細(xì)菌耐藥基因ndm-1的pcr檢測(cè)引物及試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種細(xì)菌耐藥基因NDM-1的PCR檢測(cè)引物及包含此引物的檢測(cè)試劑盒。為了調(diào)查養(yǎng)殖場(chǎng)中的耐藥細(xì)菌是否攜帶NDM-1基因，設(shè)計(jì)基因NDM-1的特異性PCR引物，優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和條件，獲得敏感性、特異性、重復(fù)性較高的細(xì)菌耐藥基因NDM-1的PCR檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法能檢出的最低基因組DNA濃度為9.18×10-7μg/μL。本發(fā)明方法可作為畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中攜帶耐藥基因NDM-1細(xì)菌的早期診斷、快速篩查以及流行病學(xué)評(píng)估等手段，并可在當(dāng)前獸醫(yī)臨床耐藥細(xì)菌的監(jiān)控防控中得到應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】細(xì)菌耐藥基因NDM-1的PCR檢測(cè)引物及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及畜禽養(yǎng)殖業(yè)的檢測(cè)方法，具體涉及一種耐藥基因NDM-1的PCR檢測(cè)引物及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]2010年8月11日，英國(guó)醫(yī)學(xué)界宣稱(chēng)南亞出現(xiàn)了一種新型細(xì)菌，幾乎對(duì)所有抗生素都有抗藥性，被稱(chēng)為“超級(jí)細(xì)菌”。因首先在印度首都新德里出現(xiàn)又稱(chēng)為新德里金屬-內(nèi)酸胺酶(New Delhi metallo-β-lactamase-l, NDM-1)。NDM-1 不是一種細(xì)菌，而是編碼金屬-β -內(nèi)酰胺酶(metallo-β -lacta-mase,MBL)的一種基因。隨后,在英國(guó)、美國(guó)、比利時(shí)、法國(guó)、日本、澳大利亞等全球大多數(shù)國(guó)家發(fā)生了攜帶NDM-1基因的肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、檸檬酸桿菌等細(xì)菌感染人并導(dǎo)致死亡病例，臨床表現(xiàn)超級(jí)耐藥現(xiàn)象。
[0003]攜帶NDM-1基因的細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生一種特殊的β-內(nèi)酰胺酶，且活性部位為金屬離子，屬于超廣譜β -內(nèi)酰胺酶的一種，這種酶可分解β -內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)，可使任何含β -內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)的抗生素失活，因此，攜帶這種酶的細(xì)菌可以抵抗所有含β_內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)的抗生素，從而導(dǎo)致臨床用藥困難。
[0004]雖然各國(guó)學(xué)者對(duì)NDM-1基因的研究不斷有文獻(xiàn)報(bào)道，但主要集中在對(duì)人體的檢測(cè)，并也只有從人體中檢測(cè)出攜帶基因NDM-1的細(xì)菌，而在畜牧獸醫(yī)方面的研究相對(duì)較少。NDM-1基因存在于DNA的結(jié)構(gòu)中，被稱(chēng)為質(zhì)粒。質(zhì)?？梢栽诩?xì)菌中自由復(fù)制和移動(dòng)，從而使各種菌種均有可能攜帶該NDM-1基因，具有傳播和變異的驚人潛能。盡管我國(guó)畜牧業(yè)尚未出現(xiàn)攜帶NDM-1基因的耐藥細(xì)菌，但攜帶NDM-1耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)也為我國(guó)畜牧業(yè)濫用抗生素敲響了警鐘。那么，這種導(dǎo)致人類(lèi)發(fā)病的“超級(jí)耐藥細(xì)菌”在畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)中到底是否存在？這需要建立相應(yīng)的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明建立“超級(jí)耐藥細(xì)菌”NDM-1基因的PCR快速檢測(cè)方法，調(diào)查畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)中分離到的耐藥細(xì)菌是否攜帶NDM-1基因。
[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)菌耐藥基因NDM-1的PCR檢測(cè)引物。
