)量不同。術(shù)語(yǔ)“分子多樣性”是指(a)被聚合物修飾的蛋白位點(diǎn)不同，(b)蛋白制劑中相同蛋白的不同位點(diǎn)上或不同蛋白的相同位點(diǎn)上的加合聚合物的長(zhǎng)度不同，或者(c)蛋白制劑中相同蛋白的不同位點(diǎn)上或不同蛋白的相同位點(diǎn)上的加合聚合物的所有分支程度和(或)性質(zhì)不同。文中所用的術(shù)語(yǔ)“分子均一性”是指蛋白制劑中的所有蛋白分子在相同位置上含有相同的氨基酸序列和相同的聚合物修飾。兩種或多種“分子均一性”蛋白制劑的混合物在文中被稱為“分子性明確的”制劑。
根據(jù)本發(fā)明的這個(gè)方面，上述聚合物異質(zhì)性、多樣性和不適應(yīng)性問(wèn)題的解決方法涉及產(chǎn)生一類新的生物相容性聚合物，該聚合物結(jié)合了多肽(長(zhǎng)度明確、便于合成)和“pPEG”(“精確型PEG”，一種具有柔性、兩親性并且無(wú)免疫原性的不易受蛋白酶作用的聚合物)的優(yōu)勢(shì)，Rose，K.et al.(美國(guó)專利申請(qǐng)系列09/379,297，在此引入作為參考)。這種新型生物相容性聚合物的通式為-[CO-X-CO-NH-Y-NH]n-n為一個(gè)整數(shù)，優(yōu)選的是1-100的整數(shù)，更優(yōu)選的是2-100的整數(shù)，其中的X和Y是通過(guò)酰胺鍵相連接的具有明確結(jié)構(gòu)的生物相容性重復(fù)元件。優(yōu)選的是X和Y均為不含活性功能基團(tuán)的二價(jià)有機(jī)基，或是二者均缺失，X和Y可以相同或不同，并且各自的重復(fù)單元(n)可以獨(dú)立變化。優(yōu)選的是，當(dāng)n＝2時(shí)，X和Y中的至少一種選自取代的、未取代的、分支型和線型的脂肪族基團(tuán)和芳香族基團(tuán)。更優(yōu)選的是，X和Y之一選自苯基、C1-C10烯基、C1-C10烷基、含有雜原子的苯基、含有雜原子的C1-C10烯基、含有雜原子的C1-C10烷基，及其組合。
特別優(yōu)選的pPEG基團(tuán)具有如下通式-{CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH}n-
其中，優(yōu)選的是n為1-100，更優(yōu)選的為2-100；-{CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)6-NH-CO-(CH2)2-CO-NH-(CH2)3-(OCH2CH2)3-CH2-NH-}n-，其中，優(yōu)選的是n為1-50，更優(yōu)選的為2-50。
上述pPEG基團(tuán)可通過(guò)多種方法中的任一種來(lái)合成。但這些基團(tuán)的優(yōu)選產(chǎn)生方法是多單元固相逐級(jí)鏈組裝法，而不是聚合方法。利用這種組裝方法可以使制劑的基團(tuán)具有明確而均一的結(jié)構(gòu)，例如其長(zhǎng)度、X和Y取代基的性質(zhì)、分支點(diǎn)位置(如果存在)，以及所有分支的長(zhǎng)度、X和Y取代基和位置。
優(yōu)選的是通過(guò)如下步驟來(lái)合成該基團(tuán)(a)用一種摩爾數(shù)過(guò)量的通式為HOOC-X-COOH的二價(jià)酸衍生物將通式為Z-Q-支持物的化合物的氨基或羥基?；渲衂是H2N-或HO-；Q是一種連接物或一種靶分子；支持物是一種固相基質(zhì)或表面；(b)活化步驟(a)的產(chǎn)物上的自由羧基；(c)用一種摩爾數(shù)過(guò)量的通式為NH2-Y-NH2的二元胺將步驟(b)的產(chǎn)物氨化；以及(d)用HOOC-X-COOH和NH2-Y-NH2選擇性地重復(fù)步驟(a)-(c)，其中該X和Y是缺失的，或是相同或不同的二價(jià)有機(jī)基，并且其變化與每個(gè)上述選擇性重復(fù)單元無(wú)關(guān)，并且可以與前面的?；桶被襟E中所用的取代基X和Y相同或不同。
在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用的是6個(gè)、12個(gè)、18個(gè)和32個(gè)上述重復(fù)單元。如果需要，也可以將重復(fù)單元與，例如，賴氨酸的氨基協(xié)同使用，從而形成分支型pPEG結(jié)構(gòu)?？梢杂枚喾N化學(xué)物將pPEG聯(lián)接于本發(fā)明的合成蛋白，其中包括形成硫醚鍵、肟鍵和酰胺鍵。
在一項(xiàng)實(shí)施方案中，多個(gè)單元的逐級(jí)固相鏈組裝方法包括第1步使保護(hù)的或未保護(hù)的二元酸與樹(shù)脂上的氨基結(jié)合，從而在連接位點(diǎn)產(chǎn)生酰胺鍵(其中PG是一種保護(hù)基團(tuán)，該基團(tuán)可以存在或不存在，這取決于所用的二元酸)PG-OOC-X-COOH+NH2-Y-NH-樹(shù)脂第2步如果保護(hù)基團(tuán)(PG)存在，則去除樹(shù)脂上的保護(hù)基團(tuán)HOOC-X-CO-NH-Y-NH-樹(shù)脂第3步使保護(hù)的或未保護(hù)的二元胺與樹(shù)脂上的羧基結(jié)合，從而在連接位點(diǎn)產(chǎn)生酰胺鍵(其中PG可以存在或不存在，這取決于所使用的二元胺)PG-NH-Y-NH+HOOC-X-CO-NH-Y-NH-樹(shù)脂第4步如果保護(hù)基團(tuán)(PG)存在，則去除樹(shù)脂上的保護(hù)基團(tuán)-NH-Y-NH-OC-X-CO-NH-Y-NH-樹(shù)脂第5步將步驟1-4重復(fù)“n”次，以添加“n”個(gè)單元，然后從樹(shù)脂上裂解-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-[CO-X-CO-NH-Y-NH]-如上所述，用于與本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白相聯(lián)接的優(yōu)選水溶性聚合物為線型和分支型pPEG構(gòu)建體。使用的pPEG可含有懸垂基團(tuán)，這些基團(tuán)在生理?xiàng)l件下可帶有電荷或呈中性，并且可根據(jù)所用pPEG的結(jié)構(gòu)而具有不同的化學(xué)聯(lián)接性質(zhì)、長(zhǎng)度、分支和溶解度。如上所述，本發(fā)明的優(yōu)選pPEGs包括一種含有-CO-X-CO-NH-Y-NH-重復(fù)單元的水溶性聚酰胺，其中，X與Y之一或二者都含有水溶性重復(fù)單元，最優(yōu)選的是“PEG”型重復(fù)單元。原則上還可以用簡(jiǎn)單的兩步固相法來(lái)獲得寡聚脲，以氨基樹(shù)脂NH2-樹(shù)脂，和對(duì)稱型二胺NH2-Y-NH2為例的方法如下所示用羰基二咪唑進(jìn)行活化→im-CO-NH-樹(shù)脂用二胺NH2-Y-NH2進(jìn)行氨解→NH2-Y-NH-CO-NH-樹(shù)脂其中，這兩個(gè)步驟可以重復(fù)多次，以產(chǎn)生具有-NH-Y-NH-CO-重復(fù)單元的寡聚脲，但該方法的優(yōu)選程度較低。原因是上述步驟在室溫下的產(chǎn)量不確定，甚至使用高度過(guò)量的試劑和很長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間也是如此。因此，優(yōu)選的是用三步固相法來(lái)懸垂聚酰胺，以氨基樹(shù)脂NH2-樹(shù)脂為例的方法如下所示。為避免產(chǎn)生同質(zhì)異構(gòu)產(chǎn)物，試劑HO2C-X-CO2H和NH2-Y-NH2應(yīng)該對(duì)稱。
用二元酸HO2C-X-CO2H進(jìn)行?；鶫O-CO-X-CO-NH-樹(shù)脂羰基二咪唑進(jìn)行活化→im-CO-OCO-X-CO-NH-樹(shù)脂用二胺NH2-Y-NH2進(jìn)行氨解→NH2-Y-NH-CO-X-CO-NH-樹(shù)脂這三個(gè)步驟可按順序重復(fù)多次，以產(chǎn)生具有-NH-Y-NH-CO-X-CO-重復(fù)單元的聚酰胺。該聚合物可含有精確數(shù)量的單體單元，每一步的X和Y可各自不同，并且末端基團(tuán)可任意選擇。例如，在?；襟E中使用琥珀酸酐(“Succ”)并在氨解步驟中使用4，7，10-三氧-1，13-十三烷二胺可以產(chǎn)生X為-CH2CH2-、Y為-NH-CH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2-NH-、重復(fù)單元為-NH-CH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2-NH-COCH2CH2CO-的“PEG”型聚酰胺。盡管該方法涉及不含保護(hù)基團(tuán)的二價(jià)試劑，但除了如下所示的用分支型Lys核心制備分支型構(gòu)建體的情況之外，使用標(biāo)準(zhǔn)的商品化肽合成樹(shù)脂不會(huì)產(chǎn)生交聯(lián)的問(wèn)題(Rose et al.，(美國(guó)專利申請(qǐng)系列09/379,297)；和Rose et al.，J.Am.Chem.Soc.(1999)1217034)。
舉例來(lái)說(shuō)，分支型pPEG構(gòu)建體的制備方法與Rose et al.，(美國(guó)專利系列09/379,297)和Rose，K.and Vizzavona，J.(J.Am.Chem.Soc.(1999)1217034)中描述的“化學(xué)體”構(gòu)建體的制備方法類似。因此，可以將分支型pPEG構(gòu)建體制備成含有一種分支核心，如賴氨酸分支核心，該核心通過(guò)肟鍵與-(COCH2CH2CO-NH-CH2CH2CH2-(OCH2CH2)3-CH2-NH)n-等優(yōu)選水溶性聚酰胺相結(jié)合。例如，在聚酰胺另一末端的Lys側(cè)鏈上的氨氧乙?；梢院苋菀椎嘏c四聚核心(O＝CHCO)4Lys2Lys-等賴氨酸核心上的乙醛?；纬呻挎I。因此，每個(gè)賴氨酸分支點(diǎn)的肟鍵都可以具有-Lys(COCH2ON＝CHCO-)酰胺-的結(jié)構(gòu)。備選結(jié)構(gòu)是在聚酰胺與聚酰胺游離懸垂基團(tuán)之間形成肟鍵，優(yōu)選的是使用單保護(hù)二氨，并在聚酰胺結(jié)合后進(jìn)行去保護(hù)，從而產(chǎn)生如下所示的四價(jià)分支結(jié)構(gòu)[O＝CHCO-(NH-CH2CH2CH2-[OCH2CH2]3-CH2-NH-COGH2CH2CO-)n]4Lys2Lys-肟類化學(xué)物可用于制備二聚和四聚分支構(gòu)建體，而且還適用于八聚分支構(gòu)建體的組裝(Rose，K.，J.Am.Chem.Soc.(1994)11630；Rose，K.et al.，Bioconj.Chem.(1996)7552)。當(dāng)使用上述pPEG聚酰胺時(shí)，當(dāng)然也可以將其他的化學(xué)反應(yīng)用于該目的(可參考，例如，圖13)。此外，可以將聚酰胺形成結(jié)合到用于肽合成的合成方案中，該方案包括Boc或Fmoc化學(xué)，但是，當(dāng)執(zhí)行該方案時(shí)，應(yīng)牢記氨解步驟會(huì)去除Fmoc基團(tuán)，并且如果使用Boc化學(xué)物，還將會(huì)去除吲哚的甲?；Ｗo(hù)。
因此，上述pPEGs可具有不同的分支核心(如賴氨酸分支核心等)，這些分支核心可通過(guò)選定的鍵(如酰胺鍵、硫酯鍵、肟鍵，等等)與線型水溶性聚酰胺(如-(Succ-TTD)n-等)相連接，其中，每個(gè)線型水溶性聚酰胺的每個(gè)游離末端上都可以添加特定的懸垂基團(tuán)(如羧酸酯、氨基、酰胺等)以提供所需的電荷。此外，本發(fā)明的線型和分支型pPEGs還可含有一種特異的功能基團(tuán)，用于與帶有一個(gè)或多個(gè)可彼此反應(yīng)的特異功能基團(tuán)的合成蛋白相聯(lián)接，而優(yōu)選的是，pPEGs的懸垂基團(tuán)不具有抗原性(可參考，例如，圖13)。
在一項(xiàng)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白是被分子組成均一的擬糖水溶性聚合物所修飾，該聚合物具有通式U-s1-B-s2-Polymer-s3-J*其中，U是一種具有特定功能基團(tuán)的殘基，B是一種具有三個(gè)或三個(gè)以上相同或不同臂的分支核心，該核心可以存在，也可以不存在，Polymer是一種分子量大于約5,000Da的具有通式-[C(O)-X-C(O)-NH-Y-NH]n-或-[NH-Y-NH-C(O)-X-C(O)]n-的聚酰胺，其中的X和Y為相同或不同的分支型或線型二價(jià)基團(tuán)，n是2-50的離散整數(shù)，并且X和Y之一或二者都含有一種基本不具有抗原性的線型或分支型水溶性重復(fù)單元，J*是一種含有懸垂基團(tuán)的殘基，其中的懸垂基團(tuán)基本不具有抗原性，并且在生理?xiàng)l件下的凈電荷選自負(fù)值、正值和中性值，而s1、s2和s3是相同或不同的間隔物或連接物，這些間隔物或連接物可以分別存在或缺失。上述聚合物包括美國(guó)專利申請(qǐng)系列60/236,377中的聚合物，其內(nèi)容在此完整引入作為參考。通式U-s1-B-s2-Polymer-s3-J*也可表示為U-B-Polymer-J*，其中的間隔基團(tuán)或連接基團(tuán)s1、s2、s3可以存在，也可以不存在。
本發(fā)明優(yōu)選的擬糖聚合物的優(yōu)選形成方法如圖5-7所示。圖5A-5B描述一種固相方法，用于產(chǎn)生本發(fā)明所述水溶性聚合物U-B-Polymer-J*的分支核心(B)和單一化學(xué)選擇性功能基團(tuán)(U)。該方法可以在溶液中進(jìn)行，但優(yōu)選的是如圖所示的固相法。具體地說(shuō)，圖5A顯示帶有活性基團(tuán)( )的被正交保護(hù)的U-B前體，該構(gòu)建體的基本幾何結(jié)構(gòu)用鍵連接的圓點(diǎn)來(lái)表示( )，這種基本幾何結(jié)構(gòu)并不是要限制所用化學(xué)鍵或基團(tuán)的類型，而只用于說(shuō)明組合結(jié)構(gòu)的幾何關(guān)系，以及適合于產(chǎn)生本發(fā)明所述U-B基團(tuán)的化學(xué)細(xì)節(jié)。將一種含有適當(dāng)?shù)目闪呀膺B接物和互反應(yīng)性基團(tuán)( )的聚合體支持物/樹(shù)脂活化，使其能夠與U-B前體共價(jià)連接，然后使其與正交保護(hù)的U-B前體相結(jié)合 該系統(tǒng)采用了聚合體支持物有機(jī)化學(xué)的原理。結(jié)合之后，按照?qǐng)D示對(duì)分支核心進(jìn)行處理(只顯示了一個(gè)分支點(diǎn)，其他分支點(diǎn)可以存在，也可以不存在)，使其適于隨后聯(lián)接所需的Polymer組分，如基本不具有抗原性的水溶性線型聚合物。此外還對(duì)U基團(tuán)進(jìn)行了說(shuō)明，U基團(tuán)可作為被正交保護(hù)的U-B前體的一部分在合成開(kāi)始時(shí)提供，也可以在分支核心B的處理過(guò)程中或之后再產(chǎn)生。盡管Polymer組分的聯(lián)接可以在樹(shù)脂上進(jìn)行，也就是在裂解之前進(jìn)行，但優(yōu)選的方法是將U-B部分從聚合體支持物/樹(shù)脂上裂解，以產(chǎn)生U-B核心，然后將其純化，并隨后用于Polymer組分的聯(lián)接。
如圖所示，核心基團(tuán)B的懸垂分支點(diǎn)上可含有相同或不同的功能基團(tuán)(Func)，這些基團(tuán)可以被可逆地保護(hù)(PG、PG’或PG”)，也可以不保護(hù)。在所有情況下，最終的Polymer組分聯(lián)接步驟都涉及在懸垂分支點(diǎn)上產(chǎn)生一種功能基團(tuán)(Func)，并產(chǎn)生U基團(tuán)(參考圖7)。圖5B描述了一種替代方法，該方法是將被保護(hù)的U-B前體與一種帶有連接物的聚合體支持物結(jié)合使用，當(dāng)連接物被裂解，即可產(chǎn)生所需的被保護(hù)或未保護(hù)的U-基團(tuán)。圖5B還描述了組裝前分支核心B與聚合體支持物的聯(lián)接方法，以及利用可產(chǎn)生U-基團(tuán)的樹(shù)脂來(lái)制備U-B基團(tuán)的方法，該U-B基團(tuán)可隨后用于聯(lián)接Polymer組分。
圖6A-6D描述一種固相方法，用于產(chǎn)生本發(fā)明優(yōu)選的基本不具有抗原性的水溶性聚酰胺Polymer-J*組分，該組分可隨后用于聯(lián)接U-B核心。盡管圖中描述的固相法是優(yōu)選的方法，但也可以采用液相法來(lái)獲得相同的最終結(jié)果。在圖6A和6B中，利用固相有機(jī)化學(xué)原理使二元酸與二元胺單元相結(jié)合。還可以選擇性地引入被保護(hù)的氨基-X’-酸和(或)氨基-Y’-酸單元，用于為具有符合通式-[NH-Y-NHCO-X-CO]-的聚酰胺結(jié)構(gòu)的最終裂解產(chǎn)物中的X和Y基團(tuán)提供額外的變化。圖6A描述N-端至C-端方向的合成方法，圖6B則描述C-端至N-端方向的合成方法。在圖6C和6D中，利用固相有機(jī)化學(xué)原理使氨基-X’-酸和(或)氨基-Y’-酸單元相結(jié)合。圖6C描述N-端至C-端方向的合成方法，圖6D則描述C-端至N-端方向的合成方法。由圖6A-6D可知，可以根據(jù)合成反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)來(lái)精確地控制聚酰胺終產(chǎn)物的性質(zhì)。此外，懸垂基團(tuán)J*的構(gòu)建幾乎可以按任何自定標(biāo)準(zhǔn)來(lái)進(jìn)行。在使用單分散性重復(fù)單元X、Y、X’和Y’的條件下，聚酰胺終產(chǎn)物的準(zhǔn)確分子量可以被精確地控制。
圖7描述一種優(yōu)選的方法，用于使U-B組分與Polymer-J*組分結(jié)合，以產(chǎn)生本發(fā)明優(yōu)選的具有通式U-B-Polymer-J*的聚合物合成構(gòu)成體。如圖所示，提供的保護(hù)基團(tuán)可以多種多樣，并且可根據(jù)特定構(gòu)建體的最終預(yù)期用途來(lái)任意選擇不同的保護(hù)基團(tuán)。此外還描述了用于產(chǎn)生所需U-B-Polymer-J*構(gòu)建體的不同途徑，其中包括固相法和液相法。
如上所述，優(yōu)選的水溶性重復(fù)單元包括聚環(huán)氧烷、聚酰胺環(huán)氧烷，或其衍生物。最優(yōu)選的水溶性重復(fù)單元包括通式-(CH2-CH2-O)-或-(CH2-CH2-O)-的環(huán)氧乙烷。這些水溶性重復(fù)單元的數(shù)量可以有很大不同，但更優(yōu)選的數(shù)量為2-500、2-400、2-300、2-200、2-100、2-50，更優(yōu)選的是2-32，最優(yōu)選的是3-8。更優(yōu)選的實(shí)施方案的實(shí)例為，其中的X和Y之一或二者都選自-((CH2)n1-(CH2-CH2-O)n2-(CH2)n1-)-或-((CH2)n1-(O-CH2-CH2)n2-(CH2)n1-)，其中，n1為1-6、1-5、1-4，最優(yōu)選的是1-3，而n2為2-50、2-25、2-15、2-10、2-8，最優(yōu)選的是2-5。高度優(yōu)選的實(shí)施方案的實(shí)例為，其中的X為-(CH2-CH2)-，而Y為-(CH2-(CH2-CH2-O)3-CH2-CH2-CH2)-或-(CH2-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-CH2)-。再更優(yōu)選的是單分散性組合物，其中的每個(gè)n均為離散整數(shù)。在一項(xiàng)高度優(yōu)選的實(shí)施方案中，X為-(CH2-CH2)-，Y為-(CH2-(CH2-CH2-O)3-CH2-CH2-CH2)n-或-(CH2-CH2-CH2-(O-CH2-CH2)3-CH2)-n，其中的n為12-36。
具體地說(shuō)，當(dāng)水溶性聚合物包含的聚合物鏈中帶有環(huán)氧乙烷重復(fù)單元等聚環(huán)氧烷重復(fù)單元時(shí)，優(yōu)選的是Polymer的每條鏈的原子分子量都約為1,500-42,000Da，最優(yōu)選的則約為2,000-20,000Da。
優(yōu)選的U基團(tuán)含有一種能夠進(jìn)行化學(xué)連接的部分。優(yōu)選的聚合物是分支型聚合物，其中的基團(tuán)B含有三個(gè)或三個(gè)以上的臂。優(yōu)選的組分J*含有一種在生理?xiàng)l件下可電離的基團(tuán)，最優(yōu)選的是帶有負(fù)電荷。U和J之一或二者都可含有一種保護(hù)基團(tuán)，該基團(tuán)能夠在不破壞構(gòu)建體完整性的情況下被去除。
優(yōu)選的間隔物或連接物包括含有一種或多種用于水溶性聚合物的重復(fù)單元、二元胺和(或)二元酸單元、天然或非天然氨基酸或其衍生物的線型或分支型基團(tuán)，以及脂肪族基團(tuán)，其中包括烷基、芳基、雜烷基、雜芳基、烷氧基等，優(yōu)選的是這些基團(tuán)含有多達(dá)18個(gè)碳原子，甚至含有額外的聚合物鏈。
如上所述，組分U是含有一種功能基團(tuán)的殘基，該功能基團(tuán)能夠與靶分子或被靶分子結(jié)合，如肽或多肽或其他所需表面。當(dāng)U是含有一種用于連接靶分子的功能基團(tuán)的殘基時(shí)，U可含有一種親核基團(tuán)或親電子基團(tuán)，而靶分子可相應(yīng)地含有一種可彼此反應(yīng)的親電子基團(tuán)或親核基團(tuán)。
已知有多種可彼此反應(yīng)的上述功能基團(tuán)能夠與肽和多肽的常見(jiàn)側(cè)鏈功能基團(tuán)或衍生的側(cè)鏈功能基團(tuán)相聯(lián)接(Zalipsky et al.，Bioconjugate Chemistry(1995)6150-165；“生物共軛化學(xué)展望”，C.F.Meares，Ed.，ACS，1933；“蛋白接合與交聯(lián)化學(xué)”，S.S.Wong，Ed.，CRC Press，Inc.(1993))。功能基團(tuán)的實(shí)例包括能夠與氨基反應(yīng)的基團(tuán)，如(a)羧酸酯，如對(duì)-硝基苯基，或琥珀酰亞胺；(b)羰基咪唑；(c)吖內(nèi)酯；(d)環(huán)酰亞胺硫酮；以及(e)異氰酸酯或異硫氰酸酯。能夠與羧酸基團(tuán)和活性羧基反應(yīng)的功能基團(tuán)的實(shí)例包括(a)伯胺；或(b)肼和酰肼功能基團(tuán)，如酰基酰肼、肼基甲酸酯、半氨基甲酸酯、硫代肼基甲酸酯、氨氧基，等等。能夠與巰基或硫氫基反應(yīng)的功能基團(tuán)包括苯乙二醛、馬來(lái)酰亞胺和鹵素。能與諸如(羧)酸等羥基反應(yīng)的功能基團(tuán)或能夠與親電子中心反應(yīng)的其他親核基團(tuán)的實(shí)例包括羥基、氨基、羧基、巰基、活性次甲基，等等。
舉例來(lái)說(shuō)，上述聚合物可以帶有組分U，該組分U作為與靶分子連接的功能基團(tuán)，其中的功能基團(tuán)是丙烯酸酯、醛、酮、氨氧基、胺、羧酸、酯、硫酯、鹵素、巰基、氰乙酸酯、二棕櫚?；⒘柞ヵＲ掖及?、二硬酯酰磷酯酰乙醇胺、環(huán)氧化物、酰肼、疊氮化物、異氰酸酯、馬來(lái)酰亞胺、甲基丙烯酸酯、硝基苯羧酸酯、正二硫吡啶、硅烷、巰基、乙烯砜、琥珀酰亞胺戊二酸、琥珀酰亞胺琥珀酸酯、琥珀酸、tresylate，等等。此外，還可以提供可活化形式的U，例如，可以將羧酸轉(zhuǎn)變?yōu)槟芘c胺等親核試劑反應(yīng)的活性酯。
在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，U是一種具有能與靶分子上特異功能基團(tuán)選擇性地反應(yīng)的特異功能基團(tuán)的殘基。本發(fā)明的該方面包括如上文第II節(jié)中描述的肽合成的原理(保護(hù)基團(tuán)策略)和化學(xué)連接(部分保護(hù)或無(wú)保護(hù)基團(tuán)策略)。因此，U可以代表各種保護(hù)基團(tuán)，如上文描述的那些內(nèi)容。優(yōu)選的U基團(tuán)應(yīng)適用于胺捕獲策略(例如，通過(guò)半胺形成、亞胺形成和Michael加成反應(yīng)而連接)、巰基捕獲策略(例如通過(guò)硫醇鹽形成、二硫化物交換而連接)、天然化學(xué)連接策略(例如通過(guò)硫酯交換，其中包括側(cè)鏈含有半胱氨酸或巰基的氨基酸衍生物)，以及正交連接耦聯(lián)策略(例如通過(guò)噻唑烷形成、硫酯交換、硫酯形成、二硫化物交換和胺形成而連接)(可參考，例如，Coltart，DM.，Tetrahedron(2000)563449-3491)。特別優(yōu)選的U含有一種具有特異功能基團(tuán)的殘基，該功能基團(tuán)可用于如上文第II節(jié)中描述的水相容性化學(xué)連接化學(xué)反應(yīng)中。因此，U可以是一種能形成鍵的功能基團(tuán)，這些鍵選自羧酸酯、酯、尿烷、硫酯、醚、噻唑烷、腙、惡唑烷等。最優(yōu)選的鍵是肟鍵和酰胺鍵。
