一種細(xì)菌耐藥性篩查pcr芯片的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)菌耐藥性篩查PCR芯片。
【背景技術(shù)】
[0002] 眾所周知，細(xì)菌容易對(duì)抗菌素產(chǎn)生耐藥性。細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制大體上可分為 兩類，一是本身具有抗性基因或產(chǎn)生了抗性突變，稱天然耐藥性；二是細(xì)菌通過(guò)融合或轉(zhuǎn)化 方式獲得耐藥性基因，耐藥性細(xì)菌也可從其它耐藥性細(xì)菌中獲得新的耐藥性基因，從而產(chǎn) 生多耐藥性細(xì)菌。
[0003] 細(xì)菌耐藥性基因按照耐藥性基因的功能可以分為多類，列舉幾類如下：
[0004] (1)編碼抗菌素修飾酶，如aminoglycoside、acetyltransferases、 aminoglycoside、adenylyltransferases、aminoglycosidephosphotransferases、 beta-lactamase等，通過(guò)對(duì)抗菌素進(jìn)行乙?；?、腺苷化、磷酸化等修飾使抗菌素失效；
[0005] (2)編碼抗菌素外排系統(tǒng)的關(guān)鍵蛋白（如multidrugeffluxpumps)，增強(qiáng)細(xì)胞把 抗菌素排除細(xì)胞外的能力，從而降低抗菌素在細(xì)胞內(nèi)的有效濃度，產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性；
[0006] (3)編碼抗菌素靶標(biāo)蛋白，由于基因突變，靶蛋白喪失與抗菌素的結(jié)合能力，導(dǎo)致 抗菌素?zé)o法發(fā)揮作用。
[0007] 細(xì)菌耐藥性基因的獲得使得細(xì)菌對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性，從而使常規(guī)抗菌素作用下降 甚至失效。因此在使用抗菌素前檢測(cè)患者體內(nèi)的細(xì)菌獲得了哪些耐藥性基因，這些耐藥性 基因的表達(dá)水平如何，可以指導(dǎo)醫(yī)生采用哪種抗菌藥類型及其劑量。
[0008] 現(xiàn)有技術(shù)中的細(xì)菌耐藥性的檢測(cè)，常規(guī)做法是抗菌素藥敏實(shí)驗(yàn)，首先需要分離和 培養(yǎng)細(xì)菌，然后再逐一進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。藥敏實(shí)驗(yàn)只能確定細(xì)菌對(duì)某一種抗菌素耐藥，而無(wú)法 判斷是哪種耐藥基因?qū)е碌哪退幮浴＿@種檢驗(yàn)方式在單一耐藥性、少量樣本的情況下仍需 要數(shù)日到數(shù)周，而在進(jìn)行批量檢測(cè)時(shí)耗時(shí)更長(zhǎng)，且極易出錯(cuò)。
[0009] 隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，逐步開(kāi)始采用基因檢測(cè)方法檢測(cè)抗菌素基因，主要分為通 過(guò)雜交直接檢測(cè)細(xì)菌耐藥性基因的方法，以及對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增（PCR)后檢測(cè)的方法。 通過(guò)雜交直接檢測(cè)細(xì)菌耐藥性基因的方法中，有學(xué)者做過(guò)用DNA芯片來(lái)檢測(cè)60多種耐藥性 基因的研究，然而，DNA芯片的檢測(cè)條件同樣需要將細(xì)菌進(jìn)行分離、擴(kuò)大培養(yǎng)，即便如此，其 準(zhǔn)確度、靈敏度、專一性都還仍然不能與對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增的PCR方法相提并論。而傳統(tǒng) PCR由于每個(gè)基因的PCR條件不完全一致，只能停留在逐一檢測(cè)的水平上；采用大規(guī)模集成 化載體一次檢測(cè)大量抗性基因的PCR產(chǎn)品市面上未見(jiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種能夠大規(guī)模集成化檢測(cè)多種細(xì)菌耐藥基因的細(xì)菌耐 藥性篩查PCR芯片，相對(duì)于上述傳統(tǒng)細(xì)菌耐藥性檢測(cè)手段來(lái)說(shuō)，其優(yōu)勢(shì)在于：
[0011] 1.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，準(zhǔn)確度、靈敏度、專一性極高
[0012] 2.采用大規(guī)模集成化檢測(cè)，2小時(shí)可檢測(cè)170個(gè)耐藥性基因的190種靶點(diǎn)