[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種包含上述檢測(cè)引物的細(xì)菌耐藥基因NDM-1的PCR檢測(cè)試劑盒。
[0008]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
一種細(xì)菌耐藥基因NDM-1的PCR檢測(cè)引物，其核苷酸序列分別如下所示:
NDM-1F: GGTTTGGCGATCTGGTTTTCC (SEQ ID NO:1);
NDM-1R: TTGTCCTGATGCGCGTGAGTC (SEQ ID NO:2)。
[0009]一種細(xì)菌耐藥基因NDM-1的PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包含上述的檢測(cè)引物。
[0010]本發(fā)明的有益效果是:O快速高效:整個(gè)檢測(cè)只需PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)即可完成；
2)操作簡(jiǎn)便:不需要復(fù)雜的儀器，不需要特殊試劑，只需進(jìn)行常規(guī)的PCR即可；
3)高特異性:本發(fā)明對(duì)大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌和銅綠假單胞菌的DNA均不發(fā)生擴(kuò)增；
本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物不與其他核酸序列發(fā)生錯(cuò)配，特異性高，且非常穩(wěn)定，形成引物二聚體概率低，保證了反應(yīng)的順利進(jìn)行；
4)聞靈敏度:本發(fā)明的最低檢測(cè)極限可達(dá)到9.18 X 10 7 μ g/ μ L。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1為PCR擴(kuò)增檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因NDM-1的特異性實(shí)驗(yàn)圖；
圖2為PCR擴(kuò)增檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因NDM-1的靈敏度實(shí)驗(yàn)圖，從左到右的電泳泳道依次為 9.18Χ10-2μ g/μ L、9.18Χ10-3μ g/μ L、9.18Χ10-4μ g/μ L、9.18Χ10-5μ g/μ L、9.18Χ10-6μ g/μ L、9.18Χ10-7μ g/μ L、9.18Χ10-8μ g/μ L、9.18Χ10-9μ g/μ L 的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果；
圖3為PCR擴(kuò)增檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因NDM-1的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0012]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。
[0013]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本`發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0014]實(shí)施例1:
一、特異性引物設(shè)計(jì)
根據(jù)GenBank已公布的細(xì)菌耐藥基因NDM-1的序列(登錄號(hào):AB614355、FN396876、FR820590)，選取保守序列，設(shè)計(jì)用于檢測(cè)細(xì)菌耐藥基因NDM-1的特異性引物，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為241bp (SEQ ID NO:3)，其引物序列分別為:
引物:
NDM-1F: GGTTTGGCGATCTGGTTTTCC (SEQ ID NO:1);
NDM-1R: TTGTCCTGATGCGCGTGAGTC (SEQ ID NO:2)。
[0015]二、PCR擴(kuò)增模板與陽(yáng)性質(zhì)控品的制備
人工合成細(xì)菌耐藥基因NDM-1序列，利用常規(guī)方法將獲得的基因NDM-1片斷連接到T載體中，即為PCR擴(kuò)增模板和陽(yáng)性質(zhì)控品。
[0016]三、基因NDM-1PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件的優(yōu)化
基因NDM-1的PCR擴(kuò)增體系:在PCR反應(yīng)管中分別加入滅菌水6 μ L,2XPCR Reagent10 μ L, 20pmol/y L NDM-1F I μ L,20pmol/y L NDM-1R I μ L，PCR 擴(kuò)增模板 2 yL，共20 μL PCR擴(kuò)增體系。
[0017]利用上述PCR擴(kuò)增體系，運(yùn)用正交法梯度性地改變變性溫度和時(shí)間，退火溫度和時(shí)間、延伸時(shí)間以及循環(huán)數(shù)等條件，確定基因NDM-1特異性引物的最佳循環(huán)擴(kuò)增條件為:首先95 °C預(yù)變性5 min;然后94 °C, 15 s，65 °C,30 s，72 °C，15 s，共進(jìn)行28個(gè)循環(huán)；最后72 °C延伸 5 min ；4 °C保存。