如上所述，B是一種具有三個(gè)或三個(gè)以上臂的分支核心部分，并且既可以存在也可以缺失。當(dāng)B存在時(shí)，其一個(gè)臂與U連接，或通過(guò)間隔物或連接物與U相連，并且其他的所有臂都與Polymer連接，或通過(guò)間隔物或連接物與Polymer連接。分支核心B的實(shí)例包括，但不局限于，氨基、酰胺、羧基及其組合。其中包括由賴氨酸等形成的寡酰胺，或由烷二胺和丙烯酸形成的寡聚物(“聚氨基胺”)，后者在分支核心中提供凈正電荷。(可參考，例如，Zeng et al.，J.Pept.Sci.(1996)266-72；Rose et al.，Bioconjugate Chem.，(1996)7(5)552-556；NovoBiochem目錄和肽合成手冊(cè)，Laufelfingen，2001；Wells et al.，Biopolymers(1998)47381-396；Mahajan etal.，(1999)404909-4912；Judson et al.(1998)391299-1302；Swali et al.，(1997)624902-4903；美國(guó)專利5,932,462、5,919,455、5,643,575、5,681,567)。也可以使用其他多種不同的適用于該目的的分支核心，其中包括取代二胺、取代二元酸、諸如甘油等烷酸，以及具有三個(gè)或三個(gè)以上功能基團(tuán)或可活化基團(tuán)的其他部分，這些基團(tuán)包括多價(jià)烷基、芳基、雜烷基、雜芳基、烷氧基，等等，以及寡聚糖(如Nierengarten et al.，Tetrahedron Lett.(1999)405681-5684；Matthews et al.，Prog.Polym.Sci.(1998)1-56；Suner et al.，Macromolecules(2000)33253；Fischer et al.，Angew.Chem.Int.Ed.(1999)38884；Sunder et al.，Adv.Mater.(2000)12235；Mulders et al.，Tetrahedron Lett.(1997)38631-634；Mulders et al.，Tetrahedron Lett.(1997)3830-3088；和Turnbull et al.，Chembiocehm(2000)1(1)70-74)。最優(yōu)選的是分支核心通過(guò)酰胺鍵與Polymer組分相連接。
優(yōu)選的分支核心選自氨基官能團(tuán)、羧基官能團(tuán)或氨基與羧基組合的官能團(tuán)。優(yōu)選分支核心的實(shí)例分別為賴氨酸氨基核心、天冬氨酸或谷氨酸分支核心，以及γ-谷氨酸分支核心。此外，優(yōu)選的分支型聚合物構(gòu)建體的分支選自寡聚酰胺或聚氨基胺核心等單一分支核心。但也可以使用其他類型的分支型構(gòu)建體，如蠕蟲(chóng)樣結(jié)構(gòu)，其分支選自沿聚合物骨架分布的多分支核心序列(Schlüter et al.，Chem.Int.Ed.(2000)39864)。根據(jù)聚合物骨架和重復(fù)單元的化學(xué)組成和(或)體積，可以將蠕蟲(chóng)樣結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)成水溶性或傾向于誘導(dǎo)液晶結(jié)構(gòu)(Oualiet al.，Macromolucules(2000)336185)，從而有利于其遞送應(yīng)用性、穩(wěn)定性和作用持久性。與本發(fā)明的其他分支型聚合物構(gòu)建體相同，蠕蟲(chóng)樣構(gòu)建體可包含一種懸垂的含有U的功能基團(tuán)。
如上文第I節(jié)所述，Polymer組分或一種或多種間隔物或連接物可帶有一些生物穩(wěn)定的或可生物降解的聚合物鏈或中間連接物或鍵。此外，如上文第I節(jié)所述，組分J*是一種含有懸垂基團(tuán)的殘基，該基團(tuán)在生理?xiàng)l件下的凈電荷選自負(fù)值、正值和中性值。最優(yōu)選的是，J*含有一種可電離的羧酸酯基團(tuán)，并且在生理?xiàng)l件下的凈電荷為負(fù)值。如第I節(jié)所述，組分s1、s2和s3是相同或不同的間隔物或連接物，這些組分可以分別存在或缺失。最優(yōu)選的間隔物或連接物包括一種聚合物鏈，其中的間隔物或連接物含有一個(gè)或多個(gè)具有通式-[CO-X-CO-NH-Y-NH]n-的重復(fù)單元。
IV.藥劑學(xué)本發(fā)明的聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白可以作為藥學(xué)制劑使用，以實(shí)現(xiàn)治療疾病和病情的目的。因此，在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供藥用組合物，包括一種本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白或其藥學(xué)容許性鹽類。這種藥用組合物可以包含一種或多種賦形劑。優(yōu)選的賦形劑選自緩沖液、載體蛋白、氨基酸、去污劑、脂質(zhì)體、水溶性聚合物和防腐劑。此外，除了促紅細(xì)胞生成性合成蛋白之外，該藥用制劑還可包含一種或多種額外的藥用活性成分，例如一種或多種額外的生物活性劑(例如，有機(jī)小分子、其他蛋白治療劑，等等)。這種藥用組合物可在本發(fā)明的優(yōu)選方法中使用。這些方法包括，提高哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞產(chǎn)量、紅細(xì)胞比容、血紅蛋白和網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)的方法。這些方法的步驟包括，將本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白以有效的劑量給藥于哺乳動(dòng)物，以觀測(cè)所需療效。
當(dāng)給藥于需要治療的病人或個(gè)體時(shí)，最優(yōu)選的是用藥物遞送系統(tǒng)將該促紅細(xì)胞生成性合成多肽和(或)蛋白進(jìn)行給藥。利用該系統(tǒng)可以將藥物提供給患者，其提供方式可以使藥物被患者接受，并且可提高所需生物活性的效力。就本發(fā)明而言，優(yōu)選的藥物遞送系統(tǒng)包括可通過(guò)口、鼻、或吸入途徑、或經(jīng)肌肉、皮下、皮膚、靜脈內(nèi)、尿管內(nèi)或眼內(nèi)給藥的所有系統(tǒng)。
這些藥物遞送系統(tǒng)包括可提供位點(diǎn)特異性釋放的制劑，或能夠加強(qiáng)小腸粘膜保護(hù)作用的制劑。合適的制劑包括干粉劑、病毒顆粒包裹遞送、脂質(zhì)體包裹、皮膚貼劑、電輔助傳送(電穿孔治療)和聚合物/煙腙結(jié)合物。
在一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，這種藥物遞送裝置會(huì)對(duì)生物環(huán)境的變做出反應(yīng)，并且基于這些變化進(jìn)行藥物的遞送(或停止遞送)。多種物質(zhì)已被用于控制藥物和其他活性制劑的釋放聚尿烷、聚硅氧烷、聚甲基甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇，用于親水性和強(qiáng)度、聚乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚(2-羥基乙基甲基丙烯酸酯)、聚(n-乙烯吡咯烷酮)、聚甲基甲基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、乙二醇二乙酸酯與乙酸乙烯酯的共聚物、聚乙二醇、聚甲基丙烯酸，等等。在另一項(xiàng)優(yōu)選實(shí)施方案中，可生物降解的聚合物被用以促進(jìn)藥物的遞送。這類聚合物包括聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)、丙交酯與乙交酯的共聚物(PLGA)、聚酸酐和聚原酸酯。在美國(guó)專利6,072,041；6,041,253；6,018,678；6,017,318；6,002,961；5,879,712；5,849,331；5,792,451；5,783,212；5,766,633；5,759,566；5,690,945；5,681,811；5,654,000；5,438,040；4,810,499和4,659,558中描述了藥物遞送裝置及其使用方法因此，本發(fā)明的另一方面涉及一些藥用組合物和方法，用于通過(guò)將治療有效劑量的含有本發(fā)明所述聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的化合物或其藥學(xué)容許的鹽類給藥來(lái)治療那些需要治療的哺乳動(dòng)物。“藥學(xué)容許的鹽類”是指一種能保持本發(fā)明的多肽的生物學(xué)效力和特性的鹽，并且該鹽不是生物學(xué)或其他方面不合要求的。鹽類可以來(lái)自酸或堿。酸加成性鹽來(lái)自無(wú)機(jī)酸，如鹽酸、氫溴酸、硫酸(得到硫酸鹽和硫酸氫鹽)、硝酸、磷酸等，也可以來(lái)自有機(jī)酸，如醋酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、蘋(píng)果酸、丙二酸、琥珀酸、馬來(lái)酸、延胡索酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、水楊酸、p-甲苯磺酸等。堿加成性鹽可以來(lái)自無(wú)機(jī)堿，包括鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽、鎂鹽，等等。來(lái)自有機(jī)堿的鹽類包括那些由一級(jí)胺、二級(jí)胺、三級(jí)胺、包括天然取代胺在內(nèi)的取代胺，以及環(huán)胺所形成的鹽，包括異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、氨丁三醇、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、咖啡堿、普魯卡因、哈胺、膽堿、甜菜堿、乙二胺、葡糖胺、N-烷基葡糖胺、可可堿、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶，等等。優(yōu)選的有機(jī)堿是異丙胺、二乙胺、乙醇胺、哌啶、氨丁三醇和膽堿。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“治療”包括任何對(duì)哺乳動(dòng)物尤其是對(duì)人的疾病和病情所進(jìn)行的治療，包括(i)預(yù)防在可能受疾病感染的但未被診斷出患病的主體中的疾病或病情的發(fā)生；(ii)抑制疾病或病情，即阻止疾病的發(fā)展；以及(iii)緩解疾病或病情，即促使癥狀的復(fù)原或改善。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“通過(guò)用促紅細(xì)胞生成蛋白進(jìn)行治療來(lái)預(yù)防或緩解哺乳動(dòng)物的疾病狀態(tài)”應(yīng)包括所有被該領(lǐng)域普遍承認(rèn)的可有效地用促紅細(xì)胞生成蛋白大體上進(jìn)行治療的疾病狀態(tài)，以及那些被發(fā)現(xiàn)通過(guò)用本發(fā)明的特定化合物進(jìn)行治療而被有效預(yù)防或緩解的疾病狀態(tài)。這些疾病狀態(tài)包括，作為說(shuō)明而不是限制，貧血、β地中海貧血、惡性貧血、鐮狀細(xì)胞病、慢性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、骨髓炎、幼年風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕熱、Crohn’s病、潰瘍性結(jié)腸炎，等等。
在此使用的術(shù)語(yǔ)“治療有效劑量”是指，當(dāng)將給藥于需要治療的哺乳動(dòng)物時(shí)，聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的使用量足以實(shí)現(xiàn)治療(按照上文的定義)的目的，例如，作為紅細(xì)胞增殖的誘導(dǎo)劑的抗貧血?jiǎng)鹊?。根?jù)蛋白衍生物、病情或疾病及其嚴(yán)重程度、以及待治療的哺乳動(dòng)物及其體重、年齡等的不同，構(gòu)成“治療有效劑量”的劑量也在變化，但是該領(lǐng)域的一般技術(shù)人員可以運(yùn)用當(dāng)前的知識(shí)和該公開(kāi)內(nèi)容常規(guī)地測(cè)定出劑量。文中使用的術(shù)語(yǔ)“q.s.”是指添加量足以實(shí)現(xiàn)規(guī)定的功能，例如，足以使溶液達(dá)到所需體積(如100ml)。
如上所述，可以將本發(fā)明的聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白及其藥學(xué)容許的鹽類，即活性成分，以治療有效劑量進(jìn)行給藥，也就是給藥于需要治療的哺乳動(dòng)物的劑量足以實(shí)現(xiàn)治療目的。在此，促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的給藥可以通過(guò)具有類似應(yīng)用的制劑所普遍使用的任何一種給藥方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。文中使用的術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明的聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白”、“本發(fā)明所述多肽的[藥學(xué)容許的鹽類]”以及“活性成分”可以互換使用。
制劑中的聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白水平可以在該領(lǐng)域技術(shù)人員使用的整個(gè)范圍內(nèi)變化，例如，整個(gè)制劑中可含有重量百分比(％w)約為0.01-99.99％的蛋白拮抗劑或顯效劑和約0.01-99.99％w的賦形劑。更典型的是，聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的含量約為0.5-80％w。
盡管本發(fā)明的聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的人用劑量還需要優(yōu)化，但總的來(lái)說(shuō)，化合物的給藥劑量顯然取決于主體和需要預(yù)防或緩解的疾病狀態(tài)、病痛的性質(zhì)或嚴(yán)重程度、給藥方式和方案，以及醫(yī)師在開(kāi)藥時(shí)的判斷。該領(lǐng)域的普通技術(shù)人員都能夠很好地對(duì)其使用進(jìn)行優(yōu)化。
可以經(jīng)由任何可接受的全身途徑或局部途徑來(lái)進(jìn)行給藥，例如，經(jīng)胃腸外、經(jīng)口(特別是幼兒制劑)、經(jīng)靜脈內(nèi)、經(jīng)鼻、經(jīng)支氣管吸入(即氣霧劑)、經(jīng)皮膚或局部途徑，其用藥形式可以是固體、半固體或液體或氣霧劑，例如，藥片、藥丸、膠囊、粉末、液體、溶液、乳劑、血管注射劑、懸浮液、栓劑、氣霧劑，等等。此外，本發(fā)明的聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白還能夠以緩釋形式或受控釋放形式進(jìn)行給藥，其中包括長(zhǎng)效注射劑、滲透泵、藥丸、皮膚貼劑(包括電遷移)，等等，從而以預(yù)定比率將該多肽進(jìn)行持續(xù)給藥，并且優(yōu)選的是以適于能以精確劑量單次給藥的單位劑量形式給藥。該組合物包括常規(guī)的優(yōu)選載體或賦形劑，以及本發(fā)明蛋白的拮抗劑或顯效劑，此外，還可以包括其他醫(yī)學(xué)制劑、藥學(xué)制劑、載劑、佐藥等。載體可選自各種油類，其中包括石油、來(lái)自動(dòng)物的、植物的或人造的油，例如，花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等、優(yōu)選的流體載劑是水、生理鹽水、水性葡聚糖和乙二醇，特別優(yōu)選的是注射用溶液。合適的藥用載劑包括淀粉、纖維素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鎂、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、氯化鈉、干脫脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。E.W.Martin在“Remington’s藥物科學(xué)”中對(duì)其他合適的藥用載劑及其制劑進(jìn)行了描述。
此外，如果需要，上述藥用組合物還可以含有少量無(wú)毒的輔助物質(zhì)，如濕潤(rùn)劑或乳化劑、pH緩沖劑等，例如醋酸鈉、脫水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺，等等。
盡管可能需要更多的活性成分，但是可以利用方便的每日用藥方案，用口服給藥來(lái)遞送本發(fā)明的聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，并且該方案可以根據(jù)需要抑制的程度或病痛緩解的情況而加以調(diào)整。為了進(jìn)行這種口服給藥，通過(guò)摻入任何常用的賦形劑以形成一種藥學(xué)容許性的無(wú)毒的組合物，這些賦形劑如藥用級(jí)別的甘露醇、乳糖、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸鎂、糖精、滑石、纖維素、交聯(lián)羥甲纖維素鈉、葡萄糖、明膠、蔗糖、碳酸鎂，等等。該組合物可以采用的形式包括溶液、懸浮液、可分散性藥片、藥丸、膠囊、粉末、緩釋制劑等。口服制劑尤其適于治療胃腸道疾病。通過(guò)使用能促進(jìn)體循環(huán)攝取的賦形劑可調(diào)整全身用途的藥物的口服生物藥效率，如含有乙?；被岬闹苿？蓞⒖?，例如，US5,935,601和US5,629,020。
上述組合物可以采用膠囊、藥丸或藥片的形式，并且該組合物因而可一并含有活性成分和一種稀釋劑，如乳糖、蔗糖、磷酸氫鈣等；一種分解質(zhì)，如交聯(lián)羥甲纖維素鈉、淀粉或其衍生物；一種潤(rùn)滑劑，如硬脂酸鎂等；以及一種粘合劑，如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、阿拉伯樹(shù)膠、明膠、纖維素及其衍生物，等等。
在藥學(xué)上能夠給藥的流體組合物的制備方法是，例如，使本發(fā)明的聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白(約0.5-20％)以及任選的藥用佐劑在水、生理鹽水、水性葡聚糖、甘油、乙二醇、乙醇、防腐劑等載劑中溶解、分散，等等，以形成一種溶液或懸浮液。此外，如果需要，用于給藥的藥用組合物還可含有少量無(wú)毒的輔助物質(zhì)，如濕潤(rùn)劑、懸浮劑、乳化劑或增溶劑、pH緩沖劑等，例如醋酸鈉、檸檬酸鈉、環(huán)糊精衍生物、聚氧乙烯、脫水山梨醇單月桂酸酯或硬脂酸酯，等等。該領(lǐng)域的技術(shù)人員已了解或?qū)?huì)了解這些劑型的實(shí)際制備方法；可參考，例如，“Remington’s藥物科學(xué)”，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania。用于給藥的組合物或制劑不論在任何情況下都應(yīng)含有一定量的活性成分，其劑量能夠有效地預(yù)防或緩解被治療主體的癥狀。當(dāng)用于向幼兒口服給藥時(shí)，優(yōu)選的是流體制劑(如糖漿或懸浮液)。
對(duì)含有流體的固體劑型而言，優(yōu)選的是將溶解在，例如，碳酸丙烯、植物油或甘油三酯中的溶液或懸浮液包裹在明膠膠囊中。對(duì)流體劑型而言，可以用足夠量的藥學(xué)容許的流體載劑，例如水，將溶解在諸如聚乙烯中的溶液稀釋，以便于在給藥時(shí)進(jìn)行測(cè)量。
作為選擇，制備流體制劑或半固體口服制劑的方法也可以是，將活性成分溶解或分散于植物油、乙二醇、甘油三酯、丙二醇酯(如碳酸丙烯)，等等，并將這些溶液或懸浮液包裹在硬的或軟的明膠膠囊殼中。
在運(yùn)用本發(fā)明的聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白治療上述病情時(shí)，優(yōu)選的是將文中描述的活性成分經(jīng)胃腸外給藥。一般而言，胃腸外給藥的特征是進(jìn)行注射，可以是皮下注射、肌內(nèi)注射或靜脈內(nèi)注射，也可包括真皮內(nèi)注射或腹膜內(nèi)注射，以及胸骨內(nèi)注射或輸液技術(shù)。可以經(jīng)血管注射劑制備成常規(guī)的形式，即流體溶液或懸浮液，固體形式適宜在注射前配制在流體、乳劑或生物相容性的基于聚合物的微球體(例如，脂質(zhì)體、聚乙二醇衍生物、聚(D，C)丙交酯等)中形成溶液或懸浮液。適合的賦形劑是，例如，水、生理鹽水、葡聚糖、甘油、乙醇，等等。此外，如果需要，被給藥的上述藥用組合物還可以含有還可以含有少量無(wú)毒的輔助物質(zhì)，如濕潤(rùn)劑或乳化劑、pH緩沖劑、增溶劑、蛋白載體等，例如醋酸鈉、聚氧乙烯、脫水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、環(huán)糊精、血清白蛋白，等等。
本發(fā)明的聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白可以經(jīng)胃腸外給藥，其方法是，例如，將上述化合物溶解在一種適當(dāng)?shù)娜軇?如水或生理鹽水)中或摻入到一種脂質(zhì)的制劑中，然后將其分散在一種容許性輸入液中。本發(fā)明的多肽的每日劑量通常是通過(guò)一次輸液或通過(guò)間隔一定時(shí)間的多次輸液來(lái)進(jìn)行給藥的。水溶性形式的活性成分的水性溶液尤其適合用于胃腸外給藥，水溶性形式有水溶性鹽，或水性注射懸浮液，其中含有增粘物質(zhì)，如羧甲纖維素鈉、山梨醇和(或)葡聚糖，以及，如果需要，還可以含有穩(wěn)定劑。此外，該活性成分還可以是凍干產(chǎn)物的形式，并且在胃腸外給藥前，通過(guò)添加適當(dāng)?shù)娜軇┒渲瞥梢环N溶液。
最近設(shè)計(jì)出一種用于胃腸外給藥的方法，該方法是植入一種緩釋或持續(xù)釋放系統(tǒng)，從而使劑量維持在恒定水平?？蓞⒖?，例如，US3,710,795、US5,714,166和US5,041,292，其內(nèi)容在此引入作為參考。
用于胃腸外給藥的這些組合物中包含的活性成分百分比在很大程度上取決于該活性成分的特定性質(zhì)，以及多肽的活性和主體的需要量。但是，溶液中的活性成分百分比可以是0.01-10％，若組合物為固體，該百分比可以更高，但隨后需要稀釋至上述百分比。優(yōu)選的是，溶液中的組合物含有0.02-8％的活性成分。
本發(fā)明的聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的另一種給藥方法是同時(shí)利用快速注射和連續(xù)輸液。
氣霧劑給藥是一種用以將本發(fā)明的聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白直接遞送到呼吸道的有效方法。該方法的一些優(yōu)勢(shì)是1)該方法能防止發(fā)生酶促降解作用、胃腸道的弱吸收，以及防止由于肝臟的首次排泄作用而引起治療劑的損失；2)該方法能將活性成分給藥至其呼吸道中的靶位點(diǎn)，而使用其他方法則可能由于活性成分的分子大小、電荷或與肺外位點(diǎn)的親合力而不能實(shí)現(xiàn)上述目的；3)該方法可以使藥物經(jīng)肺泡快速地吸收到身體中；以及4)該方法避免了其他器官系統(tǒng)與活性成分接觸，這一點(diǎn)對(duì)可能由于接觸引起不良副作用的器官來(lái)說(shuō)很重要。由于這些原因，氣霧劑給藥特別有利于治療哮喘、局部肺感染，以及其他疾病或肺和呼吸道病情。
藥學(xué)吸入裝置現(xiàn)有的三種類型是噴霧器吸入器、配量-劑量吸入器和干粉吸入器。噴霧器裝置能產(chǎn)生一股高速氣流，該氣流能使蛋白衍生物(已經(jīng)配置成流體形式)以霧的形式被攜帶噴灑到患者的呼吸道中。典型的配量-劑量吸入器將制劑與一種壓縮氣體共同密封，并且在啟動(dòng)時(shí)，在壓縮氣體的作用下釋放出標(biāo)準(zhǔn)量的多肽，因此提供了一種將制劑以規(guī)定量給藥的可靠方法。干粉吸入器將多肽以自由流動(dòng)的粉末形式給藥，利用該裝置可以將粉末在呼吸過(guò)程中分散在患者的氣流中。為了形成一種自由流動(dòng)的粉末，將蛋白衍生物與一種賦形劑一起配制，如乳糖。將標(biāo)準(zhǔn)量的蛋白衍生物以膠囊的形式貯存，并通過(guò)每次啟動(dòng)來(lái)給藥于患者。上述所有方法都可以用于將本發(fā)明給藥。