[0013] 3.可用于復(fù)合樣本的耐藥性篩查：可在99%非耐藥細(xì)菌存在的背景下檢測(cè)出1% 含量的耐藥性基因，無(wú)需進(jìn)行分離培養(yǎng)，可直接或經(jīng)預(yù)擴(kuò)增后用于復(fù)雜環(huán)境中混合樣本的 微生物耐藥性篩選。
[0014] 4.不僅提供了耐藥性基因篩查，同時(shí)可幫助弄清耐藥性機(jī)制
[0015] 5.無(wú)需細(xì)菌培養(yǎng)，無(wú)需藥敏實(shí)驗(yàn)，加快檢測(cè)速度、減少人工成本
[0016] 6.使用方便，只需混合PCRMasterMix和分配上板，無(wú)需對(duì)每個(gè)基因進(jìn)行標(biāo)記，大 大簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作。
[0017] 本發(fā)明提供的PCR芯片，其組分包括：分別用于擴(kuò)增與細(xì)菌耐藥相關(guān)的基因的擴(kuò) 增引物對(duì)，PCR陽(yáng)性對(duì)照（PPC)，用于固定擴(kuò)增引物對(duì)和承載PCR反應(yīng)的集成化PCR載體。
[0018] 優(yōu)選的，集成化PCR載體可以是384孔PCR板或2塊96孔PCR板。
[0019] 優(yōu)選的，用于擴(kuò)增與細(xì)菌耐藥相關(guān)的基因的擴(kuò)增引物對(duì)序列分別為SEQN0 :1-380 所示的核苷酸序列。
[0020] 優(yōu)選的，基因擴(kuò)增引物在384孔板上的排列順序如說(shuō)明書附圖1，可檢測(cè)2個(gè)樣本。
[0021] 優(yōu)選的，基因擴(kuò)增引物在2塊96孔板上的排列順序如說(shuō)明書附圖2。
[0022] 優(yōu)選的，上述引物對(duì)都在統(tǒng)一的PCR條件下工作。具體PCR擴(kuò)增程序如表1所示：
[0023] 表 1
[0024]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種細(xì)菌耐藥性篩查PCR芯片，包括PCR載體及分別用于擴(kuò)增與細(xì)菌耐藥相關(guān)的基 因的擴(kuò)增引物對(duì)，所述與細(xì)菌耐藥相關(guān)的基因包括： 氨基糖巧己醜轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因；aacA, aacAl, aacA4, aacA7, aacA29b, aacCl, aacC2, aacC3, aacC4, aac(3)-Id; 氨基糖巧腺巧轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因；aadA4, aadA7, aadA9, aadAlO, aadA12, aa曲； 氨基糖巧磯酸轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因；aph, apM, apM-3, apM-6, apM-7, aph2, aph (29) -lb, strA ； 目?jī)?nèi)醜胺酶相關(guān)基因；ctx-m4, ctx-m26, ctx-m27, ctx-m32, ges_3，kpc_3，per-l, per-2, shv-34, blaTEM-1, blaTLA-1, blaTLA-2, imp-2, imp-5, imp-9, imp-13, imp-16, vim-4, vim-7, ampC, cmy-9, cmy-13, blanps-1, blanps-2, oxa-1, oxa-2, oxa-5, oxa-9, oxa-10,oxa-12,oxa-18,oxa-20,oxa-22,oxa-27,oxa-29,oxa-40,oxa-45,oxa-46,oxa-48, oxa-50, oxa-54, oxa-55, oxa-58, oxa-60, oxa-61, oxa-75 ; 氯霉素醜基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因；cat, cat2, catlll, catA, ca1:B2，ca1:B4，ca1:B6，ca1:B7， ca1:B8, ca1:B9, ca1:P ; 氯霉素/氣洛芬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因；cmlAl，cmxA，fexA，floR ; 疏水性多膚相關(guān)基因；cmlB ; 五膚家族蛋白相關(guān)基因；qnrA3, qn;rBl，qn;rB4, qnr ; rRNA腺嘿嶺N6-甲基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因；ermA, ermB, ermD, ermF, erm(TR); 