[0018]四、細(xì)菌耐藥基因NDM-1 PCR擴(kuò)增特異性實(shí)驗(yàn)
為了檢測(cè)本發(fā)明PCR檢測(cè)方法的特異性，分別對(duì)大腸埃希氏菌(ATCC29522)、肺炎克雷伯菌(CMCC (B) 46117)、陰溝腸桿菌(CMCC (B) 45301 )、銅綠假單胞菌(ATCC9027)等4株標(biāo)準(zhǔn)的菌株和NDM-1基因陽(yáng)性質(zhì)控品進(jìn)行檢測(cè)，分別提取各細(xì)菌的基因組DNA為模板，并以滅菌水為陰性對(duì)照，分析本PCR方法對(duì)基因NDM-1和其他常見(jiàn)畜禽細(xì)菌的基因檢測(cè)情況。
[0019]檢測(cè)方法采有上述“三”中的PCR擴(kuò)增體系和條件，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳顯示，發(fā)現(xiàn)只有NDM-1基因陽(yáng)性質(zhì)控品PCR產(chǎn)物在240 bp左右出現(xiàn)了一條片段，與預(yù)期大小相符，而滅菌水對(duì)照、大腸埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌和銅綠假單胞菌都沒(méi)有出現(xiàn)條帶(如圖1所示)。[0020]上述結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明PCR檢測(cè)方法能特異性擴(kuò)增出細(xì)菌基因NDM-1的靶序列，而不與其它細(xì)菌核酸發(fā)生交叉反應(yīng)。說(shuō)明本發(fā)明方法特異性好，未出現(xiàn)假陽(yáng)性。
[0021]五、細(xì)菌耐藥基因NDM-1 PCR擴(kuò)增靈敏度試驗(yàn)
用核酸測(cè)定儀測(cè)定陽(yáng)性質(zhì)控品基因組DNA的濃度為918μ g/mL，并將其按10的倍數(shù)進(jìn)行系列稀釋?zhuān)謩e稀釋至濃度為 9.18Χ10-2μ g/ μ L、9.18Χ10-3μ g/ μ L、9.18Χ10-4μ g/μ L、9.18Χ 10-5μ g/μ L、9.18Χ 10-6μ g/μ L、9.18Χ 10-7μ g/μ L、9.18Χ 10-8μ g/μ L、9.18Χ 10_9μ g/μ L，采用上述“三”中的PCR擴(kuò)增體系和條件，分別對(duì)稀釋后不同濃度的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。
[0022]檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，從左到右的電泳泳道依次為9.18Χ 10-2 μ g/ μ L、
9.18Χ 10-3μ g/ μ L、9.18Χ 10-4μ g/ μ L、9.18Χ 10-5μ g/ μ L、9.18Χ 10-6μ g/ μ L、
9.18Χ10-7μ g/yL、9.18Χ 10-8μ g/μ L、9.18Χ 10_> g/μ L 的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增結(jié)果，從中可以看出本發(fā)明的PCR檢測(cè)方法的靈敏度可達(dá)9.18Χ10_7μ g/μ L，表明本發(fā)明檢測(cè)方法對(duì)細(xì)菌耐藥基因NDM-1的診斷具有高度的靈敏性。
[0023]六、細(xì)菌耐藥基因NDM-1 PCR擴(kuò)增重復(fù)性試驗(yàn)
將8次獨(dú)立重復(fù)提取含基因NDM-1陽(yáng)性質(zhì)控品的基因組DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳顯示，均出現(xiàn)了清晰明亮的目的條帶(圖3)，表明本發(fā)明的PCR檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。
【權(quán)利要求】
1.一種細(xì)菌耐藥基因NDM-1的PCR檢測(cè)引物，其核苷酸序列分別如下所示:
NDM-1F: GGTTTGGCGATCTGGTTTTCC ；
NDM-1R: TTGTCCTGATGCGCGTGAGTC。
2.—種細(xì)菌耐藥基因NDM-1的PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于:該試劑盒包含權(quán)利要求1所述的檢測(cè)引物。`
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103882106SQ201310554556
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2013年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月8日
【發(fā)明者】溫肖會(huì), 翟少倫, 魏文康, 呂殿紅, 袁潔, 黃忠, 賈春玲, 周秀蓉, 曾琦雯 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所