此外，基于脂質(zhì)體的藥學(xué)制劑也適合于同本發(fā)明的聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白一起使用?？蓞⒖迹?，美國(guó)專利Nos.5,631,018、5,723,147和5,766,627。使用脂質(zhì)體的好處被認(rèn)為與由于脂質(zhì)體對(duì)藥物的包載所產(chǎn)生的組織分布和藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的有利變化有關(guān)，因而該領(lǐng)域的技術(shù)人員可以被其應(yīng)用于本發(fā)明的多肽。此外，還可以將受控釋放型液態(tài)脂質(zhì)體藥劑用于注射或口服。
用于以栓劑形式進(jìn)行全身給藥的傳統(tǒng)粘合劑和載劑包括，例如，聚乙二醇或甘油三酯，如PEG1000(96％)和PEG4000(4％)。上述栓劑可以由混合物制成，該混合物可含有約0.5-10w/w％的活性成分；優(yōu)選的是含有約1-2w/w％的活性成分。
該說(shuō)明書(shū)中提到的所有出版物和專利申請(qǐng)?jiān)诖司酝瘸潭纫胱鳛閰⒖迹缤總€(gè)出版物或?qū)＠暾?qǐng)都被單獨(dú)地明確指出要引入作為參考。盡管已對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了全面描述，但參考下文的實(shí)施例會(huì)更容易地理解本發(fā)明，除非特別指出，這些實(shí)施例只作為說(shuō)明，而不是要限制本發(fā)明。
實(shí)施例縮寫(xiě)Acm＝乙酰氨基甲基巰基保護(hù)基團(tuán)[即-CH2NHCOCH3]AoA＝氨基氧乙?；鵄rg(Tos)＝L-精氨酸(側(cè)鏈被NG甲苯磺酰基保護(hù))ART＝絕對(duì)網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)Asp(cHex)＝L-天冬氨酸(側(cè)鏈被環(huán)己基酯保護(hù))AUC＝曲線下面積Boc＝叔丁氧羰基CD＝圓二色性
CDI＝羰基二咪唑CHO＝中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢CL＝清除率(mL/hr/kg)Cmax＝最大濃度Cys(4MeBzl)＝L-半胱氨酸(側(cè)鏈經(jīng)(4-甲基)芐基保護(hù))Cys(Acm)＝L-半胱氨酸(側(cè)鏈被乙酰氨基甲基[即-CH2NHCOCH3]保護(hù))DCM＝二氯甲烷DIC＝二異丙基碳二亞胺DIEA＝二異丙基乙胺DMF＝二甲基甲酰胺DMSO＝二甲亞砜DPC＝十二烷基磷酸膽堿Dpr＝L-1，2二氨基丙酸ED50＝要求達(dá)到最大效果的50％的有效劑量EDA＝(4，7，10)-三氧十三烷-1，13-二胺ELISA＝酶聯(lián)免疫測(cè)定EPO＝促紅細(xì)胞生成素ES-MS＝電噴射電離質(zhì)譜FBS＝胎牛血清Glu(cHex)＝L-谷氨酸(側(cè)鏈被環(huán)己基酯保護(hù))GM-CSF＝粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子HATU＝O-(7-氮苯三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲銨六氟磷酸鹽HCT＝紅細(xì)胞比容HGB＝血紅蛋白His(Dnp)＝L-組氨酸(側(cè)鏈被N1m二硝基苯酚保護(hù))HOBT＝N-羥苯三唑HPLC＝高壓液相色譜IMDM＝Iscove’s改良型Dulbecco’s培養(yǎng)基IPA＝異丙醇Lev＝乙酰丙酸Lys(CIZ)＝L-賴氨酸(側(cè)鏈被2-氯苯氧羰基保護(hù))
MBHA＝4-甲基二苯甲胺MRT＝平均滯留時(shí)間MTT＝4-甲基三苯甲基MTT＝噻唑藍(lán)NHS＝N-羥基琥珀酰亞胺-OCH2-Pam-樹(shù)脂＝-O-CH2-Bz-CH2CONHCH2(共聚苯乙烯-二乙烯基苯)-樹(shù)脂Pbo＝4-(CH3S(O)-)芐基PBS＝磷酸鹽緩沖液PCV＝壓縮的細(xì)胞體積RBC＝紅細(xì)胞RET＝＝網(wǎng)織紅細(xì)胞rhEPO＝重組人EPORSA＝鼠血清白蛋白SDS＝十二烷基磺酸鈉SDS-PAGE＝SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳SEP＝促紅細(xì)胞生成性合成蛋白Ser(Bzl)＝L-絲氨酸(側(cè)鏈被芐基保護(hù))實(shí)施例1促紅細(xì)胞生成性合成蛋白SEP-0的合成進(jìn)行促紅細(xì)胞生成性合成蛋白SEP的合成。全長(zhǎng)的合成蛋白(命名為“SEP-0(1-166)”)的序列為APPRLICDSRVLERYLLEAK EAEKITTGCA EHCSLNEKITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQALLVKSSQPWψP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKψAISPPDAASAAPLRTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO1)其中ψ特指含有巰基經(jīng)羧甲基化的半胱氨酸的非天然氨基酸殘基。該SEP-0蛋白是由四種多肽片段在溶液中合成的。
片段SEP-01(GRFN1711；包括SEQ ID NO1的第1-32位殘基)
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-硫酯片段SEP-02(GRFN1712；包括SEQ ID NO1的第33-88位殘基)CSLNEKITVP DTKVNFYAWK RMEVGQQAVE VWQGLALLSEAVLRGQALLV KSSQPW-硫酯(其中的Cys33被Acm所保護(hù))片段SEP-03(GRFN1713；包括SEQ ID NO1的第89-116位殘基)CPLQLHVDKA VSGLRSLTTL LRALGAQK-硫酯(其中的Cys89被Acm所保護(hù))片段SEP-04(GRFN1714；包括SEQ ID NO1的第117-166位殘基)CAISPPDAAS AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLYTGEACRTGDR-羧酸酯(其中的C-末端半胱氨酸(Cys161)帶有一個(gè)吡啶甲基(pico)保護(hù)基團(tuán))采用Boc(叔丁氧羰基)化學(xué)的原位中和方法在硫酯生成樹(shù)脂上合成肽SEP-01、SEP-02和SEP-03，并且在ABI1433A自動(dòng)肽合成器或手動(dòng)鏈組裝裝置上用已確立的SPPS、側(cè)鏈保護(hù)和硫酯樹(shù)脂策略(Hacieng，et al.，PNAS(1996)9610068-10073；and Schnolzer，et al.，Int.J.Pept.Prot.Res.，(1992)40180-193)來(lái)逐步進(jìn)行固相肽合成(SPPS)，也可以從供應(yīng)商處訂購(gòu)和得到。例如，使用一組標(biāo)準(zhǔn)的Boc SPPS保護(hù)基團(tuán)，即Arg(Tos)；Asp(cHex)；Cys(4MeBzl) & Cys(Acm)；Glu(cHex)；His(DNP)；Lys(CIZ)；Ser(Bzl)；Thr(Bzl)；Trp(甲酰)；Tyr(BrZ)；側(cè)鏈未被保護(hù)的Met、Asn和Gln。類似地，在-OCH2-Pam-樹(shù)脂上合成片段SEP-04。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Boc化學(xué)流程將肽類去保護(hù)，并且同時(shí)用HF/對(duì)甲酚將其從樹(shù)脂支持物上裂解下來(lái)；然而，對(duì)那些在HF/對(duì)甲酚中含有未去除保護(hù)基團(tuán)的肽類來(lái)說(shuō)，仍然保留有保護(hù)基團(tuán)。用制備型C4反相高壓液相色譜(HPLC)進(jìn)行肽類的純化。用ES-MS(電噴射電離質(zhì)譜)對(duì)含有純凈肽的組分進(jìn)行鑒定，將各組分合并，并且凍干以利于隨后的連接。
步驟1連接#1將片段SEP-04和SEP-03以15mM的濃度溶解在TFE中。加入含有6M氯酸胍和1％苯硫酚的飽和磷酸緩沖液(pH7.9)，則得到一種含有肽段的澄清溶液。連接反應(yīng)完成后，將連接混合物加入到2ml TFE(三氟乙醇)、6ml 6M氯酸胍和含有25％β-巰基乙醇的100mM磷酸鹽的溶液中，并孵育20分鐘。用含有15mg/mlTCEP(三(2-羧乙基)膦)的冰醋酸酸化上述溶液，并裝入制備型C4反相HPLC柱上(直徑為1英寸)。然后用制備型梯度反相HPLC進(jìn)行肽類的純化。利用ES-MS對(duì)含有所需連接產(chǎn)物SEP-0Acm+SEP-03+SEP-04的組分進(jìn)行鑒定，并將各組分合并。
步驟2去除Acm#1去除Acm的方法是，用HPLC級(jí)水將含有SEP-0Acm+SEP-03+SEP-04合并組分的水性乙腈溶液稀釋1倍，并加入固體脲，使其終濃度為2摩爾。加入摩爾數(shù)三倍過(guò)量(相對(duì)于預(yù)計(jì)的總半胱氨酸的濃度)的溶于3％的水性醋酸的30mg/ml醋酸汞溶液，并將所得溶液攪拌1小時(shí)。然后將該溶液以20％的濃度配制在β-巰基乙醇中，裝入半制備型反相HPLC柱上，并利用逐級(jí)梯度進(jìn)行純化。用ES-MS對(duì)含有所需產(chǎn)物SEP-03+SEP-04的組分進(jìn)行鑒定，并凍干過(guò)夜。
步驟3連接#2將等量的SEP-03+SEP-04和SEP-02以15mM的濃度共同溶解在純TFE中。加入含有6M氯酸胍和1％苯硫酚的250mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)，則得到一種含有肽段的澄清溶液。在經(jīng)過(guò)1天的連接反應(yīng)之后，將連接混合物加入到pH4的10ml TFE(三氟乙醇)、10mlβ-巰基乙醇、10ml哌啶和20ml 6M氯酸胍的溶液中，并孵育20分鐘以去除所有殘余的保護(hù)基團(tuán)。用溶于20％的水性醋酸的15mg/ml TCEP溶液使上述溶液酸化，并裝入制備型C4反相HPLC柱上(直徑為1英寸)，然后用線性梯度進(jìn)行純化。用ES-MS對(duì)含有所需連接產(chǎn)物SEP-0Acm+SEP-02+SEP-03+SEP-04的組分進(jìn)行鑒定，并凍干過(guò)夜。
步驟4羧甲基化將SEP-0Acm+SEP-02+SEP-03+SEP-04以15mM的濃度溶解在TFE中。加入兩倍過(guò)量(v/v)的含有6M氯酸胍的濃度為200mM的磷酸鹽緩沖液(pH7.9)，則得到一種含有肽段的澄清溶液。加入溶解在盡可能少量甲醇中的25倍過(guò)量的溴代乙酸，并且使上述溶液反應(yīng)2小時(shí)。用溶于20％的水性醋酸的15mg/ml TCEP溶液使上述溶液酸化，并裝入制備型反相HPLC柱上(直徑為1英寸)，然后用逐級(jí)梯度進(jìn)行純化。用ES-MS對(duì)含有所需羧甲基化產(chǎn)物SEP-0Acm+SEP-02+SEP-03+SEP-04的組分進(jìn)行鑒定，并將各組分合并。
步驟5去除吡啶甲基在2M HCl中活化鋅粉30分鐘。將肽SEP-0Acm+SEP-02+SEP-03+SEP-04+Et以約10mmg/ml的濃度溶解在純TFE中。用6M氯酸胍、含有(臨用前加入)35mg/ml L-甲硫氨酸和35mg/ml十二烷基肌氨酸(即N-十二烷基肌氨酸鈉)的pH為4的100mM的醋酸鹽溶液將上述溶液稀釋4倍(v/v相對(duì)于TFE)。再向溶液中加入活化的鋅粉。每間隔1小時(shí)監(jiān)控一次反應(yīng)，并且在5小時(shí)后停止反應(yīng)。在反應(yīng)結(jié)束后，將上清移去，并用含有20％TFE的6M氯酸胍及含有35mg/ml L-甲硫氨酸和35mg/ml十二烷基肌氨酸的pH為4的100mM的醋酸鹽溶液將殘余鋅粉清洗2次共5分鐘，以及用含有20％β-巰基乙醇的相同溶液清洗1次。用溶于20％的水性醋酸的15mg/ml TCEP溶液使上述混合產(chǎn)物酸化，并裝入制備型反相HPLC柱上，然后用逐級(jí)梯度進(jìn)行純化。用ES-MS對(duì)含有所需的修飾產(chǎn)物SEP-0Acm+SEP-02+SEP-03+SEP-04+Et-Pico的組分進(jìn)行鑒定，并將各組分合并。
步驟6去除Acm#2用HPLC級(jí)水將合并的SEP-0Acm+SEP-02+SEP-03+SEP-04+Et-Pico的溶液稀釋4倍，并加入終濃度為2摩爾的固體脲。加入摩爾數(shù)3倍過(guò)量(相對(duì)于預(yù)計(jì)的總半胱氨酸的濃度)的溶于3％的水性醋酸的30mg/ml醋酸汞溶液，并將所得溶液攪拌1小時(shí)。然后將該溶液以20％的濃度配制在β-巰基乙醇中，裝入半制備型反相HPLC柱上，并利用逐級(jí)梯度進(jìn)行純化。用ES-MS對(duì)含有所需產(chǎn)物SEP-02+SEP-03+SEP-04+Et-Pico的組分進(jìn)行鑒定，再用含有2x(w/w相對(duì)于肽的質(zhì)量)DPC(十二烷基膽堿磷酸)的水將其稀釋2倍(v/v)并凍干過(guò)夜。
步驟7連接#3將等量的SEP-02+SEP-03+SEP-04+Et-Pico和SEP-01以15mM的濃度共同溶解在純TFE中，并加入含有6M氯酸胍的250mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)。再向溶液中加入1％苯硫酚。經(jīng)過(guò)1天的連接反應(yīng)之后，將連接混合物加入到10ml TFE(三氟乙醇)、10mlβ-巰基乙醇、10ml哌啶和20ml氯酸胍pH為4的溶液中，并孵育20分鐘以去除所有殘余的保護(hù)基團(tuán)。用溶于20％的水性醋酸的15mg/ml TCEP溶液使上述溶液酸化，并裝入制備型反相HPLC柱上(直徑為1英寸)，然后用線性梯度進(jìn)行純化。用電噴射質(zhì)譜對(duì)含有所需連接產(chǎn)物SEP-0(1-166)(SEQ ID NO1)的組分進(jìn)行鑒定，再用含有2x(w/w相對(duì)于肽的質(zhì)量)十二烷基肌氨酸的水將其稀釋2倍(v/v)并凍干過(guò)夜。
步驟8折疊將全長(zhǎng)的連接產(chǎn)物SEP-0(1-166)溶解在含有6M氯酸胍和20％TFE以及摩爾數(shù)十倍過(guò)量(相對(duì)于蛋白中的Cys殘基)的半胱氨酸的濃度為250mM的Tris緩沖液(pH8.7)中。該溶液在含有3M氯酸胍的濃度為200mM的Tris緩沖液(pH8.7)中室溫透析過(guò)夜。再將該溶液在含有1M氯酸胍的濃度為200mM的Tris緩沖液(pH8.7)中4℃透析4小時(shí)，最后將該溶液在10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中4℃透析4小時(shí)，從而得到最終的折疊產(chǎn)物。用電噴射ES-MS和CD(圓二色性)光譜測(cè)定法來(lái)證實(shí)折疊。
步驟9純化用Centricon濃縮管將上述折疊多肽濃縮5倍，并裝入經(jīng)pH7.0的10mM磷酸鹽緩沖液平衡的Resource S陽(yáng)離子交換柱上。用至500mM NaCl的線性鹽梯度將折疊蛋白在10分鐘內(nèi)洗脫下來(lái)。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對(duì)含有所需折疊產(chǎn)物SEP-0(1-166)的組分進(jìn)行鑒定，并于-80℃冷凍貯存。分析性反相HPLC色譜、折疊蛋白產(chǎn)物的ES-MS譜和CD光譜都證明折疊蛋白的存在。
實(shí)施例2促紅細(xì)胞生成性合成蛋白SEP-1-L30的合成進(jìn)行在SEP-0的第24和126位上含有肟型基團(tuán)的第二種促紅細(xì)胞生成性合成蛋白(命名為SEP-1-L30)的合成。然后利用這些基團(tuán)形成SEP-1-L30，其中蛋白骨架上連接了線性的(EDA-Succ-)18羧酸鹽(EDA＝(4，7，10)-三氧十三烷-1，13二胺，也被稱為TTD；Succ＝-CO-CH2CH2CO-)聚合物。全長(zhǎng)的SEP-1(1-166)的序列為
APPRLICDSRVLERYLLEAK EAEKOXITTGCA EHCSLNEKITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQALLVKSSQPWψP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKψAISPPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO2)其中ψ特指含有經(jīng)羧甲基化的巰基的半胱氨酸的非天然氨基酸殘基，其中KOX特指其ε-氨基經(jīng)化學(xué)修飾連接了以肟鍵結(jié)合指定的水溶性聚合物的肟連接基團(tuán)的非天然賴氨酸。此外，圖15還顯示SEP-1-L30的結(jié)構(gòu)。
圖14中顯示了下文化學(xué)合成SEP-1-L30的圖示說(shuō)明。簡(jiǎn)單地說(shuō)，圖14(A)和圖14(B)中，水溶性聚合物GRFN32(GP32)通過(guò)肟鍵形成化學(xué)連接反應(yīng)與肽SEP-11和SEP-14相連接。如圖所示，肽SEP-11的第32位帶有一種C-末端Yaa基團(tuán)，該基團(tuán)包括一種用以隨后的天然化學(xué)連接的組氨酸α-羧基硫酯，以及第24位(天然人EPO的糖基化位點(diǎn))帶有一種非天然的賴氨酸殘基，該殘基的側(cè)鏈經(jīng)化學(xué)修飾而帶有一種包括氨氧?；腢n＝1基團(tuán)。顯示對(duì)應(yīng)于最終全長(zhǎng)產(chǎn)物第1位的N-末端丙氨酸以作為參考。肽SEP-14的第117位帶有一種未保護(hù)的N-末端Xaa基團(tuán)，該基團(tuán)包括半胱氨酸，第126位(天然人EPO的糖基化位點(diǎn))帶有一種含有氨氧酰基修飾的賴氨酸的Un＝1基團(tuán)，以及第161位帶有半胱氨酸(二硫化物型半胱氨酸，該半胱氨酸的側(cè)鏈硫醇經(jīng)吡啶甲基基團(tuán)保護(hù)。保護(hù)Cys161以避免在隨后的被引入作為天然化學(xué)連接位點(diǎn)的半胱氨酸的轉(zhuǎn)換過(guò)程發(fā)生硫烷化(見(jiàn)圖14(D))；此外還可以使用吡啶甲基保護(hù)基團(tuán)，因?yàn)槠淙コ龡l件與去除第一次天然化學(xué)連接反應(yīng)中保護(hù)半胱氨酸的Acm(乙酰氨基甲基)的條件互不干擾(見(jiàn)圖14(C))。通過(guò)肟型化學(xué)連接實(shí)現(xiàn)在GP32聚合物的第24和126位構(gòu)建位點(diǎn)專一性和唯一連接，從而產(chǎn)生精確的聚合物修飾的肽SEP-11+GP32和SEP-14+GP32。圖14(C)顯示SEP-14+GP32和一種中肽片段SEP-13的天然化學(xué)連接，以及產(chǎn)生SEP-13+SEP-14+GP32的流程，其中的連接位點(diǎn)是在Lys1116和Cys117。如圖所示，肽SEP-13包括一種在第89位的含有被保護(hù)的半胱氨酸的N-末端Xaa基團(tuán)，以及在第116位的含有組氨酸α-羧基硫酯的C-末端Yaa基團(tuán)。在天然化學(xué)連接之后，去除Acm保護(hù)基團(tuán)以使該連接產(chǎn)物準(zhǔn)備用于下一步的連接。圖14(D)顯示SEP-13-SEP-14+GP32和一種中肽片段SEP-12的天然化學(xué)連接，以及產(chǎn)生SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP32的流程，其中的連接位點(diǎn)是在Try88和Cys89。如圖所示，肽SEP-12包括一種在第33位的含有Acm半胱氨酸的N-末端Xaa基團(tuán)，以及在第89位的含有色氨酸α-羧基硫酯的C-末端Yaa基團(tuán)。在天然化學(xué)連接之后，將連接產(chǎn)物暴露于溴醋酸中，以使第89和117位半胱氨酸的側(cè)鏈硫醇發(fā)生羧甲基化，從而將其轉(zhuǎn)換為假谷氨酸。在羧甲基化之后，去除Acm和吡啶甲基保護(hù)基團(tuán)以使該未保護(hù)的聚合物修飾的連接產(chǎn)物準(zhǔn)備用于下一步的連接。圖14(E)顯示SEP-13-SEP-14+GP32和一種肽片段SEP-11+GP32(對(duì)應(yīng)于全長(zhǎng)產(chǎn)物的N-末端片段)的天然化學(xué)連接，以及產(chǎn)生全長(zhǎng)SEP-1-L30產(chǎn)物SEP-11+GP32+SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP32的流程，其中最后的連接位點(diǎn)是在His32和Cys33。如圖所示，全長(zhǎng)的SEP-1-L30產(chǎn)物包括兩種只與自定義位點(diǎn)相連的水溶性聚合物(GP32)，其中自定義位點(diǎn)即對(duì)應(yīng)于天然人EPO的第24和126位的糖基化位點(diǎn)。詳細(xì)的合成過(guò)程將在下文描述。
A.GRFN1776和GRFN1711與GRFNP32的肟化作用使帶有氨氧乙?；鶊F(tuán)的水溶性聚合物與帶有酮羰基團(tuán)的肽相連接，從而形成肟鍵。為此而合成以下肽段片段SEP-14(GRFN1776；包括SEQ ID NO2的第117-166位殘基)CAISPPDAAK AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLYTGEACRTGDR-羧酸酯(其中的Lys126的ε-氨基經(jīng)乙酰丙酸殘基修飾，并且其中的Cys1117被Acm所保護(hù))片段SEP-11(GRFN1711；包括SEQ ID NO2的第1-32位殘基)APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-硫酯(其中的Lys24經(jīng)乙酰丙酸殘基修飾)按照實(shí)施例1所述，在硫酯生成樹(shù)脂上合成片段SEP-11(GRFN1711)，并且在-OCH2-Pam-樹(shù)脂上合成片段SEP-14(GRFN1776)。首先用Fmoc基團(tuán)將這兩種肽段的第24和126位的賴氨酸的ε-氨基保護(hù)起來(lái)。在鏈組裝完成后，再按照標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc去保護(hù)方法將攜帶Fmoc的氨基去保護(hù)，并且通過(guò)將每個(gè)肽樹(shù)脂與乙酰丙酸相連而加以修飾。然后，按照實(shí)施例1所述，將上述肽類去保護(hù)，并且同時(shí)將其從樹(shù)脂支持物上裂解下來(lái)。利用制備型C4反相HPLC進(jìn)行肽類的純化。用ES-MS鑒定含有純凈肽的組分，合并并凍干以便于隨后的連接。按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Rose，K.et al.，美國(guó)專利申請(qǐng)系列09/379,297；Rose，et al.，J Am Chem Soc.(1999)1217034)在Sasrin羧基生成樹(shù)脂上進(jìn)行GRFNP32[-(EDA-Succ)18羧酸酯]的合成。通過(guò)結(jié)合五倍過(guò)量的活化的Boc-氨氧乙酸而將氨氧乙酰(AOA)基團(tuán)與聚合物的N-末端氨基相連。利用經(jīng)典的Fmoc-化學(xué)方法將聚合物鏈從樹(shù)脂支持物上裂解下來(lái)。利用制備型C4反相HPLC進(jìn)行聚合物鏈的純化。用ES-MS鑒定含有純凈聚合物的組分，合并并凍干以便于隨后的連接。
以等摩爾比將片段SEP-14和GRFNP32共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。然后將該溶液凍干。將干粉溶解，并且利用制備型梯度C4反相HPLC將聚合物修飾的肽與未修飾肽及未反應(yīng)聚合物分離。用ES-MS鑒定含有所需肟化產(chǎn)物SEP-14+GP32的組分，合并并凍干。
以等摩爾比將片段SEP-11和GRFNP32共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。然后將該溶液凍干。將干粉溶解，并且利用制備型梯度C4反相HPLC將聚合物修飾的肽與未反應(yīng)聚合物分離。用ES-MS鑒定含有所需肟化產(chǎn)物SEP-11+GP32的組分，合并并凍干。
B.促紅細(xì)胞生成性合成蛋白SEP-1-L30的合成SEP-1-L30是由四種多肽片段在溶液中合成的。