醋酶相關(guān)基因；ereA2, ereB ; MFS外輸粟相關(guān)基因；mefA, mefE, mel ; 大環(huán)內(nèi)醋29-磯酸轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因；mph(B)，m地(A)，mph，mphB，mph(BM); 水解酶相關(guān)基因；V曲(A); 鏈陽(yáng)菌素B內(nèi)醋酶相關(guān)基因；vgbB ; ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶相關(guān)基因；arr2 ; 四環(huán)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因；tet (A)，tetA似，tetA (J)，te1:BSR，tet值），tet似， tet 化），tet (X)，tetA (Y)，tet 狂），eff J, tet (V)，tet 化），tet (30)，tet (33)，tet (38); 四環(huán)素失活蛋白相關(guān)基因；tet (37)，tet狂）； GTP 關(guān)聯(lián)延伸因子相關(guān)基因；tetB(F〇，tet(M)，tet(O)，tet 做，tet(W); 核糖體保護(hù)蛋白相關(guān)基因；tet (36)，tetQ，tet (T); 四環(huán)素阻遏蛋白相關(guān)基因；tetR(31); 四環(huán)素抵抗相關(guān)基因；tet扣）； 轉(zhuǎn)磯酸核糖基酶相關(guān)基因：tet (34); 二氨葉酸還原酶相關(guān)基因；壯rll，壯rV，壯rVI，壯rXII，壯rl3,壯rl6,壯rl7,壯rA19, 壯rB2,壯rD，化化，化巧，化化I，化化VIII，化打IX，化化XV ; 二氨蝶酸合成酶相關(guān)基因；sull，sum, sulIII ; 小型多藥外輸粟相關(guān)基因；qacB, qacD, qac邸 1，qacF, qacF, qacG, qacG2, qa地； 多藥外輸粟相關(guān)基因；acrB, acrD, mexB, mexD, mexF, mexl, mexY, orfllo
2. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌耐藥性篩查PCR芯片，其特征在于，所示擴(kuò)增引物對(duì)的序列 分別為SEQ ID NO ; 1-380所示的核巧酸序列。
3. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌耐藥性篩查PCR芯片，其特征在于，所述擴(kuò)增引物對(duì)分別成 對(duì)存在于384孔PCR板的孔中。
4. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌耐藥性篩查PCR芯片，其特征在于，所述擴(kuò)增引物對(duì)分別成 對(duì)存在于兩塊96孔PCR板的孔中。
5. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)菌耐藥性篩查PCR芯片，其特在在于，所述引物對(duì)可W單次或 重復(fù)出現(xiàn)的方式分別成對(duì)存在于各種類型的集成化PCR載體中，即一塊集成化PCR載體可 W檢測(cè)單個(gè)或多個(gè)樣本，具體樣本量可根據(jù)實(shí)際需求與PCR載體的容量來(lái)確定。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)菌耐藥性篩查PCR芯片，包括集成化PCR載體和190對(duì)(380個(gè))分別用于擴(kuò)增與細(xì)菌耐藥相關(guān)的基因的擴(kuò)增引物對(duì)序列。本發(fā)明的有益效果在于提供了一種細(xì)菌耐藥性PCR芯片，采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)一次檢測(cè)170種不同類別的耐藥性因的190個(gè)靶點(diǎn)，無(wú)須細(xì)菌分離、培養(yǎng)，只需2小時(shí)即可快速、準(zhǔn)確、靈敏地篩查復(fù)合樣本中的細(xì)菌耐藥性基因。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開(kāi)號(hào)】CN104531877
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410856255
【發(fā)明人】雷向東
【申請(qǐng)人】南京安闊醫(yī)療科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2014年12月31日