片段SEP-11+GP32(GRFN1711+GRFNP32，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的第1-32位殘基)APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGcA EH-硫酯(其中Lys24的ε-氨基經(jīng)通過(guò)乙酰-氨氧乙酰(Lev-AoA)肟鍵與GRFNP32結(jié)合的乙?；窟B接基團(tuán)修飾，表示為KOX)片段SEP-12(GRFN1712，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的第33-88位殘基)CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALLSEAVLRGQAL LVKSSQPW-硫酯(其中的Cys33被Acm所保護(hù))片段SEP-13(GRFN1713，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的第89-116位殘基)CPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLR ALGAQK-硫酯(其中的Cys89被Acm所保護(hù))片段SEP-14+GP32(GRFN1716+GRFNP32，對(duì)應(yīng)于SEQ ID)NO2的第117-166位殘基)CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR-羧酸酯(其中Lys126的ε-氨基經(jīng)通過(guò)乙酰-氨氧乙酰(Lev-AoA)肟鍵與GRFNP32結(jié)合的乙?；窟B接基團(tuán)修飾，表示為KOX，并且其中的C-末端半胱氨酸帶有一個(gè)吡啶甲基(pico)保護(hù)基團(tuán))按照實(shí)施例1中的描述來(lái)完成附加肽的合成、連接、羧甲基化、保護(hù)基團(tuán)去除、折疊以及純化，以產(chǎn)生全長(zhǎng)的折疊的SEP-1-L30。分析性反相HPLC色譜、折疊蛋白產(chǎn)物的ES-MS譜和CD光譜都證明折疊蛋白的存在。
實(shí)施例3促紅細(xì)胞生成性合成蛋白SEP-1-L26的合成進(jìn)行在SEP-0的第24和126位上含有肟型基團(tuán)的第三種促紅細(xì)胞生成性合成蛋白(命名為SEP-1-L26)的合成。然后利用這些基團(tuán)形成SEP-1-L26，其中線型聚合物(EDA-Succ)18羧酸鹽和(EDA-Succ)6-酰胺通過(guò)第24和126位的肟鍵而結(jié)合到蛋白骨架上。全長(zhǎng)的SEP-1(1-166)的序列為APPRLICDSRVLERYLLEAK EAEKOXITTGCA EHCSLNEKITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQALLVKSSQPWψP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKψAISPPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO2)其中ψ特指含有經(jīng)羧甲基化的巰基的半胱氨酸的非天然氨基酸殘基，其中KOX特指其ε-氨基經(jīng)化學(xué)修飾連接了以肟鍵結(jié)合指定的水溶性聚合物的肟連接基團(tuán)的非天然賴氨酸。此外，圖15還給出了SEP-1-L30的結(jié)構(gòu)。
與SEP-1-L30相比，SEP-1-L26被設(shè)計(jì)成在第126位上帶有一種更小的和不帶電荷的水溶性聚合物。連接在第24位的聚合物與SEP-1-L30中的相同。全長(zhǎng)產(chǎn)物的合成與實(shí)施例2中的描述相同。圖16顯示了SEP-1-L26的結(jié)構(gòu)。
A.GRFN1776與GRFNP6以及GRFN1711與GRFNP32的肟化作用使帶有氨氧乙?；鶊F(tuán)的水溶性聚合物與帶有酮羰基團(tuán)的肽相連接，從而形成肟鍵。為此而合成以下肽段片段SEP-14(GRFN1776；包括SEQ ID NO2的第117-166位殘基)CAISPPDAAK AAPLRTITAD TFRKLFRVYS NFLRGKLKLYTGEACRTGDR-羧酸酯(其中的Lys126的ε-氨基經(jīng)乙酰丙酸殘基修飾，并且其中的Cys117被Acm所保護(hù))片段SEP-11(GRFN1711；包括SEQ ID NO2的第1-32位殘基)APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKITTGCA EH-硫酯(其中的Lys24經(jīng)乙酰丙酸殘基修飾)按照實(shí)施例1所述，在硫酯生成樹(shù)脂上合成片段SEP-11(GRFN1711)，并且在-OCH2-Pam-樹(shù)脂上合成片段SEP-14(GRFN1776)。首先用Fmoc基團(tuán)將這兩種肽段的第24和126位的賴氨酸的ε-氨基保護(hù)起來(lái)。在鏈組裝完成后，再按照標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc去保護(hù)方法將攜帶Fmoc的氨基去保護(hù)，并且按照標(biāo)準(zhǔn)的耦聯(lián)方法通過(guò)將每個(gè)肽樹(shù)脂與乙酰丙酸相連而加以修飾。然后，按照實(shí)施例1所述，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Boc-化學(xué)方法將上述肽類去保護(hù)，并且同時(shí)將其從樹(shù)脂支持物上裂解下來(lái)。利用制備型C4反相HPLC進(jìn)行肽類的純化。對(duì)每種肽而言，用ES-MS鑒定含有純凈肽的組分，合并并凍干以便于隨后的連接。
按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Rose，K.et a1.，美國(guó)專利申請(qǐng)系列09/379,297；Rose，et al.，J Am Chem Soc.(1999)1217034)在Sasrin羧基生成樹(shù)脂上進(jìn)行水溶性聚合物(EDA-Succ)18羧酸酯(GRFNP32)的合成。按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Rose，K.et al.，美國(guó)專利申請(qǐng)系列09/379,297；Rose，et al.，J.Am.Chem.Soc.(1999)1217034)在Sieber酰胺生成樹(shù)脂上進(jìn)行水溶性聚合物(EDA-Succ)6-酰胺(GRFNP6)的合成。通過(guò)結(jié)合五倍過(guò)量的活化的Boc-氨氧乙酸而將氨氧乙酰(AOA)基團(tuán)與每個(gè)樹(shù)脂結(jié)合性聚合物的N-末端氨基相連。利用經(jīng)典的Fmoc-化學(xué)方法將兩種聚合物鏈分別從各自的樹(shù)脂支持物上裂解下來(lái)。利用制備型C4反相HPLC進(jìn)行每種聚合物鏈的純化。對(duì)每種聚合物而言，用ES-MS鑒定含有純凈聚合物的組分，合并并凍干以便于隨后的連接。
以等摩爾比將片段SEP-14和GRFNP6共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。然后將該溶液凍干。將干粉溶解，并且利用制備型梯度C4反相HPLC將聚合物修飾的肽與未修飾肽及未反應(yīng)聚合物分離。用ES-MS鑒定含有所需肟化產(chǎn)物SEP-14+GP6的組分，合并并凍干。
以等摩爾比將片段SEP-11和GRFNP32共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。然后將該溶液凍干。將干粉溶解，并且利用制備型梯度C4反相HPLC將聚合物修飾的肽與未反應(yīng)聚合物分離。用ES-MS鑒定含有所需肟化產(chǎn)物SEP-11+GP32的組分，合并并凍干。
B.促紅細(xì)胞生成性合成蛋白SEP-1-L26的合成SEP-1-L26是由四種多肽片段在溶液中合成的。
片段SEP-11+GP 32(GRFN1711+GRFNP32，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的第1-32位殘基)APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA EH-硫酯(其中Lys24的ε-氨基經(jīng)通過(guò)乙酰-氨氧乙酰(Lev-AoA)肟鍵與GRFNP32結(jié)合的乙?；窟B接基團(tuán)修飾，表示為KOX)片段SEP-12(GRFN1712，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的第33-88位殘基)CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALLSEAVLRGQAL LVKSSQPW-硫酯(其中的Cys33被Acm所保護(hù))片段SEP-13(GRFN1713，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的第89-116位殘基)CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-硫酯(其中的Cys89被Acm所保護(hù))片段SEP-14+GP6(GRFN1716+GRFNP6，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的第117-166位殘基)CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR-羧酸酯(其中Lys126的ε-氨基經(jīng)通過(guò)乙酰-氨氧乙酰(Lev-AoA)肟鍵與GRFNP6結(jié)合的乙酰基肟連接基團(tuán)修飾，表示為KOX，并且其中的C-末端半胱氨酸[即Cys161]帶有一個(gè)吡啶甲基(pico)保護(hù)基團(tuán))按照實(shí)施例1和2中的描述來(lái)完成附加肽的合成、連接、羧甲基化、保護(hù)基團(tuán)去除、折疊以及純化，以產(chǎn)生全長(zhǎng)的折疊的SEP-1-L26。分析性反相HPLC色譜、折疊蛋白產(chǎn)物的ES-MS譜和CD光譜都證明折疊蛋白的存在。
實(shí)施例4促紅細(xì)胞生成性合成蛋白SEP-1-B50的合成進(jìn)行第四種促紅細(xì)胞生成性合成蛋白(命名為SEP-1-B50)的合成。全長(zhǎng)的SEP-1-B50的氨基酸序列與SEP-1-L30的氨基酸序列相同APPRLICDSRVLERYLLEAK EAEKOXITTGCA EHCSLNEKITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQALLVKSSQPWψP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKψAISPPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO2)其中ψ特指含有經(jīng)羧甲基化的巰基的半胱氨酸的非天然氨基酸殘基，其中KOX特指其ε-氨基經(jīng)化學(xué)修飾連接了以肟鍵結(jié)合指定的水溶性聚合物的肟連接基團(tuán)的非天然賴氨酸。
但是，該蛋白是由具有四種線性(Succ-EDA)12基團(tuán)的分支型聚合物構(gòu)建體衍生得到的，而不是由SEP-1-L30的線型(Succ-EDA)18聚合物衍生得到的。衍生可以通過(guò)肟鍵而實(shí)現(xiàn)。
圖17是分支型水溶性聚合物GRFNP29(GP29)化學(xué)合成的圖解，該GP29通過(guò)肟型連接而結(jié)合到SEP-1-B50上，下文將對(duì)此進(jìn)行詳細(xì)描述。如圖17所示，一種呈直角保護(hù)的賴氨酸U-B前體被用于產(chǎn)生U-B組分GRFN17(GP17)，該組分的U基團(tuán)為氨氧酰基，并且具有3X賴氨酸分支核心B，該核心帶有四個(gè)懸垂巰基，用于隨后通過(guò)硫醚鍵與帶有琥珀酸殘基提供的懸垂羧酸酯的線型水溶性聚酰胺環(huán)氧乙烷構(gòu)建體GP29相結(jié)合。全長(zhǎng)產(chǎn)物的組裝是按照實(shí)施例2所述進(jìn)行的。SEP-1-B50的結(jié)構(gòu)如圖18所示。
A.攜帶巰基的模板GRFNP17的合成以0.4mmol數(shù)量級(jí)在酰胺生成(4-甲基)二苯甲胺(MBHA)-樹(shù)脂上手動(dòng)合成模板GRFNP17。用標(biāo)準(zhǔn)的耦聯(lián)方法(Schnlzer，M.，Int JPept Protein Res.(1992)40180-93)結(jié)合上Fmoc-Lys(Boc)-OH。使用了3.8ml含有2.1mmol氨基酸和10％DIEA的0.5M的HBTU；即5倍過(guò)量的氨基酸。在去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)之后，用標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸耦聯(lián)方法(3.8ml含有2.1mmol氨基酸和10％DIEA的0.5M的HBTU；即5倍過(guò)量的氨基酸)結(jié)合上Fmoc-Lys(Fmoc)-OH。在第二次去除Fmoc步驟之后，用標(biāo)準(zhǔn)的氨基酸耦聯(lián)方法(7.6ml含有4.2mmol氨基酸和10％DIEA的0.5M的HBTU；即相對(duì)于自由氨基5倍過(guò)量的氨基酸)結(jié)合上Fmoc-Lys(Fmoc)-OH。在最后的Fmoc去保護(hù)步驟之后，溶于DMF的5倍過(guò)量(相對(duì)于自由氨基)的S-乙酰巰基乙酸五氟苯酯(SAMA-oPfp)被結(jié)合30分鐘。去除C-末端賴氨酰殘基的側(cè)鏈Boc保護(hù)基團(tuán)，其方法是用含有10％DIEA的DMF清洗以中和樹(shù)脂，然后用純凈TFA分批清洗兩次各1分。將2mmol Boc-氨氧乙酸和2mmol N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶解在3m1的DMF中。在加入2mmol DIC(二異丙基碳二亞胺)之后，活化上述酸30-60分鐘。將所得溶液加入中性樹(shù)脂中，并結(jié)合1小時(shí)。最后，用溶于DMF的20％的哌啶去除S-聯(lián)乙酰基。在作為自由醛清除劑的半胱氨酸存在條件下，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Boc-化學(xué)方法(Schnlzer，M.，Int J Pept Protein Res.(1992)40180-93)，將該模板去保護(hù)并同時(shí)將其從樹(shù)脂支持物上裂解下來(lái)。將回收的溶于50％B[即含有0.1％TFA的50％的水性乙腈](不含醛)的聚酰胺冷凍并凍干。純化過(guò)程中，將模板粗產(chǎn)物溶于2ml 50％B，并加入100％A[即含有0.1％TFA的水]以稀釋樣品(因?yàn)楸厝灰砑尤?，所以?yīng)避免加入氯酸胍或醋酸鹽)。將該模板裝入在T＝40℃條件下用3％B平衡的C4制備型反相HPLC柱中。將鹽等度洗脫，再用線性梯度純化出所需的模板GRFNP17。用ES-MS對(duì)含有所需產(chǎn)物的組分進(jìn)行鑒定，然后合并，凍干。
B.分支型水溶性聚合物GRFNP29的合成合成分子量為15kDa的分支型(EDA-Succ)12聚合物GRFNP29，其方法是，將純化的含有巰基的模板GRFNP17與一種線型聚合物GRFNP31，即Br-乙酰基-(EDA-Succ)12羧酸酯，通過(guò)硫醚鍵形成連接，其中GRFNP31是按照標(biāo)準(zhǔn)方法(Rose，K.et al.，美國(guó)專利申請(qǐng)系列09/379,297；Rose，et al.，J Am Chem Soc.(1999)1217034)在Sasrin羧基生成樹(shù)脂上合成的。
將摩爾數(shù)1.3倍過(guò)量(對(duì)于總巰基)的純化的GRFNP31，即Br-乙?；?EDA-Succ)12，和純化的含有巰基的模板GRFNP17以～10mM的濃度共同溶解在0.1M Tris-HCl/6M氯酸胍中，pH8.7。溶解后，用pH8.7的0.1M Tris-HCl緩沖液將上述溶液稀釋3倍(v/v)。在室溫下攪拌該連接混合物，并用反相HPLC和ES/MS對(duì)該反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。根據(jù)需要添加額外的GRFNP31反應(yīng)物，直到所需反應(yīng)產(chǎn)物成為主要產(chǎn)物。為了激發(fā)反應(yīng)，添加3x(與連接混合物的體積比)0.1M醋酸鹽/6M氯酸胍中，pH4，然后將該溶液裝入制備型C4反相HPLC柱中，再用線性梯度進(jìn)行純化。用ES-MS對(duì)含有純凈GRFNP29構(gòu)建體的組分進(jìn)行鑒定，然后合并，凍干。
C.GRFN1776和GRFN1711與GRFNP29的肟化作用按照實(shí)施例2中的描述合成片段SEP14和片段SEP-11。以等摩爾比將片段SEP-14和GRFNP29共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。然后將該溶液凍干。將干粉裝入制備型反相HPLC柱(直徑為1英寸)中。利用制備型梯度C4反相HPLC將聚合物修飾的肽與未修飾肽及未反應(yīng)聚合物分離。用ES-MS鑒定含有所需肟化產(chǎn)物SEP-14+GP32的組分，并將各組分合并。
以等摩爾比將片段SEP-11和GRFNP29共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。然后將該溶液冷凍并凍干。將干粉溶解含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中，并裝入制備型GPC(凝膠滲透層析)柱(直徑為1英寸)中。利用等度洗脫將聚合物修飾的肽與未修飾肽及未反應(yīng)聚合物分離。用ES-MS鑒定含有所需肟化產(chǎn)物SEP-11+GP29的組分，并將各組分合并。
D.促紅細(xì)胞生成性合成蛋白SEP-1-B50的合成SEP-1-B50(SEQ ID NO2)是由四種多肽片段在溶液中合成的。
片段SEP-11+GP29(GRFN1711+GRFNP29，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的第1-32位殘基)APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA EH-硫酯(其中Lys24的ε-氨基經(jīng)通過(guò)乙酰-氨氧乙酰(Lev-AoA)肟鍵與GRFNP32結(jié)合的乙?；窟B接基團(tuán)修飾，表示為KOX)片段SEP-12(GRFN1712，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的第33-88位殘基)CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL
SEAVLRGQAL LVKSSQPW-硫酯(其中的Cys33被Acm所保護(hù))片段SEP-13(GRFN1713，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的第89-116位殘基)CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-硫酯(其中的Cys89被Acm所保護(hù))片段SEP-14+GP29(GRFN1716+GRFNP29，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的第117-166位殘基)CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR-羧酸酯(其中Lys126的ε-氨基經(jīng)通過(guò)乙酰-氨氧乙酰(Lev-AoA)肟鍵與GRFNP6結(jié)合的乙?；窟B接基團(tuán)修飾，表示為KOX，并且其中的C-末端半胱氨酸帶有一個(gè)吡啶甲基(pico)保護(hù)基團(tuán))除純化是在Resource Q柱中完成外，按照實(shí)施例1和2中的描述來(lái)完成附加肽的合成、連接、羧甲基化、保護(hù)基團(tuán)去除、折疊以及純化，以產(chǎn)生全長(zhǎng)的折疊的SEP-1-B50(SEQ ID NO2)。分析性反相HPLC色譜、折疊蛋白產(chǎn)物SEP-1-B50的ES-MS譜和CD光譜都證明折疊蛋白的存在。
實(shí)施例5促紅細(xì)胞生成性合成蛋白SEP-3-L42的合成進(jìn)行第五種促紅細(xì)胞生成性合成蛋白(命名為SEP-3-L42)的合成。全長(zhǎng)的SEP-3蛋白的氨基酸序列為APPRLICDSR VLERYLLEAK EAECITTGCA EHCSLNECITVPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALL SEAVLRGQALLACSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKEAISPPDAACAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO3)用馬來(lái)酰亞胺-功能化的(EDA-Succ)18(GRFNP32)聚合物單位(通過(guò)Michael加成反應(yīng))對(duì)第24、38、83和126位的半胱氨酸殘基進(jìn)行修飾，以形成SEP-3-L42。圖20顯示了SEP-3-L42的結(jié)構(gòu)。
圖19顯示了下文描述的化學(xué)合成SEP-3-L42的圖示說(shuō)明。簡(jiǎn)單地說(shuō)，圖19(A)和圖19(B)顯示了從SEP-31到SEP-34的四種SEP-3-L42的肽段的天然化學(xué)連接，從而在對(duì)應(yīng)于人EPO的所有四種天然糖基化位點(diǎn)的連接位點(diǎn)上產(chǎn)生了半胱氨酸。具體地說(shuō)，圖19(B)顯示了具有所有被保護(hù)的二硫化物型半胱氨酸的全長(zhǎng)多肽，可通過(guò)Michael加成反應(yīng)使四種帶電的線型水溶性聚合物(命名為GRFN32-馬來(lái)酰亞胺(GP32-馬來(lái)酰亞胺))在半胱氨酸連接位點(diǎn)發(fā)生位點(diǎn)特異性的聯(lián)接。此外，圖19(B)還顯示了二硫化物型半胱氨酸的最終去保護(hù)步驟，從而產(chǎn)生全長(zhǎng)的聚合物修飾的產(chǎn)物。
詳細(xì)地說(shuō)，SEP-3是由四種多肽片段在溶液中合成的片段SEP-31(GRFN1747，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO3的第1-37位殘基)APPRLICDSR VLERYLLEAK EAECITTGCA EHCSLNE-硫酯(其中Cys7、Cys29、和Cys33被Acm所保護(hù))片段SEP-32(GRFN1774，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO3的第38-82位殘基)CIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALLSEAVLRGQAL LA-硫酯(其中Cys38的側(cè)鏈被Acm所保護(hù))片段SEP-33(GRFN1749，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO3的第83-125位殘基)CSSQPWEP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQKEAISPPDAA-硫酯(其中Cys83的側(cè)鏈被Acm基團(tuán)所保護(hù))片段SEP-34(GRFN1750，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO3的第126-166位殘基)CAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLR GKLKLYTGEACRTGDR-羧酸酯(其中的Cys161被Pob[即4-(CH3S(O)-)芐基-]所保護(hù))肽的合成按照實(shí)施例1所述，利用確立的側(cè)鏈保護(hù)策略，用Boc化學(xué)SPPS的原位中和方法在硫酯生成樹(shù)脂上合成肽SEP-31、SEP-32和SEP-33，按照在上文中指出的特定肽來(lái)改變保護(hù)基團(tuán)策略。類似地，在-OCH2-Pam-樹(shù)脂上合成片段SEP-34。按照實(shí)施例1所述，將肽類去保護(hù)并同時(shí)將其從樹(shù)脂支持物上裂解下來(lái)。用制備型RF-HPLC進(jìn)行所得的上述肽類的純化。用ES-MS對(duì)含有純凈肽的組分進(jìn)行鑒定，合并并并且凍干以利于隨后的連接。
步驟1連接#1將片段SEP-34和SEP-33以15mM的濃度溶解在TFE中。加入含有6M氯酸胍和1％苯硫酚的飽和磷酸緩沖液(pH7.5)，則得到一種含有肽段的澄清溶液。連接反應(yīng)完成后，將連接混合物(定義為1體積)加入到2體積的{2ml TFE、6ml 6M氯酸胍和含有25％β-巰基乙醇的100mM磷酸鹽}的溶液中，并孵育20分鐘。用含有15mg/ml TCEP的冰醋酸酸化上述溶液，并裝入制備型C4反相HPLC柱上中，然后用線性梯度進(jìn)行純化。利用ES-MS對(duì)含有所需連接產(chǎn)物SEP-3Acm+SEP-33+SEP-34的組分進(jìn)行鑒定，并合并。
步驟2去除Acm#1去除Acm的方法是，用HPLC級(jí)水將含有SEP-3Acm+SEP-33+SE-34合并組分的水性乙腈溶液稀釋1倍，并加入固體脲，使其終濃度為2摩爾。加入摩爾數(shù)三倍過(guò)量(相對(duì)于預(yù)計(jì)的總半胱氨酸的濃度)的溶于3％的水性醋酸的30mg/ml醋酸汞溶液，并將所得溶液攪拌1小時(shí)。然后將該溶液以20％的濃度配制在β-巰基乙醇中，裝入半制備型C4反相HPLC柱中，并利用逐級(jí)梯度進(jìn)行純化。用ES-MS對(duì)含有所需產(chǎn)物SEP-33+SEP-34的組分進(jìn)行鑒定，并凍干過(guò)夜。
步驟3連接#2將等量的SEP-33+SEP-34和SEP-32以15mM的濃度共同溶解在純TFE(三氟乙醇)中。加入含有6M氯酸胍和1％苯硫酚的250mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)，則得到一種含有肽段的澄清溶液。在經(jīng)過(guò)1天的連接反應(yīng)之后，將連接混合物(定義為1體積)加入到2體積pH4的10ml TFE、10mlβ-巰基乙醇、10ml哌啶和20ml 6M氯酸胍的溶液中，并孵育20分鐘以去除所有殘余的保護(hù)基團(tuán)。用溶于20％的水性醋酸的15mg/ml TCEP溶液酸化上述溶液，并裝入制備型C4反相HPLC柱中，然后用線性梯度進(jìn)行純化。用ES-MS對(duì)含有所需連接產(chǎn)物SEP-3Acm+SEP-32+SEP-33+SEP-34的組分進(jìn)行鑒定，并凍干過(guò)夜。
步驟4去除Acm去除Acm的方法是，用HPLC級(jí)水將含有SEP-3Acm+SEP-32+SEP-33+SEP-34合并組分的水性乙腈溶液稀釋1倍，并加入固體脲，使其終濃度為2摩爾。加入摩爾數(shù)三倍過(guò)量(相對(duì)于預(yù)計(jì)的總半胱氨酸的濃度)的溶于3％的水性醋酸的30mg/ml醋酸汞溶液，并將所得溶液攪拌1小時(shí)。然后將該溶液以20％的濃度配制在β-巰基乙醇中，裝入C4半制備型反相HPLC柱中，并利用逐級(jí)梯度進(jìn)行純化。用ES-MS對(duì)含有所需產(chǎn)物SEP-32+SEP-33+SEP-34的組分進(jìn)行鑒定，并凍干過(guò)夜。
步驟5連接#3將等量的SEP-32+SEP-33+SEP-34和SEP-31以15mM的濃度共同溶解在純TFE中。加入含有6M氯酸胍和1％苯硫酚的250mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)，則得到一種含有肽段的澄清溶液。在經(jīng)過(guò)1天的連接反應(yīng)之后，將連接混合物(定義為1體積)加入到2體積pH4的10ml TFE、10mlβ-巰基乙醇、10ml哌啶和20ml6M氯酸胍的溶液中，并孵育20分鐘以去除所有殘余的保護(hù)基團(tuán)。用溶于20％的水性醋酸的15mg/ml TCEP溶液酸化上述溶液，并裝入制備型C4反相HPLC柱中，然后用線性梯度進(jìn)行純化。用ES-MS對(duì)含有所需連接產(chǎn)物SEP-31+SEP-32+SEP-33+SEP-34的組分進(jìn)行鑒定，并凍干過(guò)夜。
步驟6與聚合物GRFNP32連接按照制造商提供的方法，通過(guò)用BMPS(3-馬來(lái)酰胺丙酸NHS酯，Pierce，USA)將GRFNP32功能化來(lái)制備馬來(lái)酰亞胺-功能化的線型(EDA-Succ)18聚合物，該聚合物被稱為GRFNP32-馬來(lái)酰亞胺，則形成一種馬來(lái)酰亞胺-功能化的(EDA-Succ)18聚合物[即馬來(lái)酰亞胺-(EDA-Succ)18]。用盡可能少量的必須的TFE溶解SEP-31+SEP-32+SEP-33+SEP-34。將三倍過(guò)量的GRFNP32-馬來(lái)酰亞胺溶解在pH7.5的6M氯酸胍、10mM的磷酸鹽中，并加入到TFE溶液中。用分析型反相HPLC對(duì)Michael加成反應(yīng)的進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)控。反應(yīng)結(jié)束后，將上述溶液裝入C4制備型反相HPLC柱中，然后用線性梯度進(jìn)行純化。用ES-MS對(duì)含有所需聚合物修飾的產(chǎn)物SEP3Acm+SEP-31+SEP-32+SEP-33+SEP-34+pPEG[即連接的全長(zhǎng)為166個(gè)殘基的多肽鏈，該多肽鏈帶有與Cys24、Cys38、Cys83和Cys126的側(cè)鏈巰基相連的四拷貝的GRFNP32，因此也被稱為SEP3Acm+SEP-31+SEP-32+SEP-33+SEP-34+GP32]的組分進(jìn)行鑒定，并凍于過(guò)夜。
步驟7去除Pbo去除Pbo的方法是，將SEP3Acm+SEP-31+SEP-32+SEP-33+SEP-34+GP32的凍干粉末溶解在含有5％乙二硫醇的純TFA中。然后，通過(guò)添加10％苯甲硫醚和15％溴代三甲基硅烷30分鐘來(lái)裂解Pbo基團(tuán)。將上述溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中干燥，并溶解在含有1％TFA的水性乙腈中。將所得溶液裝入半制備型反相HPLC柱中，并利用逐級(jí)梯度進(jìn)行純化。用ES-MS對(duì)含有所需Cys161-去保護(hù)的產(chǎn)物SEP3Acm+SEP-31+SEP-32+SEP-33+SEP-34+GP32-Pbo的組分進(jìn)行鑒定，并凍干過(guò)夜。
步驟8去除Acm將Acm從Cys7、Cys29和Cys33側(cè)鏈最終去除的方法是，用HPLC級(jí)水將含有SEP3Acm+SEP-31+SEP-32+SEP-33+SEP-34+GP32-Pbo合并組分的水性乙腈溶液稀釋1倍，并加入固體脲，使其終濃度為2摩爾。加入摩爾數(shù)三倍過(guò)量(相對(duì)于預(yù)計(jì)的總半胱氨酸的濃度)的溶于3％的水性醋酸的30mg/ml醋酸汞溶液，并將所得溶液攪拌1小時(shí)。然后將該溶液以20％的濃度配制在β-巰基乙醇中，裝入半制備型C4反相HPLC柱中，并利用逐級(jí)梯度進(jìn)行純化。用ES-MS對(duì)含有所需聚合物修飾修飾產(chǎn)物SEP-3(1-166)的組分進(jìn)行鑒定，并凍干過(guò)夜。
步驟9折疊將全長(zhǎng)的連接產(chǎn)物SEP-3(1-166)溶解在含有6M氯酸胍和20％TFE以及摩爾數(shù)十倍過(guò)量(相對(duì)于蛋白中的Cys殘基)的半胱氨酸的200mM的Tris緩沖液(pH8.7)中。該溶液在含有3M氯酸胍的濃度為200mM的Tris緩沖液(pH8.7)中室溫透析過(guò)夜。再將該溶液在含有1M氯酸胍的濃度為200mM的Tris緩沖液(pH8.7)中4℃透析4小時(shí)，最后將該溶液在10mM磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中4℃透析4小時(shí)，從而得到最終的折疊產(chǎn)物。用電噴射ES-MS和CD光譜測(cè)定法來(lái)證實(shí)折疊。
步驟10純化用Centricon濃縮管將上述折疊多肽濃縮5倍，并裝入經(jīng)pH7.0的10mM磷酸鹽緩沖液平衡的Resource S陽(yáng)離子交換柱中。用至500mM NaCl的線性鹽梯度將折疊蛋白在10分鐘內(nèi)洗脫下來(lái)。用SDS-PAGE對(duì)含有所需折疊產(chǎn)物SEP-3-L42的組分進(jìn)行鑒定，并于-80℃冷凍貯存。
實(shí)施例6促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的生物活性測(cè)定用UT/7和32D 103197細(xì)胞系來(lái)進(jìn)行折疊的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白、SEP-0、SEP-1-L26、SEP-1-L30、SEP-1-B50和SEP-3-L42的生物活性的檢測(cè)，在因子-依賴性細(xì)胞系增殖測(cè)試中使用商品化的重組促紅細(xì)胞生成素作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)。UT-7是人巨核母細(xì)胞白血病細(xì)胞系，該細(xì)胞系在生長(zhǎng)和存活方面對(duì)白介素-3、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)或促紅細(xì)胞生成素(EPO)中之一具有絕對(duì)的依賴性(MiuraY，et al.，Acta Haematol(1998)99180-184；Komatsu N，et al.，Cancer Res.(1991)51341-8)。32D 103197是鼠造血細(xì)胞系(Metcalf，D.Int J Cell Clining(1992)10116-25)。
在Iscove’s改良型Dulbecco’s培養(yǎng)基(IMDM)、10％FBS(胎牛血清)、谷氨酰胺和Penstrep中配制SEP構(gòu)建體的儲(chǔ)液，并且將這些儲(chǔ)液的2x稀釋液順次地加入到多孔板中，多孔板中已添加了濃度為5000個(gè)細(xì)胞/的人UT/7 EPO細(xì)胞。在5％CO2存在條件下，37℃培養(yǎng)這些多孔板，并每天監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。四天后，在多孔板中添加20μl溶于PBS(磷酸鹽緩沖液)的2.5mg/ml的MTT(甲基噻唑四唑)并孵育4小時(shí)。加入150μl的IPA，并在562nm下，讀出每個(gè)孔的光吸收值。測(cè)定SEP化合物的ED50(達(dá)到最大效果的50％的有效劑量)值，并將其與CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)-細(xì)胞產(chǎn)生的rhEPO(重組人促紅細(xì)胞生成素)的ED50值比較。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果都證明所有的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白均顯示出生物活性。表VI中給出了SEP-0、SEP-1-L26、SEP-1-L30和SEP-1-B50的ED50測(cè)定結(jié)果。
表VI

當(dāng)僅用通過(guò)聚合物修飾的SEP-1-L30的吸光度來(lái)計(jì)算蛋白濃度的消光系數(shù)使肽含量標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)，表VII和圖26給出了這些實(shí)驗(yàn)中、SEP-1-L26、SEP-1-L30、SEP-1-B50、SEP-3-L42和SEP-1-B51(下文實(shí)施例7中描述了SEP-1-B51化合物的合成)的其他結(jié)果?？偟膩?lái)說(shuō)，這些體外測(cè)試證明了聚合物結(jié)構(gòu)和結(jié)合位點(diǎn)的不同會(huì)對(duì)體外的生物活性造成不同的影響，其中這些化合物的效力具有如下相對(duì)次序(1)當(dāng)測(cè)試人EPO受體活性時(shí)為(從最強(qiáng)到最弱)SEP-1-L26≈SEP-1-L30＞SEP-1-B50≈SEP-1-B51＞SEP-3-L42＞SEP-0；以及(2)當(dāng)測(cè)試鼠EPO受體活性時(shí)為(從最強(qiáng)到最弱)SEP-1-L26＞SEP-1-L30＞SEP-0＞SEP-3-L42＞SEP-1-B50≈SEP-1-B51。
表VII

此外，表VII和圖26中的結(jié)果還表明，與未被聚合物修飾的構(gòu)建體SEP-0相比，聚合物修飾的SEP構(gòu)建體在受體選擇上有顯著的差異。具體地說(shuō)，SEP-1-L26被不同的線型聚合物修飾，這些聚合物連接在對(duì)應(yīng)于人EPO糖基化位點(diǎn)的第24位上(該位點(diǎn)結(jié)合了具有懸垂負(fù)電荷的5.5kDa的線型聚合物)；該構(gòu)建體對(duì)人和鼠受體的活性較小。在對(duì)應(yīng)于人EPO糖基化位點(diǎn)的第24和126位上，SEP-1-L30被具有懸垂負(fù)電荷的5.5kDa的線型聚合物修飾；該構(gòu)建體對(duì)人受體的活性比對(duì)鼠受體的活性高出約5倍。在對(duì)應(yīng)于人EPO糖基化位點(diǎn)的第24、38、83和126位上，SEP-3-L42被具有懸垂負(fù)電荷的5.5kDa的線型聚合物修飾，該構(gòu)建體對(duì)人受體的活性比對(duì)鼠受體的活性高出約10倍。發(fā)現(xiàn)差異最大的是SEP-1-B50和SEP-1-B51，它們都被分支的、電負(fù)性15kDa的聚合物修飾，這些聚合物連接在對(duì)應(yīng)于人EPO糖基化位點(diǎn)的第24和126位上，并且具有大約5的p1(與人EPO近似)；這兩種構(gòu)建體對(duì)人受體的活性比對(duì)鼠受體的活性高出～60倍。
由于鼠EPO缺失了對(duì)應(yīng)于人EPO第126位的糖基化位點(diǎn)(鼠EPO具有非糖基化的脯氨酸，而不具有在人EPO中發(fā)現(xiàn)的O-糖基化的絲氨酸)，該變化的受體活性可能部分歸因于這種差異，并且因此鼠受體優(yōu)先選擇在對(duì)應(yīng)于第126位上缺失了O-聯(lián)糖基化的EPO。該結(jié)果同SEP-1-L26與SEP-1-L30和SEP-1-B50與SEP-1-B52的比較結(jié)果一致。例如，SEP-1-L26的第126位具有一種1.8kDa的電負(fù)性聚合物，而SEP-1-L30的第126位具有一種5.5kDa的電負(fù)性聚合物。盡管對(duì)人EPO受體有相同的活性，但是發(fā)現(xiàn)對(duì)鼠EPO受體則存在4倍的差異。發(fā)現(xiàn)差異最大的是SEP-1-B50和SEP-1-B51構(gòu)建體，在對(duì)應(yīng)于人EPO糖基化位點(diǎn)的第126位上連接了電負(fù)性15kDa的聚合物。如同SEP-3-L42，在對(duì)應(yīng)于人EPO的所有四種天然糖基化位點(diǎn)即24、38、83和126上加入了5.5kDa的電負(fù)性聚合物，使對(duì)鼠受體的選擇性更大程度地降低，但這種降低程度比SEP-1-B50和SEP-1-B51構(gòu)建體小。這些結(jié)果證明，可以通過(guò)對(duì)相應(yīng)于生物產(chǎn)生的糖基化蛋白中糖基化位點(diǎn)的位點(diǎn)進(jìn)行精確修飾來(lái)調(diào)節(jié)受體特異性，也可以通過(guò)調(diào)整聚合物的大小、分支的性質(zhì)以及電荷來(lái)調(diào)節(jié)受體特異性。
實(shí)施例7促紅細(xì)胞生成性合成蛋白SEP-1-B51的合成A.SEP-1-B51的組成。合成了第六種促紅細(xì)胞生成性合成蛋白(命名為SEP-1-B51)。全長(zhǎng)SEP-1-B51的氨基酸序列與SEP-1-B50相同APPRLICDSRVLERYLLEAKEAEKOXITTGCA EHCSLNEKITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVKSSQPWψP LQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKψAISPPDAAKOXAAPL RTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO2)其中ψ特指含有經(jīng)羧甲基化的巰基的半胱氨酸的非天然氨基酸殘基，其中KOX特指其ε-氨基經(jīng)化學(xué)修飾連接了以肟鍵結(jié)合指定的水溶性聚合物的肟連接基團(tuán)的非天然賴氨酸。
但是，與SEP-1-B50相比，該蛋白是由具有四種線型(Succ-TTD)12-Succ-丙胺酸-OH[即(Succ-TTD)12-Succ-Ala-OH，或(Succ-TTD)12Succ-Ala]聚合物的分支型聚合物構(gòu)建體衍生得到的，這四種線型聚合物通過(guò)酰胺鍵接合到賴氨酸的分支核心上。設(shè)計(jì)將線型聚合物通過(guò)酰胺鍵耦聯(lián)到分支核心上是為了提高穩(wěn)定性。此外，上述四種聚合物還被設(shè)計(jì)攜帶丙氨酸基團(tuán)和懸垂的負(fù)電荷，帶有負(fù)電荷是為了模擬唾液酸，而帶有丙氨酸則是為了具有與糖鏈的懸垂糖基相似的疏水性質(zhì)。此外，分支型聚合物還被設(shè)計(jì)具有一種位于分支核心和蛋白骨架連接位點(diǎn)間的水溶性間隔物，以提高分支核心模板的合成和操作特性，并且也模擬了在天然糖鏈中發(fā)現(xiàn)的位于糖與蛋白骨架連接位點(diǎn)和糖鏈第一個(gè)分支點(diǎn)之間的間隔物。
圖21是分支型水溶性聚合物GRFNP41(GP41)化學(xué)合成的圖解，該GP41通過(guò)肟型連接而結(jié)合到SEP-1-B51上，下文將對(duì)此進(jìn)行詳細(xì)描述。全長(zhǎng)產(chǎn)物的組裝是按照實(shí)施例2所述進(jìn)行的。SEP-1-B51的結(jié)構(gòu)如圖22所示。
B.用以與分支模板(GRFNP40)結(jié)合的(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)的合成以0.5mmol數(shù)量級(jí)在Sasrin酸流動(dòng)型羧酸-生成樹(shù)脂上合成線型聚合物(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)。將0.5mmole(～0.5克)的Sasrin酸流動(dòng)型羧酸-生成聚苯乙烯樹(shù)脂(羥基取代1.02mmole/g)在DMF中溶脹15分鐘，然后排干液體。將溶于8ml含有500μl(3.9mmole)DIEA(二異丙基乙胺)的DMF的450mg(4.5mmole)琥珀酐和488mg(4mmole)4-二甲氨基嘧啶加入到羥基-功能化樹(shù)脂中，并劇烈攪拌使反應(yīng)進(jìn)行30分鐘，然后排干液體。重復(fù)連接反應(yīng)，并通過(guò)使用DMF(～50ml)攪拌流動(dòng)清洗1分鐘來(lái)去除過(guò)量的反應(yīng)物和可溶的副產(chǎn)物，然后排干液體?；罨疕OOC-CH2CH2CO-O-樹(shù)脂(0.5mmole)，其方法是添加8ml新制的溶于DMF的1.0M(8mmole)CDI(羰基二咪唑)溶液，并使其反應(yīng)40分鐘，然后排干液體。通過(guò)使用DMF(～50ml)攪拌流動(dòng)清洗1分鐘來(lái)去除過(guò)量的反應(yīng)物和可溶的副產(chǎn)物，然后排干液體。再加入溶解在4ml的溶于DMF的0.5M(2mmole)HOBT溶液的4ml(4克，1 8.2mmole)(4，7，10)-三氧十三烷-1，13二胺(TTD)，并劇烈攪拌使反應(yīng)進(jìn)行30分鐘，然后排干液體。通過(guò)使用DMF(～50ml)攪拌流動(dòng)清洗1分鐘來(lái)去除過(guò)量的反應(yīng)物和可溶的副產(chǎn)物，然后排干液體。在樹(shù)脂中添加溶解于8ml含有500μl(3.9mmole)DIEA(二異丙基乙胺)的HOBT(N-羥苯三唑)的琥珀酐(450mg，4.5mmole)，并劇烈攪拌使反應(yīng)進(jìn)行15分鐘，然后排干液體。將上述三個(gè)步驟(CDI活化；TTD耦聯(lián)；琥珀酐反應(yīng))重復(fù)11次[即總共進(jìn)行12次]。通過(guò)使用DMF(～50ml)攪拌流動(dòng)清洗1分鐘來(lái)去除過(guò)量的反應(yīng)物和可溶的副產(chǎn)物，然后排干液體。用8ml新制的溶于DMF的1.0M(8mmole)CDI溶液活化HOOC-CH2CH2CO(TTD-琥珀酰)12-O-樹(shù)脂(0.5mmole)，并使其反應(yīng)40分鐘，然后排干液體。通過(guò)使用DMF(～50ml)攪拌流動(dòng)清洗1分鐘來(lái)去除過(guò)量的反應(yīng)物和可溶的副產(chǎn)物，然后排干液體。將2.5mmole H-AlaOtBu.HCl溶解于4.75ml含有150μl(111mg，0.825mmole)DIEA的溶于DMF中的0.5M(2.375mmole)HOBT中，并劇烈攪拌以使其與CDI-活化的HOOC-CH2CH2CO(TTD-琥珀酰)12-O-樹(shù)脂(0.5mmole)反應(yīng)1小時(shí)，然后排干液體。用DCM(二氯甲烷)徹底清洗產(chǎn)物tertBuOOC-CH(CH3)-NH-OC-CH2CH2CO(TTD-琥珀酰)12-O-樹(shù)脂，排干液體，然后在真空中將樹(shù)脂干燥至恒重。產(chǎn)物-樹(shù)脂通常重約2克。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc-化學(xué)方法，用溶于DCM的4％的TFA將線型(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu聚合物從樹(shù)脂支持物上裂解下來(lái)。將沉淀粗產(chǎn)物溶解于含有1％TFA的50％的水性乙腈中，并凍干。少量含有1％TFA的50％的水性乙腈溶解凍干聚合物并稀釋，使有機(jī)物的濃度低于1％。將該粗產(chǎn)物裝入在T＝40℃條件下用3％B平衡的C4制備型反相柱中。將鹽等度洗脫，再用20-35％的Buffer B(含有1％TFA的50％的水性乙腈)對(duì)0.1％水性TFA的線性梯度以超過(guò)60分鐘的時(shí)間進(jìn)行所需的模板的純化。用ES-MS對(duì)含有所需物質(zhì)(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)的組分進(jìn)行鑒定，冷凍并凍干。
C.攜帶了用以形成分支的多個(gè)氨基和用以(后續(xù))與蛋白連接的被保護(hù)的氨氧基的模板的合成(GRFNP40)以0.4mmol數(shù)量級(jí)在Sieber酰胺生成樹(shù)脂上手動(dòng)合成模板GRFNP40。在每一步連接、去保護(hù)和活化步驟之間都進(jìn)行一次1分鐘的流動(dòng)-清洗步驟。將2mmol Nα-Fmoc-Nβ(Boc-氨氧乙?；?-L-二氨基丙酸結(jié)合到樹(shù)脂上1小時(shí)，其中使用的是經(jīng)溶于DCM/DMF(二甲基甲酰胺)的2mmol DIC和2mmol NHS預(yù)活化NHS-酯30分鐘的樹(shù)脂。在去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)(2×3分鐘，溶于DMF中的20％的哌啶)和清洗之后，在樹(shù)脂中添加溶解于8ml含有2.2mmol DIEA的HOBT(N-羥苯三唑)中的琥珀酐4mmol。該步驟后，用8ml溶于DMF中的新制的0.5M(4mmole)的CDI活化羧基。在4ml溶于DMF中的0.5M的HOBT中添加4ml(18.2mmole)TTD，并結(jié)合30分鐘。
將Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(2mmol)結(jié)合到所得的氨基-TTD-Succ-Dpr(BocAoA)-樹(shù)脂上，其中使用的是經(jīng)溶于DMF中的2mmol DIC和2mmol NHS預(yù)活化30分鐘的樹(shù)脂，并結(jié)合14小時(shí)。將該結(jié)合反應(yīng)重復(fù)一次。在去除Fmoc步驟(2×3分鐘，溶于DMF中的20％的哌啶)后，如上所述將4mmol Fmoc-Lys(Fmoc)-OH(2mmol)結(jié)合到樹(shù)脂上，包括重結(jié)合。在最后一次Fmoc保護(hù)步驟(2×3分鐘，溶于DMF中的20％的哌啶)后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc-化學(xué)方法，用溶于DCM中的4％的TFA將模板從樹(shù)脂支持物上裂解下來(lái)，并凍干。將沉淀粗產(chǎn)物溶解于含有1％TFA的50％的水性乙腈中，并凍干。用少量的含有1％TFA的50％的水性乙腈溶解凍干聚合物并稀釋，使有機(jī)物的濃度低于1％。將該模板裝入在T＝40℃條件下用3％B(含有1％TFA的乙腈)平衡的C4制備型反相HPLC柱中。將鹽和其他非酰胺物質(zhì)等度洗脫，再用5-12％的BufferB(含有1％TFA的乙腈)對(duì)0.1％水性TFA的線性梯度以超過(guò)60分鐘的時(shí)間進(jìn)行所需的模板的純化。用ES-MS對(duì)含有所需Lys-Lys(Lys)-TTD-Succ Dpr(BocAoA)酰胺物質(zhì)(GRFNP40)的組分進(jìn)行鑒定，冷凍并凍干。
D.酰胺-耦聯(lián)的分支型聚合物(GRFNP41)的組裝和去保護(hù)合成分子量為16kDa的分支型(TTD-Succ)49聚合物GRFNP41，其方法是，將GRFNP39[(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu]與純化的模板GRFNP40耦聯(lián)。在存在20倍(摩爾)過(guò)量的DIEA的條件下，用以10mg/ml的濃度溶解在DMSO中的0.95mole的HATU{0-(7-氮苯三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲銨六氟磷酸鹽}活化純化的(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)(1.0mmole)，其中的GRFNP39在60℃條件下，以20mg/ml的濃度溶解在DMSO(二甲基亞砜)中。立即加入以3.9mg/ml的濃度溶解在DMSO中的純化的模板GRFNP40(0.24mmole)。用C4分析型反相HPLC和ES-MS對(duì)反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)控。通常，連接反應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)就能完成。為了激發(fā)反應(yīng)，添加4倍體積(相對(duì)于連接混合物的體積)pH4的0.1M醋酸鹽/6M氯酸胍，然后將該溶液裝入制備型(C4)反相HPLC柱中，將鹽和其他不含有酰胺的物質(zhì)等度洗脫，再用25-30％的Buffer B(含有1％TFA的乙腈)對(duì)0.1％水性TFA的線性梯度在80分鐘內(nèi)完成所需分支型聚合物的純化。用ES-MS對(duì)含有所需物質(zhì)的組分進(jìn)行鑒定，冷凍并凍干。
將所得的純化聚合物以1mg/ml的濃度溶解在純TFA中1小時(shí)，以使Boc基團(tuán)從氨氧乙?；鶊F(tuán)上去除，并且也使叔丁基酯基團(tuán)從-Ala-OtBu基團(tuán)上去除。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將上述溶液旋轉(zhuǎn)干燥，再將干燥的聚合物溶解在50％的Buffer B(含有1％TFA的乙腈)中。添加氨氧乙酸(a.k.a.‘羧甲氧胺’)，并使其終濃度為0.5M，以清除絡(luò)合形成的雜質(zhì)。20分鐘后，用3.3體積的Buffer A(溶于水中的0.1％的TFA)稀釋上述溶液，并裝入制備型C4反相HPLC柱中，用泵抽吸10％的Buffer B，直到去除所有的氨氧乙酸，然后用15-45％的Buffer B對(duì)0.1％水性TFA的逐級(jí)梯度以超過(guò)80分鐘的完成聚合物的純化。將含有所需分支型聚合物(GRFNP41)的合并組分冷凍并凍干。
E.肽段GRFN1776和GRFN1711與分支型聚合物GRFNP41的肟型連接(肟化作用)按照上文實(shí)施例1所述，用Boc化學(xué)SPPS的標(biāo)準(zhǔn)原位中和方法合成片段SEP-14(GRFN1776；包括SEQ ID NO2的第117-166位殘基)和片段SEP-11(GRFN1711；包括SEQ ID NO2的第1-32位殘基)。按照上文描述的標(biāo)準(zhǔn)方法，在-OCH2-Pam-樹(shù)脂上合成肽GRFN1776。按照上文描述的標(biāo)準(zhǔn)方法，在硫酯生成樹(shù)脂上合成肽GRFN1711。以等摩爾比將在Lys126上含有乙?；；鶊F(tuán)的片段GRFN1776和含有AoA的片段GRFNP41共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。將該溶液凍干。將干粉粗產(chǎn)物重溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中，并裝入制備型反相(C4)HPLC柱中。利用制備型梯度反相HPLC將聚合物修飾的肽與未修飾肽及未反應(yīng)聚合物分離。用ES-MS對(duì)含有所需肟鍵合(肟化)的產(chǎn)物SEP-14+GP41的組分進(jìn)行鑒定，并且合并，凍干。
以等摩爾比將在Lys24上含有乙?；；鶊F(tuán)的片段GRFN1711和含有AoA的片段GRFNP41共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。將該溶液冷凍并凍干。將干粉溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中，并裝入C4制備型反相HPLC柱中。利用制備型梯度洗脫C4反相HPLC將聚合物修飾的肽與未修飾肽及未反應(yīng)聚合物分離。用ES-MS對(duì)含有所需肟鍵合(肟化)的產(chǎn)物SEP-11+GP41的組分進(jìn)行鑒定，并且合并，凍干。
F.促紅細(xì)胞生成性合成蛋白SEP-1-B51的合成SEP-1-B51(SEQ ID NO2)是由四種多肽片段在溶液中合成的。
片段SEP-11+GP41(GRFN1711+GRFNP41，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的第1-32位殘基)
APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA EH-硫酯(其中Lys24的乙?；；鶓掖够鶊F(tuán)以肟鍵與分支型聚合物GRFNP41結(jié)合，表示為KOX；并且其中的His32被Dnp所保護(hù))片段SEP-12(GRFN1712，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的第33-88位殘基)CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALLSEAVLRGQAL LVKSSQPW-硫酯(其中的Cys33被Acm所保護(hù)；并且其中的三個(gè)Trp殘基被甲酸基所保護(hù))片段SEP-13(GRFN1713，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的第89-116位殘基)CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-硫酯(其中的Cys89被Acm所保護(hù)；并且其中的His94被Dnp所保護(hù))片段SEP-14+GP41(GRFN1716+GRFNP41，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的第117-166位殘基)CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLRGKLKLYTGEA CRTGDR-羧酸酯(其中的C-末端半胱氨酸(即Cys161)帶有一個(gè)吡啶甲基(pico)保護(hù)基團(tuán)；并且其中Lys126的乙酰基丙?；鶓掖够鶊F(tuán)以肟鍵與分支型聚合物GRFNP41結(jié)合，表示為KOX)除了以下調(diào)整外，均按照實(shí)施例1-4中的描述來(lái)完成附加肽的合成、連接、羧甲基化、保護(hù)基團(tuán)去除、折疊以及純化，以產(chǎn)生全長(zhǎng)的折疊的SEP-1-B51(SEQ ID NO2)。
步驟1連接#1將片段SEP-14+GP41以3mM的濃度溶解在TFE中(1體積)。將片段SEP-13以2.25mM的濃度溶解在2體積含有6M氯酸胍的濃度為300mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.9)中。將上述兩種溶液混合，使片段SEP-14+GP41的終濃度為1mM，SEP-13的終濃度為1.5mM，然后加入1％苯硫酚，則得到一種pH為6.8-7.2的肽段溶液(‘3體積’)。在室溫條件下使反應(yīng)過(guò)夜進(jìn)行。連接反應(yīng)完成后，在連接混合物中添加β-巰基乙醇(3體積)，再添加3體積pH為7.9的含有6M氯酸胍的濃度為300mM的磷酸鈉緩沖液和TCEP(肽段總重量的0.25倍)，并攪拌溶液20分鐘。用0.6體積的冰醋酸使上述溶液酸化至pH為4.0+/-0.1，從而得到一種澄清溶液，在該溶液中添加了30體積的pH為4.0的含有6M氯酸胍的濃度為100mM的醋酸鈉稀釋緩沖液。將所得溶液用泵抽入制備型反相(C4)HPLC柱中，然后用25-45％的Buffer B梯度以超過(guò)80分鐘的時(shí)間進(jìn)行連接產(chǎn)物的純化。利用電噴射質(zhì)譜對(duì)含有所需連接產(chǎn)物(Cys89(Acm)){SEP-13+SEP-14+GP41}的組分進(jìn)行鑒定，并將各組分合并。
步驟2去除Acm#1去除Acm的方法是，用HPLC級(jí)水將含有(Cys89(Acm)){SEP-13+SE-14+GP41}合并組分的水性乙腈溶液稀釋1倍，并加入固體脲，使其終濃度為2摩爾。加入摩爾數(shù)三倍過(guò)量(相對(duì)于預(yù)計(jì)的總半胱氨酸的濃度)的溶于3％的水性醋酸的30mg/ml醋酸汞溶液，并將所得溶液攪拌1小時(shí)。然后將該溶液以20％的濃度配制在β-巰基乙醇中，裝入半制備型反相HPLC柱上，并用泵抽吸25％的Buffer B，直到洗脫所有的非肽物質(zhì)，然后利用50％Buffer B的逐級(jí)梯度對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化。利用電噴射質(zhì)譜對(duì)含有所需連接產(chǎn)物{SEP-13+SEP-14+GP41}的組分進(jìn)行鑒定，并將各組分合并。用ES-MS對(duì)所需產(chǎn)物SEP-03+SP.-04進(jìn)行鑒定，并合并，凍干。
步驟3連接#2將步驟2得到的{SEP-13+SEP-14+GP41}產(chǎn)物[即1713-1776-GP41]以3mM的濃度溶解在TFE中(1體積)。將片段SEP-12(GRFN1712)以2.25mM的濃度溶解在2體積含有6M氯酸胍的濃度為300mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.9)中。將上述兩種溶液混合，使片段{SEP-13+SEP-14+GP41}的終濃度為1mM，而SEP-12的終濃度為1.5mM，然后加入1％苯硫酚，則得到一種pH為6.8-7.2的肽段溶液(‘3體積’)。在室溫條件下使反應(yīng)過(guò)夜進(jìn)行。然后在連接混合物中添加3體積的稀釋緩沖液(即相對(duì)于前面所用TFE的體積)pH為4.0的含有6M氯酸胍的濃度為100mM的醋酸鈉，然后將其加入到冷卻至4℃的含有3體積TFE、3體積β-巰基乙醇、3體積哌啶和6體積pH為4.0的含有6M氯酸胍的濃度為100mM的醋酸鈉溶液中，室溫?cái)嚢?0分鐘以去除所有的殘余保護(hù)基團(tuán)。用1.8體積冷凍的冰醋酸使上述溶液酸化，其中添加了TCEP(肽段總重量的0.25倍)，從而得到一種澄清溶液，將該溶液孵育20分鐘。然后在該溶液中添加30體積的pH為4.0的含有6M氯酸胍的濃度為100mM的醋酸鈉稀釋緩沖液，混合該溶液。將所得溶液用泵抽入制備型反相(C4)HPLC柱中。然后抽吸30％C(Buffer C溶于60％異丙醇/30％乙腈/10％水的0.1％的TFA)緩沖液，直到所有的非肽物質(zhì)都從柱中洗脫，然后利用37-57％Buffer C的梯度以超過(guò)80分鐘的時(shí)間進(jìn)行連接產(chǎn)物的純化。用ES-MS對(duì)含有所需連接產(chǎn)物(Cys33(Acm)){SEp-12+SEP-13+SEP-14+GP41}的組分進(jìn)行鑒定，并合并，凍干。
步驟4Cys89和Cys117殘基的羧甲基化將(Cys33(Acm)){SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41}[即(Cys33(Acm))-1712-1713-1776-GP41]以1mM的濃度溶解在TFE中。添加10體積含有6M氯酸胍的濃度為300mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.9)。加入25倍過(guò)量(相對(duì)于巰基)的以75mg/ml濃度溶解在甲醇中的溴代乙酸，并在攪拌條件下，使上述溶液室溫反應(yīng)2小時(shí)。然后用11體積的含有6M氯酸胍的濃度為100mM的醋酸鈉稀釋反應(yīng)混合物，并裝入制備型反相HPLC柱中，然后抽吸20％Buffer C，直到所有非肽成分被洗脫，然后再用至55％Buffer C的逐級(jí)梯度進(jìn)行純化。用ES-MS對(duì)含有所需修飾產(chǎn)物(Cys33(Acm)；ψ89，117){SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41}的組分進(jìn)行鑒定，并合并，凍干。
步驟5去除吡啶甲基在2M HCl中活化鋅粉(每毫克肽71毫克鋅粉)5分鐘，并重復(fù)一次活化反應(yīng)，然后用6M氯酸胍、含有(臨用前加入)35mg/ml L-甲硫氨酸和35mg/ml十二烷基肌氨酸鈉的pH為2.2的50mM甘氨酸以及10％v/vTFE清洗鋅10分鐘以去除過(guò)量的酸。重復(fù)一次清洗。將含有Cys161(Pico)的肽(Cys33(Acm)；ψ89，117){SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41}以30mg/ml的濃度溶解在純TFE中。用4體積(相當(dāng)于TFE)的6M氯酸胍、含有(臨用前加入)35mg/mlL-甲硫氨酸和35mg/ml十二烷基肌氨酸鈉的pH為2.2的50mM甘氨酸以及10％v/vTFE將上述溶液稀釋。再向溶液中加入活化的鋅粉，并室溫?cái)嚢?0分鐘。通過(guò)樣品(經(jīng)等體積的β-巰基乙醇和幾格令的TCEP處理，然后用2體積的6M氯酸胍和100mM醋酸鈉稀釋后再用于分析)的分析型C4反相HPLC每間隔～1小時(shí)對(duì)反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)控，并且在2-5小時(shí)后結(jié)束反應(yīng)。在完成吡啶甲基的去除后，可通過(guò)對(duì)分析型HPLC峰的ES-MS分析來(lái)指示(即分子量減小91Da)，用過(guò)濾法去除上清，并且用6M氯酸胍，pH4、含有35mg/ml L-甲硫氨酸的100mM醋酸鹽和含有20％TFE的35mg/ml十二烷基肌氨酸清洗殘余鋅粉3次。在混合的上清中添加BioRad SM-2微珠(約為溶液體積的1/3)，清洗并室溫?cái)嚢?0分鐘，然后過(guò)濾。以10％v/v的濃度添加β-巰基乙醇，再加入0.25x(混合的肽重量)的TCEP，室溫?cái)嚢?分鐘。用等體積的pH4.0的100mM的醋酸鈉、6M氯酸胍按1∶1稀釋上述溶液，并裝入制備型(C4)反相HPLC柱中，用泵抽吸35％的Buffer C，直到洗脫所有的非肽物質(zhì)，再用55％Buffer C的逐級(jí)梯度進(jìn)行所需產(chǎn)物的純化。用電噴射質(zhì)譜對(duì)含有所需Cys161-去保護(hù)產(chǎn)物(Cys33(Acm)；ψ89，117){SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41-Pico}的組分進(jìn)行鑒定，并合并。
步驟6去除Acm#2用HPLC級(jí)水將含有(Cys33(Acm)；ψ89，117){SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41-Pico}[即(Cys33(Acm)；ψ89，117)-1712-1713-1776-GP41]的合并組分稀釋3倍，并加入固體脲，使其終濃度為2摩爾。加入摩爾數(shù)三倍過(guò)量(相對(duì)于總半胱氨酸的濃度)的溶于3％的水性醋酸的30mg/ml醋酸汞溶液，并將所得溶液室溫?cái)嚢?小時(shí)。然后將該溶液以20％的濃度配制在β-巰基乙醇中，并裝入半制備型(C4)反相HPLC柱中。用泵抽吸Buffer C(20％)，直到洗脫所有的非肽物質(zhì)，然后利用55％Buffer C的逐級(jí)梯度對(duì)所需產(chǎn)物進(jìn)行純化。利用電噴射質(zhì)譜對(duì)含有所需產(chǎn)物(Cys33(Acm)；ψ89，117){SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41-Pico}的組分進(jìn)行鑒定，再用含有2x(w/w相對(duì)于肽的質(zhì)量)DPC(十二烷基膽堿磷酸)的水將其稀釋2倍(v/v)，并凍干過(guò)夜。
步驟7連接#3將(Cys33(Acm)；ψ89，117) {SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41-Pico}[即(Cys33(Acm)；ψ89，117)-1712-1713-1776-GP41]以3mM的濃度溶解在純TFE中(1體積)。將SEP-11[即1711-GP41]溶解在2體積含有6M氯酸胍的300mM磷酸鹽緩沖液(pH7.9)中，并加入1％苯硫酚。室溫條件下，將連接混合物攪拌過(guò)夜。在上述溶液中添加3體積(相對(duì)于前面所用TFE的體積)的β-巰基乙醇和9體積的連接緩沖液(含有6M氯酸胍的pH7.9的300mM的磷酸鹽緩沖液)。在溶液中添加0.25x(混合的肽重量)TCEP，然后將該溶液室溫?cái)嚢?0分鐘。加入冰醋酸(0.6體積)將溶液酸化至pH4.0，然后加入30體積的含有6M氯酸胍的pH4.0的100mM的醋酸鈉，并裝入制備型(C4)反相HPLC柱中。用泵抽吸Buffer C(25％)，直到洗脫所有的非肽物質(zhì)，然后利用35-55％Buffer C的線性梯度以超過(guò)80分鐘的時(shí)間進(jìn)行所需連接產(chǎn)物的純化。利用電噴射質(zhì)譜對(duì)含有所需連接產(chǎn)物SEP-1(1-166)(ψ89，117){SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41-Pico}(SE1 ID NO2)的組分進(jìn)行鑒定，并合并。
步驟8折疊在含有全長(zhǎng)連接的肽SEP-1(1-166)(ψ89，117){SEP-12+SEP-13+SEP-14+GP41-Pico}[即1711(GP41)-1712-1713-1776-GP41]合并組分中加入固體氯酸胍、1M的Tris緩沖液(pH8.7)和蒸餾水，使終溶液含有0.1mg/ml的連接肽SEP-1(1-166)、6M的氯酸胍和100mM的Tris。將該連接肽(“蛋白”)溶液裝在15ml透析盒中，并在含有3M氯酸胍、5mM半胱氨酸和2mM胱氨酸的濃度為100mM的Tris緩沖液(pH8.5)中4℃透析過(guò)夜。然后再將該蛋白溶液在含有1M氨酸胍的濃度為100mM的Tris緩沖液(pH8.5)中4℃透析8小時(shí)，最后將該溶液在10mM的Tris緩沖液(pH7.0)中4℃透析14小時(shí)，從而得到最終的折疊產(chǎn)物。將來(lái)自透析盒的含有折疊蛋白的溶液合并。用ES-MS、分析型RP-HPLC和CD光譜測(cè)定法來(lái)證實(shí)折疊。
步驟9純化將含有折疊蛋白的溶液裝入經(jīng)pH7.0的10mM的Tris緩沖液平衡的Q-Sepharaose來(lái)自交換柱中。利用125mM NaCl的線性鹽梯度洗脫該折疊蛋白。用非還原SDS-PAGE對(duì)含有所需折疊產(chǎn)物SEP-1-B51的組分進(jìn)行鑒定，并合并。用超濾管將上述合并組分濃縮至2mg/ml，然后將蛋白溶液裝入2.6×100cm的S-300凝膠過(guò)濾柱中。用pH7.0的10mM的Tris、137mM的NaCl將純化的SEP-1-B51洗脫下來(lái)。用非還原SDS-PAGE對(duì)含有高純度SEP-1-B51的組分進(jìn)行鑒定，并合并，并于-80℃冷凍貯存。最后，用分析型(C4)反相HPLC、ES-MS、非還原SDS-PAGE以及CD光譜測(cè)定法對(duì)折疊蛋白SEP-1-B51的性質(zhì)進(jìn)行描述。圖25顯示了典型的等電點(diǎn)聚焦凝膠(IEF)和非還原SDS-PAGE凝膠，其顯示折疊的純化SEP-1-B51的相對(duì)分子量。為了比較，在同一塊膠上加入了分子量標(biāo)準(zhǔn)。如圖所示，利用非還原SDS-PAGE所確定的SEP-1-B51的相對(duì)分子量約為73kDa。相對(duì)pI約為5.0。此外，還顯示了折疊的純化SEP-1-B51產(chǎn)物的典型的RP-HPLC色譜圖。這說(shuō)明了本發(fā)明的聚合物精確修飾的蛋白的純度和增加的相對(duì)分子量。
實(shí)施例8促紅細(xì)胞生成性合成蛋白SEP-1-B52的合成A.SEP-1-B52的組成。合成了第七種促紅細(xì)胞生成性合成蛋白(命名為SEP-1-B52)。全長(zhǎng)SEP-1-B52的氨基酸序列與SEP-1-B51相同
APPRLICDSRVLERYLLEAKEAEKOXITTGCA EHCSLNEKITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVKSSQPWψP LQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKψAISPPDAAKOXAAPL RTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO2)其中ψ特指含有經(jīng)羧甲基化的巰基的半胱氨酸的非天然氨基酸殘基，并且其中KOX特指其ε-氨基經(jīng)化學(xué)修飾連接了以肟鍵結(jié)合指定的水溶性聚合物的肟連接基團(tuán)的非天然賴氨酸。
SEP-1-B52蛋白是第24和126位殘基經(jīng)一種與SEP-1-B51類似的分支型(Succ-TTD)12-Succ-Ala聚合物構(gòu)建體衍生得到的，但是，對(duì)該類似體而言，聚合物是通過(guò)丙酮酸與氨氧乙酸之間的肟鍵相連的。此外，第24和126位的賴氨酸殘基的ε-氨基被修飾以帶有一個(gè)氨氧乙酰基功能基團(tuán)，而不是乙酰基丙?；鶊F(tuán)，并且該分支型(Succ-TTD)12-Succ-Ala聚合物構(gòu)建體被制成帶有一個(gè)懸垂的丙酮酸?；鶊F(tuán)。設(shè)計(jì)這些變化是為了促進(jìn)合成和操作，并且進(jìn)一步增加肟鍵的穩(wěn)定性。
圖23是分支型水溶性聚合物GRFNP43(GP43)化學(xué)合成的圖解，該GP43通過(guò)肟型連接而結(jié)合到SEP-1-B51上，下文將對(duì)此進(jìn)行詳細(xì)描述。全長(zhǎng)產(chǎn)物的組裝是按照實(shí)施例2所述進(jìn)行的。SEP-1-B52的結(jié)構(gòu)如圖24所示。
B.用以與分支模板(GRFNP42)結(jié)合的(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)的合成以0.5mmol數(shù)量級(jí)合成(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)。將0.5mmole(～0.5克)的Sasrin酸流動(dòng)型羧酸-生成聚苯乙烯樹(shù)脂(羥基取代1.02mmole/g)在DMF中溶脹15分鐘，然后排干液體。將溶于8ml含有500μl(3.9mmole)DIEA(二異丙基乙胺)的DMF的450mg(4.5mmole)琥珀酐和488mg(4mmole)4-二甲氨基嘧啶加入到羥基-功能化樹(shù)脂中，并劇烈攪拌使反應(yīng)進(jìn)行30分鐘，然后排干液體。重復(fù)連接反應(yīng)，并通過(guò)使用DMF(～50ml)攪拌流動(dòng)清洗1分鐘來(lái)去除過(guò)量的反應(yīng)物和可溶的副產(chǎn)物，然后排干液體?；罨疕OOC-CH2CH2CO-O-樹(shù)脂(0.5mmole)，其方法是添加8ml新制的溶于DMF的1.0M(8mmole)CDI(羰基二咪唑)溶液，并使其反應(yīng)40分鐘，然后排干液體。通過(guò)使用DMF(～50ml)攪拌流動(dòng)清洗1分鐘來(lái)去除過(guò)量的反應(yīng)物和可溶的副產(chǎn)物，然后排干液體。再加入溶解在4ml的溶于DMF的0.5M(2mmole)HOBT溶液的4ml(4g，18.2mmole)TTD，并劇烈攪拌使反應(yīng)進(jìn)行30分鐘，然后排干液體。通過(guò)使用DMF(～50ml)攪拌流動(dòng)清洗1分鐘來(lái)去除過(guò)量的反應(yīng)物和可溶的副產(chǎn)物，然后排干液體。在樹(shù)脂中添加溶解于8ml含有500μl(3.9mmole)DIEA(二異丙基乙胺)的HOBT(N-羥苯三唑)的琥珀酐(450mmg，4.5mmole)，并劇烈攪拌使反應(yīng)進(jìn)行15分鐘，然后排干液體。將上述三個(gè)步驟(CDI活化；TTD耦聯(lián)；琥珀酐反應(yīng))重復(fù)11次[即總共進(jìn)行12次]。通過(guò)使用DMF(～50ml)攪拌流動(dòng)清洗1分鐘來(lái)去除過(guò)量的反應(yīng)物和可溶的副產(chǎn)物，然后排干液體。用8ml新制的溶于DMF的1.0M(8mmole)CDI溶液活化HOOC-CH2CH2CO(TTD-琥珀酰)12-O-樹(shù)脂(0.5mmole)，并使其反應(yīng)40分鐘，然后排干液體。通過(guò)使用DMF(～50ml)攪拌流動(dòng)清洗1分鐘來(lái)去除過(guò)量的反應(yīng)物和可溶的副產(chǎn)物，然后排干液體。將2.5mmoleH-AlaOtBu.HCl溶解于4.75ml含有150μl(111mg，0.825mmole)DIEA的溶于DMF中的0.5M(2.375mmole)HOBT中，并劇烈攪拌以使其與CDI-活化的HOOC-CH2CH2CO(TTD-琥珀酰)12-O-樹(shù)脂(0.5mmole)反應(yīng)1小時(shí)，然后排干液體。用DCM(二氯甲烷)徹底清洗產(chǎn)物tertBuOOC-CH(CH3)-NH-OC-CH2CH2CO(TTD-琥珀酰)12-O-樹(shù)脂，排干液體，然后在真空中將樹(shù)脂干燥至恒重。產(chǎn)物-樹(shù)脂通常重約2克。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc-化學(xué)方法，用溶于DCM的4％的TFA將(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu線型聚合物從樹(shù)脂支持物上裂解下來(lái)。將沉淀粗產(chǎn)物溶解于含有1％TFA的50％的水性乙腈中，并凍干。少量含有1％TFA的50％的水性乙腈溶解凍干聚合物并稀釋，使有機(jī)物的濃度低于1％。將該粗產(chǎn)物裝入在T＝40℃條件下用3％B平衡的C4制備型反相柱中。將鹽等度洗脫，再用20-35％的Buffer B(含有1％TFA的50％的水性乙腈)對(duì)0.1％水性TFA的線性梯度以超過(guò)60分鐘的時(shí)間進(jìn)行所需的模板的純化。用ES-MS對(duì)含有所需物質(zhì)(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)的組分進(jìn)行鑒定，冷凍并凍干。
C.攜帶了用以形成分支的多個(gè)氨基和用以(后續(xù))與蛋白連接的被保護(hù)的氨氧基的模板的合成(GRFNP40)
以0.4mmol數(shù)量級(jí)在Boc-Leu-OCH2-Pam樹(shù)脂上手動(dòng)合成模板。在每一步連接、去保護(hù)和活化步驟之間都用DMF進(jìn)行一次1分鐘的流動(dòng)-清洗步驟。通過(guò)用純(即100％)TFA處理來(lái)去除Boc基團(tuán)。在用DMF清洗后，將經(jīng)過(guò)溶解在3.8ml的含有1ml DIEA的1.8mmol HBTU活化的樹(shù)脂與2mmol的Fmoc-(Rink-linker)-OH耦聯(lián)。去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)(2×3分鐘，溶于DMF中的20％的哌啶)后，通過(guò)用溶解在DMF中的2mmol DIC和2mmol NHS使NHS-酯活化來(lái)將2mmol Fmoc-Lys(MTT)-OH[MTT＝4-甲基三苯甲基]耦聯(lián)到樹(shù)脂上。去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)(2×1分鐘，溶于DMF中的0.5％的DBU)后，將樹(shù)脂與溶解于8ml含有2.2mmol DIEA的HOBT中的4mmol琥珀酐耦聯(lián)。該步驟后，用8ml溶于DMF中的新制的0.5M CDI活化羧基。在4ml 0.5M的HOBT溶液中添加4mlTTD，并結(jié)合30分鐘。
通過(guò)用溶解在DMF中的2mmol DIC和2mmol NHS使NHS-酯活化來(lái)將2mmol Fmoc-Lys(Fmoc)-OH耦聯(lián)到樹(shù)脂上。去除Fmoc(2×1分鐘，溶于DMF中的0.5％的DBU)后，將4mmol Boc-Lys(Boc)-NHS結(jié)合到3ml的DMF中。
用溶于DCM中的2％的TFA多次清洗來(lái)去除MTT保護(hù)基團(tuán)。當(dāng)上清不再是黃色時(shí)，去保護(hù)反應(yīng)就完成了。用溶于DMF中的10％的DIEA中和樹(shù)脂10分鐘。通過(guò)用溶解在DMF中的2mmol DIC和2mmol NHS使NHS-酯活化40分鐘來(lái)將2mmol丙酮酸耦聯(lián)到樹(shù)脂上。其中使用的是經(jīng)溶于DMF中的2mmol DIC和2mmol NHS預(yù)活化30分鐘的樹(shù)脂。用含有5％水的純TFA將模板去保護(hù)并將其從樹(shù)脂支持物上裂解下來(lái)。將裂解溶液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中揮發(fā)干燥并凍干。將殘余物溶解在含有1％TFA的50％的水性乙腈中，并凍干。少量含有1％TFA的50％的水性乙腈溶解凍干的模板并稀釋，使有機(jī)物的濃度低于1％。將該含有丙酮酸的模板裝入在T＝40℃條件下用0％B[即100％Buffer A＝溶解在水中的0.1％的TFA]平衡的C4 Prep柱中。將鹽等度洗脫，再用5-12％的Buffer B對(duì)0.1％水性TFA的線性梯度以60分鐘的時(shí)間進(jìn)行所需的模板的純化。用ESI-MS對(duì)含有所需物質(zhì)(GRFNP42)的組分進(jìn)行鑒定，冷凍并凍干。
D.酰胺-耦聯(lián)的分支型聚合物(GRFNP43)的組裝和去保護(hù)合成分子量為16kDa的分支型(TTD-Succ)49聚合物GRFNP43，其方法是，將GRFNP39與純化的模板GRFNP42耦聯(lián)。在存在20倍(摩爾)過(guò)量的DIEA的條件下，用以10mg/ml的濃度溶解在DMSO中的0.95mole的HATU活化純化的(Succ-TTD)12Succ-AlaOtBu(GRFNP39)(1.0mmole)，其中的GRFNP39在60℃條件下，以20mg/ml的濃度溶解在DMSO中。立即加入以3.9mg/ml的濃度溶解在DMSO中的純化的模板GRFNP42(0.24mmole)。用C4分析型反相HPLC和ES-MS對(duì)反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)控。通常，連接反應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)就能完成。為了激發(fā)反應(yīng)，添加4倍體積(相對(duì)于連接混合物的體積)pH4的0.1M醋酸鹽/6M氯酸胍，然后將該溶液裝入制備型(C4)反相HPLC柱中，將鹽和其他不含有酰胺的物質(zhì)等度洗脫，再用20-35％的Buffer B(含有1％TFA的乙腈)對(duì)0.1％水性TFA的線性梯度以超過(guò)80分鐘的時(shí)間進(jìn)行所需分支型聚合物的純化。用ES-MS對(duì)含有所需物質(zhì)的組分進(jìn)行鑒定，冷凍并凍干。
將所得的純化聚合物以1mg/ml的濃度溶解在純TFA中1小時(shí)，以去除Ala-OtBu叔丁基酯的保護(hù)。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中將上述溶液揮發(fā)干燥，再將干燥的聚合物溶解在50％的Buffer B(含有1％TFA的乙腈)中。在制備型反相HPLC柱中，用15-45％的Buffer B對(duì)0.1％水性TFA的逐級(jí)梯度以80分鐘的時(shí)間進(jìn)行聚合物的脫鹽。將含有所需分支型聚合物(GRFNP43)的合并組分冷凍并凍干，并且用該凍干的粉末以進(jìn)行肟化連接步驟。
E.肽段GRFN1776和GRFN1711與分支型聚合物GRFNP43的肟型連接(肟化作用)按照上文實(shí)施例2、3、4和7所述，用標(biāo)準(zhǔn)的耦聯(lián)方法合成片段SEP-14和片段SEP-11，只是添加在各自肽段中的Lys24和Lys126上的不是乙酰丙酸，而是氨氧乙?；鶊F(tuán)(AoA)。由此，在肽-樹(shù)脂組裝后，將每個(gè)肽-樹(shù)脂上的側(cè)鏈Fmoc基團(tuán)去除，并且通過(guò)用溶解在DMF中的2mmol DIC和2mmol NHS使NHS-酯活化來(lái)將2mmol Boc-氨氧乙酸添加到樹(shù)脂中。用HF將這兩種肽去保護(hù)，并將其從樹(shù)脂上裂解下來(lái)，然后用C4反相HPLC進(jìn)行純化。采用適當(dāng)?shù)念A(yù)防措施以避免與羰基化合物接觸。以等摩爾比將片段SEP-14和GRFNP43共同溶解在含有0.1％TFA(三氟乙酸)的50％的水性乙腈中。將該溶液凍干。將干粉重溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中，并裝入制備型C4反相HPLC柱中。利用制備型梯度反相HPLC將聚合物修飾肽與未修飾肽及未反應(yīng)聚合物分離。用ES-MS對(duì)含有所需肟化產(chǎn)物SEP-14+GP43的組分進(jìn)行鑒定，并合并。
以等摩爾比將片段SEP-11和GRFNP43共同溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中。將該溶液冷凍并凍干。將干粉溶解在含有0.1％TFA的50％的水性乙腈中，并裝入制備型梯度C4反相HPLC柱中。利用制備型反相梯度洗脫將聚合物修飾肽與未修飾肽及未反應(yīng)聚合物分離。用ES-MS對(duì)含有所需肟化產(chǎn)物SEP-11+GP43的組分進(jìn)行鑒定，并合并。
F.促紅細(xì)胞生成性合成蛋白SEP-1-B52的合成SEP-1-B52(SEQ ID NO2)是由四種多肽片段在溶液中合成的。
片段SEP-11+GP43(GRFN1711+GRFNP43，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的第1-32位殘基)APPRLICDSR VLERYLLEAK EAEKOXITTGCA EH-硫酯(其中Lys24的乙?；；鶓掖够鶊F(tuán)以肟鍵與分支型聚合物GRFNP41結(jié)合，表示為KOX；并且其中的His32被Dnp所保護(hù))片段SEP-12(GRFN1712，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的第33-88位殘基)CSLNEKIT VPDTKVNFYA WKRMEVGQQA VEVWQGLALLSEAVLRGQAL LVKSSQPW-硫酯(其中的Cys33被Acm所保護(hù)；并且其中的三個(gè)Trp殘基被甲酸基所保護(hù))片段SEP-13(GRFN1713，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的第89-116位殘基)CP LQLHVDKAVS GLRSLTTLLR ALGAQK-硫酯(其中的Cys89被Acm所保護(hù)；并且其中的His94被Dnp所保護(hù))片段SEP-14+GP43(GRFN1716+GRFNP43，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的第117-166位殘基)CAIS PPDAAKOXAAPL RTITADTFRK LFRVYSNFLRGKLKLYTGEA CRTGDR-羧酸酯(其中的C-末端半胱氨酸(即Cys161)帶有一個(gè)吡啶甲基(pico)保護(hù)基團(tuán)，并且其中Lys126的AoA懸垂基團(tuán)以肟鍵與分支型聚合物GRFNP43結(jié)合，表示為KOX)按照實(shí)施例1、2、3、4和7中的描述來(lái)完成附加肽的合成、連接、羧甲基化、保護(hù)基團(tuán)去除、折疊以及純化，以產(chǎn)生全長(zhǎng)的折疊的SEP-1-B52(SEQ ID NO2)，用分析性(C4)反相HPLC、ES-MS和非還原SDS-PAGE對(duì)該蛋白的性質(zhì)進(jìn)行描述。按照其他SEP構(gòu)建體的描述來(lái)完成生物檢測(cè)。
實(shí)施例9SEP-3-L42的功效研究將SEP-1-L30重新配制到添加了0.25％大鼠血清白蛋白(RSA)的Citrate Buffer(20mM檸檬酸+100mM氯化鈉)中，并且在第1、3和6天，將其以0、1、5或10μg/kg，tiw的劑量靜脈內(nèi)給藥于正常雄性大鼠(每組5只大鼠)。在最后一次注射(第9天)后4天，收集血液樣品，并分析其血液學(xué)參數(shù)。當(dāng)與對(duì)照組的數(shù)據(jù)比較時(shí)，在用SEP-3-L42以這些劑量進(jìn)行最后一次注射后4天，紅細(xì)胞(RGB)、血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞比容(HCT)和網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)(RET)值沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著差異。
實(shí)施例10SEP-3-L42的藥代動(dòng)力學(xué)研究將SEP-3-L42重新配制到添加了0.25％RSA的pH為6.9的CitrateBuffer(20mM檸檬酸+100mM氯化鈉)中，并且將其以5μg/kg的單一劑量靜脈內(nèi)給藥于正常雄性大鼠。在給藥后0、1、2、4、6、12、24、48、72、96、120、144和168小時(shí)收集血液樣品。用ELISA試劑盒(R&DSystems，Human Erythropoietin Quantikine IVD Immunoassay Kit#DEP00)，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)來(lái)測(cè)定血漿中SEP-3-L42的濃度。該結(jié)果顯示在圖27中。
如圖17所示，與SEP-3-L42相比，SEP-1-B50的清除率略微減慢。在劑量測(cè)試中，無(wú)論其循環(huán)半衰期如何，SEP-3-L42在促進(jìn)紅細(xì)胞增殖方面沒(méi)有表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。與之相反，SEP-1-B50能以相同劑量刺激紅細(xì)胞增殖。該結(jié)果說(shuō)明可以利用聚合物結(jié)構(gòu)來(lái)調(diào)節(jié)體內(nèi)的生物學(xué)特性，包括藥代動(dòng)力學(xué)行為和潛能。
實(shí)施例11SEP-1-L30的功效研究將SEP-1-L30重配制到添加了0.25％RSA的Citrate Buffer(20mM檸檬酸+100mM氯化鈉)中，并且在第1、3和5天，將其以0、1、5、25或50μg/kg，tiw的劑量靜脈內(nèi)給藥于正常雄性大鼠(每組5只大鼠)。在最后一次注射(第9和第13天)后4天和8天，收集血液樣品，并分析其血液學(xué)參數(shù)。在用SEP-1-L30處理后的任何間期，與對(duì)照組比較，RBC值、HGB值和HCT值都沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。用25和50μg/kg SEP-1-L30處理的大鼠在最后一次注射(第9天)后4天，其網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)增高(與對(duì)照組的那些數(shù)據(jù)比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異)。在第9或第13天，所有用SEP-1-L30處理的動(dòng)物中都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)血液學(xué)參數(shù)的其他差異。[未提供數(shù)據(jù)]實(shí)施例12SEP-1-L30的藥代動(dòng)力學(xué)研究將SEP-1-L30重配制到添加了0.25％RSA的pH為6.9的CitrateBuffer(20mM檸檬酸+100mM氯化鈉)中，并且將其以5或25μg/kg的單一劑量靜脈內(nèi)給藥于正常雄性大鼠。在給藥后0、1、2、4、6、12、24、48、72、96、120、144和168小時(shí)收集血液樣品。用ELISA試劑盒(R&D Systems，Human Erythropoietin Quantikine IVDImmunoassay Kit #DEP00)，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)來(lái)測(cè)定血漿中SEP-1-L30的濃度。在給藥后的所有特定時(shí)間點(diǎn)，都沒(méi)有檢測(cè)到SEP-1-L30。
實(shí)施例13SEP-1-B50的功效研究將SEP-1-B50重配制到添加了0.25％RSA的無(wú)菌PBS(磷酸鹽緩沖液)中，并且在第1、3和6天，將其以0、1、5、25或125μg/kg，tiw的劑量靜脈內(nèi)給藥于正常雄性大鼠(每組5只大鼠)。在最后一次注射(第10、15和20天)后4、9和14天，收集血液樣品，并分析其血液學(xué)參數(shù)。數(shù)據(jù)顯示在下面的表VIII中。在最后一次注射(第10天)后4天，在接受了5、25和125μg/kg SEP-1-B50處理的動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，增加的RBC、HGB、HCT和RET具有劑量相關(guān)效應(yīng)(與對(duì)照組的那些數(shù)據(jù)比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異)。在第15天時(shí)，這些動(dòng)物的RBC、HGB和HCT保持著比對(duì)照值高的水平，并且在以125μg/kgSEP-1-B50處理的動(dòng)物中，直到第20天(最后一次注射后14天)，RBC、HGB和HCT仍然顯著地比對(duì)照值高。
表VIIISEP-1-B50多次給藥后的血液學(xué)測(cè)定結(jié)果


*與對(duì)照有顯著差異p＜0.05**與對(duì)照有顯著差異p＜0.01
實(shí)施例14SEP-1-B50的藥代動(dòng)力學(xué)研究將SEP-1-B50重配制到添加了0.25％RSA的pH為6.9的CitrateBuffer(20mM檸檬酸+100mM氯化鈉)中，并且以5或25μg/kg的單一劑量水平將其靜脈內(nèi)給藥于正常雄性大鼠。在給藥后0、1、2、4、6、12、24、48、72、96、120、144和168小時(shí)收集血液樣品。用ELISA試劑盒(R&D Systems，Human Erythropoietin Quantikine IVDImmunoassay Kit #DEP00)，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)來(lái)測(cè)定血漿中SEP-1-B50的濃度。分別對(duì)以5和25μg/kg劑量處理后9.7小時(shí)和9.9小時(shí)的清除半衰期進(jìn)行測(cè)定。對(duì)5和25μg/kg劑量的觀測(cè)MRT(平均滯留時(shí)間)分別為13.9小時(shí)和14.4小時(shí)。圖27中顯示了SEP-1-B50的典型的藥代動(dòng)力學(xué)概圖。
實(shí)施例15SEP-1-B51的功效研究通過(guò)兩次實(shí)驗(yàn)，將SEP-1-B51靜脈內(nèi)給藥于正常雄性大鼠。
實(shí)驗(yàn)1將SEP-1-B51重新配制在添加了0.25％RSA的CitrateBuffer(20mM檸檬酸鈉+100mM氯化鈉)中，然后在第1、3和6天將其以0、1、5或25μg/kg，tiw的劑量靜脈內(nèi)給藥于雄性大鼠(每組5只大鼠)，并在最后一次注射的4、9和14天后(第10、15和20天)收集血液樣品，用于血液學(xué)參數(shù)分析。數(shù)據(jù)顯示于下文表IX。與對(duì)照組相比，在第3次和最后一次SEP-1-B51靜脈內(nèi)注射的4天后(第10天)，接受25μg/kg SEP-1-B51的動(dòng)物體內(nèi)的RBC、HGB、HCT和絕對(duì)網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)(ART)出現(xiàn)了具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著增加。在第15天時(shí)，這些動(dòng)物的RBC值仍高于對(duì)照值，并且在第20天時(shí)仍與對(duì)照值具有可比性。第10天后，網(wǎng)織紅細(xì)胞的產(chǎn)量有所降低，第15天時(shí)，在接受5和25μg/kg的動(dòng)物體內(nèi)觀測(cè)到網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)的明顯降低。
表IX多次SEP-1-B51給藥后的血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果


**與對(duì)照有顯著差異p＜0.01*與對(duì)照有顯著差異p＜0.05實(shí)驗(yàn)2將SEP-1-B51重新配制在添加了0.25％人血清白蛋白的Citrate Buffer(20mM檸檬酸鈉+100mM氯化鈉)中，然后在第1、3和5天將其以0、1、5或25μg/kg，tiw的劑量靜脈內(nèi)給藥于雄性大鼠(每組5只大鼠)，并在最后一次注射的2、4和6天后(第7、9和11天)收集血液樣品，用于血液學(xué)參數(shù)分析。此外還在其余的研究日(第2、3、4、5、6、8、10、12和13天)每天收集只用于紅細(xì)胞比容測(cè)定〔按壓縮的細(xì)胞體積(PCV)〕的血液樣品。數(shù)據(jù)顯示于下文表X。從第一次注射的2天(第3天)后開(kāi)始，接受劑量為5和25μg/kg的動(dòng)物體內(nèi)的HCT(PCV或計(jì)算)值明顯增加，并一直持續(xù)到第3次和最后一次注射的6天(第11天)后。在接受劑量為5和25μg/kg的動(dòng)物體內(nèi)，測(cè)定的(最后一次給藥的2、4和6天后；第7、9和11天)RBC和HGB值也明顯增加。在25μg/kg組，ART的明顯增加只出現(xiàn)在最后一次注射后2和4天(第7和9天)。
表X多次SEP-1-B51給藥σ后的血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果

*與對(duì)照有顯著差異p＜0.05**與對(duì)照有顯著差異p＜0.01注釋第7天(第三次給藥后兩天)；第9天(第三次給藥后四天)第11天(第三次給藥后六天)用25μg/kg單一劑量的SEP-1-B51經(jīng)靜脈內(nèi)處理其他組的大鼠，并且在注射后48小時(shí)收集血液樣品以用于分析其血液學(xué)參數(shù)。此外還僅在注射(第1、2、4和8天)后8、24和72小時(shí)以及7天后，收集用于紅細(xì)胞比容測(cè)定〔按壓縮的細(xì)胞體積〕的血液樣品。在第3天(注射后2天)，接受SEP-1-B51靜脈內(nèi)處理的大鼠的HCT、HGB和ART值比對(duì)照值高，并且在第4天，這些動(dòng)物的HCT仍然顯著增加。
實(shí)施例16在紅細(xì)胞增多和缺氧模型中SEP-1-B51的功效研究將以10只正常小鼠為一組的數(shù)組小鼠(賦形劑對(duì)照，以4種劑量水平的在CHO-細(xì)胞(“rhEPO”)中重組產(chǎn)生的糖基化的人促紅細(xì)胞生成素，以及以4種劑量水平0.32、1、5、25μg/kg/假定100mU/ng的SEP-1-B51)每天暴露在壓強(qiáng)維持在506.5mb的大氣中18小時(shí)，持續(xù)20天。將配制在添加了0.25％人血清白蛋白的Citrate Buffer中的rhEPO或SEP-1-B51以200μl-量經(jīng)靜脈內(nèi)(IV)注射到經(jīng)歷缺氧狀態(tài)4天后的小鼠中。2天后，用0.2μCi的59Fe經(jīng)腹腔(i.p.)注射每只小鼠。3天后，通過(guò)測(cè)定用心臟穿刺術(shù)取得的500μl血液中的放射量來(lái)估計(jì)RBC-放射鐵攝取量。
SEP-1-B51和rhEPO的72-小時(shí)RBC-59Fe攝取量(劑量百分比)結(jié)果顯示，隨劑量向5μg/kg增加，59Fe攝取量的增加具有明顯的劑量相關(guān)效應(yīng)，當(dāng)劑量大于5μg/kg時(shí)(25μg/kg)，該反應(yīng)處于平臺(tái)期。因此，使用三種最低劑量水平來(lái)計(jì)算線性回歸。圖28顯示了SEP-1-B51和rhEPO的線性回歸分析結(jié)果。SEP-1-B51和rhEPO的效應(yīng)基本上一致。SEP-1-B51與rhEPO的“效能比”是1.0035(0.6947-1.4498的95％可信區(qū)間)，該分析中確定的SEP-1-B51的效能為100mU/ng(69-145的95％可信區(qū)間)。
在體內(nèi)SEP-1-B51表現(xiàn)出與rhEPO相似的活性，并且以劑量依賴性方式發(fā)揮作用，包括在較高劑量時(shí)形成的反應(yīng)平臺(tái)，其原因是該模型中誘導(dǎo)了常見(jiàn)于rhEPO的負(fù)反饋機(jī)制。這說(shuō)明在SEP-1-B51分子的自定糖基化位點(diǎn)上精確連接的聚合物結(jié)構(gòu)可以模擬rhEP0糖鏈所具有的體內(nèi)活性。
實(shí)施例17SEP-1-B51的藥代動(dòng)力學(xué)研究將以5ug/kg單一劑量的重新配制在添加了0.25％人血清白蛋白的Citrate Buffer中的SEP-1-B51或rhEPO(相當(dāng)于500U/kg)經(jīng)靜脈內(nèi)給藥于幾組正常雄性大鼠，并且在給藥后5、30、60分鐘和24小時(shí)以及第2、3、4、5、6和7天放血。用R&D Systems抗EPO ELISA試劑盒(R&D Systems，Human Erythropoietin Quantikine IVDImmunoassay Kit #DEP00)，根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)通過(guò)ELISA試驗(yàn)來(lái)確定血漿樣品中SEP-1-B51或rhEPO的濃度。
進(jìn)行濃度的對(duì)數(shù)的最小平方分析，得到的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)列在下面的表XI中。在接受以5ug/kg單一劑量的SEP-1-B51經(jīng)靜脈內(nèi)給藥的雄性大鼠中，其血漿濃度隨時(shí)間的變化可以用一種單指數(shù)藥代動(dòng)力學(xué)分布函數(shù)來(lái)描述，其半衰期為10.5±0.5小時(shí)。SEP-1-B51的中心象限的分布容積(Vc)為32.5±2.0ml/kg。清除率(CL)為2.15ml/hr/kg，其平均滯留時(shí)間(MRT)為15.1±0.7小時(shí)。相比之下，在接受以5ug/kg劑量的rhEPO經(jīng)靜脈內(nèi)給藥的雄性大鼠中，其血漿濃度的變化可以用雙指數(shù)藥代動(dòng)力學(xué)分布函數(shù)來(lái)描述，其α半衰期為1.24±0.22小時(shí)，其β半衰期為5.51±0.40小時(shí)。rhEPO的Vc為57.0±3.2ml/kg。CL為16.0±0.5ml/hr/kg，約比SEP-1-B51的CL大8倍。rhEPO的平均滯留時(shí)間(MRT)為5.73±0.17小時(shí)，約比SEP-1-B51的MRT短3倍。
表XISEP-1-B51與rhEPO的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較

圖29以圖形表示了SEP-1-B51和rhEPO的血漿清除率。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明SEP-1-B51的循環(huán)半衰期比糖基化的重組人EPO的循環(huán)半衰期明顯地增加，這種增加是由分子中精確連接在自定位點(diǎn)上的聚合物引起的。
本發(fā)明是結(jié)合其特定實(shí)施方案來(lái)加以描述的，但應(yīng)該了解的是，可以對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步改進(jìn)，而該申請(qǐng)書(shū)應(yīng)包括任何變化、應(yīng)用或修改，這些變化、應(yīng)用或修改可以符合本發(fā)明的一般原理，也可以偏離本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容，但是處于本發(fā)明所屬領(lǐng)域已知或慣用準(zhǔn)則的范圍內(nèi)，并且適用于上文闡述的本質(zhì)特征。
序列表序列表<110>格萊風(fēng)科學(xué)公司(Gryphon Sciences)<120>促紅細(xì)胞生成性合成蛋白<130>03504.265<140><141><150>60/231,339<151>2000-09-08<150>60/236,377<151>2000-09-29<160>3<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>166<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Lys Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Lys Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Lys Ser Ser Gln Pro Trp Cys Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Cys Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr lle Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg165<210>2<211>166<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Lys lle Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Lys Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Lys Ser Ser Gln Pro Trp Cys Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Cys Ala lle Ser Pro Pro Asp Ala Ala Lys Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg165<210>3<211>166<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>3Ala Pro Pro Arg Leu lle Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Cys Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Cys Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Ala Cys Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Cys Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val
130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg16權(quán)利要求
1.一種促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，該蛋白聯(lián)接有一種或多種水溶性聚合物。
2.權(quán)利要求1的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，該蛋白在體內(nèi)具有提高紅細(xì)胞產(chǎn)量的生物活性。
3.權(quán)利要求1的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，該蛋白包含一段具有核糖體特定促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列的多肽鏈，以及通過(guò)一種或多種化學(xué)連接位點(diǎn)共價(jià)結(jié)合的一種或多種非重疊肽段。
4.權(quán)利要求3的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，一種或多種所述水溶性聚合物是通過(guò)與所述核糖體特定促紅細(xì)胞生成素的糖基化位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的一個(gè)位點(diǎn)聯(lián)接于所述多肽鏈。
5.權(quán)利要求3的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中的核糖體特定促紅細(xì)胞生成素來(lái)源于人。
6.權(quán)利要求3的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中的核糖體特定促紅細(xì)胞生成素糖蛋白是非天然蛋白。
7.權(quán)利要求6的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，所述非天然的核糖體特定促紅細(xì)胞生成素具有一個(gè)或多個(gè)非天然的糖基化位點(diǎn)。
8.權(quán)利要求2的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，所述水溶性聚合物只通過(guò)與所述核糖體特定促紅細(xì)胞生成素的糖基化位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)聯(lián)接于所述多肽鏈。
9.權(quán)利要求1的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，一種或多種所述水溶性聚合物包含一種重復(fù)單元，該重復(fù)單元包括聚環(huán)氧烷、聚酰胺環(huán)氧烷，或其衍生物。
10.權(quán)利要求9的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，所述聚環(huán)氧烷和聚酰胺環(huán)氧烷包含一種通式為-(CH2-CH2-O)-的環(huán)氧乙烷重復(fù)單元。
11.權(quán)利要求1的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，一種或多種所述水溶性聚合物呈分支型。
12.權(quán)利要求1的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，一種或多種所述水溶性聚合物帶有一種在生理?xiàng)l件下為負(fù)值的凈電荷。
13.權(quán)利要求1的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，所述促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的等電點(diǎn)為3-7。
14.權(quán)利要求1的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，所述水溶性聚合物呈單分散狀態(tài)。
15.權(quán)利要求1的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，所述促紅細(xì)胞生成性合成蛋白呈單分散狀態(tài)。
16.權(quán)利要求1的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，所述促紅細(xì)胞生成性合成蛋白包含一種分子量大于25kDa的單體。
17.權(quán)利要求1的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，所述促紅細(xì)胞生成性合成蛋白包含一種分子量大于40kDa的單體。
18.權(quán)利要求1的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，所述促紅細(xì)胞生成性合成蛋白包含一種分子量大于50kDa的單體。
19.權(quán)利要求1的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，所述促紅細(xì)胞生成性合成蛋白包含一種分子量大于60kDa的單體。
20.權(quán)利要求1的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，所述促紅細(xì)胞生成性合成蛋白包含一種分子量大于70kDa的單體。
21.權(quán)利要求1的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，所述多肽鏈含有一種或多種不規(guī)則氨基酸。
22.權(quán)利要求21的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，所述不規(guī)則氨基酸具有一種非天然的側(cè)鏈。
23.權(quán)利要求21的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，所述不規(guī)則氨基酸包括一種假氨基酸。
24.權(quán)利要求23的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，所述假氨基酸是假谷氨酸酯。
25.權(quán)利要求22的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，所述非天然側(cè)鏈與一種水溶性聚合物共價(jià)結(jié)合。
26.權(quán)利要求25的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，所述水溶性聚合物通過(guò)一種由化學(xué)連接形成的鍵與所述側(cè)鏈共價(jià)結(jié)合。
27.權(quán)利要求26的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，所述由化學(xué)連接形成的鍵選自酰胺鍵、肟鍵、腙鍵、噻唑烷鍵、惡唑烷鍵和硫酯鍵。
28.權(quán)利要求3的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，一種或多種所述化學(xué)連接位點(diǎn)包含一種酰胺鍵。
29.權(quán)利要求1的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，所述水溶性聚合物是通過(guò)所述多肽鏈的化學(xué)連接位點(diǎn)上的一種氨基酸側(cè)鏈與該多肽鏈相聯(lián)接。
30.權(quán)利要求1的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，該蛋白含有一種選自SEP-1和SEP-3的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的氨基酸序列。
31.一種促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，該蛋白選自SEP-0、SEP-1、SEP-3，及其類似物。
32.權(quán)利要求31的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，其中，所述類似物選自SEP-1-L26、SEP-1-L30、SEP-1-B50、SEP-1-B51和SEP-1-B52。
33.一種藥用組合物，該組合物含有權(quán)利要求1的一種促紅細(xì)胞生成性合成蛋白，或其藥學(xué)容許的鹽類。
34.權(quán)利要求33的藥用組合物，該組合物含有一種或多種選自緩沖液、載體蛋白、氨基酸、洗滌劑、脂類、水溶性聚合物和防腐劑的賦形劑。
35.權(quán)利要求33的藥用組合物，該組合物除所述促紅細(xì)胞生成性合成蛋白之外還含有一種或多種額外的生物活性劑。
36.一種提高哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞比容的方法，該方法包括將權(quán)利要求1的一種促紅細(xì)胞生成性合成蛋白以有效的劑量給藥于所述哺乳動(dòng)物，從而使所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)的紅細(xì)胞比容提高。
37.一種提高哺乳動(dòng)物體內(nèi)紅細(xì)胞產(chǎn)量的方法，該方法包括將權(quán)利要求1的一種聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白以有效的劑量給藥于所述哺乳動(dòng)物，從而使所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)的紅細(xì)胞產(chǎn)量提高。
38.一種提高哺乳動(dòng)物體內(nèi)血紅蛋白產(chǎn)量的方法，該方法包括將權(quán)利要求1的一種聚合物修飾促紅細(xì)胞生成性合成蛋白以有效的劑量給藥于所述哺乳動(dòng)物，從而使所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)的血紅蛋白產(chǎn)量提高。
39.一種提高哺乳動(dòng)物體內(nèi)網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)的方法，該方法包括將權(quán)利要求1的一種促紅細(xì)胞生成性合成蛋白以有效的劑量給藥于所述哺乳動(dòng)物，從而使所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)的網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)提高。
40.一種產(chǎn)生含有促紅細(xì)胞生成性合成蛋白多肽鏈的方法，該方法包括，將含有所述促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的非重疊性多肽鏈氨基酸序列的一些肽段進(jìn)行化學(xué)連接，從而產(chǎn)生一種含有所述促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的多肽鏈。
41.權(quán)利要求40的方法，該方法進(jìn)一步包括使所述多肽鏈折疊，從而產(chǎn)生一種具有生物活性的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白。
42.權(quán)利要求40的方法，其中，一種或多種所述肽段被部分保護(hù)。
43.權(quán)利要求40的方法，其中，一種或多種所述肽段未被保護(hù)。
44.權(quán)利要求40的方法，其中，一種或多種所述肽段聯(lián)接有一種水溶性聚合物。
45.權(quán)利要求40的方法，其中，所述化學(xué)連接包括一種選自天然化學(xué)連接、擴(kuò)展的天然化學(xué)連接、假天然化學(xué)連接、肟鍵形成化學(xué)連接、腙鍵形成化學(xué)連接、惡唑烷鍵形成化學(xué)連接、噻唑烷鍵形成化學(xué)連接和硫酯鍵形成化學(xué)連接的化學(xué)選擇性連接。
46.權(quán)利要求40的方法，其中，所述多肽鏈聯(lián)接有一種或多種水溶性聚合物。
47.權(quán)利要求40的方法，其中，所述多肽鏈含有一種核糖體特定促紅細(xì)胞生成素氨基酸序列。
48.權(quán)利要求46的方法，其中，一種或多種所述水溶性聚合物是通過(guò)與所述核糖體特定促紅細(xì)胞生成素的糖基化位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的一個(gè)位點(diǎn)聯(lián)接于所述多肽鏈。
49.權(quán)利要求48的方法，其中，所述核糖體特定促紅細(xì)胞生成素糖蛋白是利用重組方法產(chǎn)生的。
50.權(quán)利要求48的方法，其中，所述核糖體特定促紅細(xì)胞生成素糖蛋白是非天然的。
51.權(quán)利要求50的方法，其中，所述非天然核糖體特定促紅細(xì)胞生成素糖蛋白具有一個(gè)或多個(gè)非天然的糖基化位點(diǎn)。
52.權(quán)利要求47的方法，其中，所述核糖體特定促紅細(xì)胞生成素來(lái)源于人。
53.權(quán)利要求48的方法，其中，所述水溶性聚合物只通過(guò)與所述核糖體特定促紅細(xì)胞生成素的糖基化位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)的一個(gè)位點(diǎn)聯(lián)接于所述多肽鏈。
54.權(quán)利要求46的方法，其中，一種或多種所述水溶性聚合物包含一種重復(fù)單元，該重復(fù)單元包括聚環(huán)氧烷、聚酰胺環(huán)氧烷，或其衍生物。
55.權(quán)利要求54的方法，其中，所述聚環(huán)氧烷和聚酰胺環(huán)氧烷包含一種通式為-(CH2-CH2-O)-的環(huán)氧乙烷重復(fù)單元。
56.權(quán)利要求46的方法，其中，一種或多種所述水溶性聚合物呈分支型。
57.權(quán)利要求46的方法，其中，一種或多種所述水溶性聚合物帶有一種在生理?xiàng)l件下為負(fù)值的凈電荷。
58.權(quán)利要求41的方法，其中，所述促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的等電點(diǎn)為3-7。
59.權(quán)利要求46的方法，其中，所述水溶性聚合物呈單分散狀態(tài)。
60.權(quán)利要求40的方法，其中，所述促紅細(xì)胞生成性合成蛋白呈單分散狀態(tài)。
61.權(quán)利要求46的方法，其中，所述促紅細(xì)胞生成性合成蛋白包含一種分子量大于25kDa的單體。
62.權(quán)利要求46的方法，其中，所述促紅細(xì)胞生成性合成蛋白包含一種分子量大于40kDa的單體。
63.權(quán)利要求46的方法，其中，所述促紅細(xì)胞生成性合成蛋白包含一種分子量大于50kDa的單體。
64.權(quán)利要求46的方法，其中，所述促紅細(xì)胞生成性合成蛋白包含一種分子量大于60kDa的單體。
65.權(quán)利要求46的方法，其中，所述促紅細(xì)胞生成性合成蛋白包含一種分子量大于70kDa的單體。
66.權(quán)利要求40的方法，其中，所述多肽鏈含有一種或多種不規(guī)則氨基酸。
67.權(quán)利要求66的方法，其中，所述不規(guī)則氨基酸具有一種非天然的側(cè)鏈。
68.權(quán)利要求67的方法，其中，所述不規(guī)則氨基酸包括一種假氨基酸。
69.權(quán)利要求40的方法，其中，所述多肽鏈含有一種化學(xué)連接位點(diǎn)，該位點(diǎn)具有一種選自酰胺、肟、腙、噻唑烷、惡唑烷和硫酯的鍵。
70.權(quán)利要求46的方法，其中，所述水溶性聚合物與具有非天然側(cè)鏈的所述多肽鏈的一種氨基酸相聯(lián)接。
71.權(quán)利要求46的方法，其中，所述水溶性聚合物通過(guò)一種由化學(xué)連接形成的鍵與所述側(cè)鏈共價(jià)結(jié)合。
72.權(quán)利要求71的方法，其中，所述由化學(xué)連接形成的鍵選自酰胺鍵、肟鍵、腙鍵、噻唑烷鍵、惡唑烷鍵和硫酯鍵。
73.權(quán)利要求46的方法，其中，所述水溶性聚合物是通過(guò)所述多肽鏈的化學(xué)連接位點(diǎn)上的一種氨基酸側(cè)鏈與該多肽鏈相聯(lián)接。
74.權(quán)利要求41的方法，其中，所述具有生物活性的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白在體內(nèi)具有提高紅細(xì)胞產(chǎn)量的生物活性。
75.權(quán)利要求40的方法，其中，所述多肽鏈含有一種選自SEP-1和SEP-3的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白的氨基酸序列。
76.權(quán)利要求40的方法，其中的促紅細(xì)胞生成性合成蛋白選自SEP-0、SEP-1、SEP-3，及其類似物。
77.權(quán)利要求76的方法，其中，所述類似物選自SEP-1-L26、SEP-1-L30、SEP-1-B50、SEP-1-B51和SEP-1-B52。
全文摘要
本發(fā)明提供一些促紅細(xì)胞生成性合成蛋白。還提供用于合成這些蛋白的方法。本發(fā)明還涉及這些促紅細(xì)胞生成性合成蛋白以特定方式聚合物修飾的衍生物。此外還提供與這些蛋白及其衍生蛋白有關(guān)的方法和應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K19/00GK1458846SQ01815382
公開(kāi)日2003年11月26日 申請(qǐng)日期2001年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月8日
發(fā)明者G·科亨德菲爾, P·博蒂, J·A·布拉德博尼, S·－Y·陳, S·克雷斯曼, C·L·亨特, S·B·H·肯特, D·W·羅 申請(qǐng)人:格萊風(fēng)治療公司