一種檢測幽門螺桿菌耐藥基因的方法和檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測幽門螺桿菌耐藥基因的方法和檢測試劑盒，該方法以待檢樣本基因組DNA為模板，用巢氏PCR外道引物進行PCR反應(yīng)；再以巢式PCR的外道產(chǎn)物作為模板，用等位基因特異性引物作為內(nèi)道引物進行PCR；內(nèi)道PCR擴增后的產(chǎn)物在含溴化乙錠的1.5％瓊脂糖凝膠中電泳，并在紫外線透射儀下檢查有無特異擴增條帶；其中巢氏PCR外道引物序列如SEQ?ID?NO.1和2所示；內(nèi)道引物序列如SEQ?ID?NO.3-9所示。所述試劑盒包括上述巢氏PCR外道引物和內(nèi)道引物。本發(fā)明可以達到區(qū)別不同標本中是否存在耐藥突變位點的目的。該方法具有高檢出率、高敏感性、操作簡便、無痛苦、無創(chuàng)傷性，病人的依從性較好。
【專利說明】一種檢測幽門螺桿菌耐藥基因的方法和檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及將巢氏PCR聯(lián)合等位基因特異性引物擴增技術(shù)應(yīng)用于人口腔唾液中幽門螺桿菌耐藥基因的檢測，屬于消化道疾病中幽門螺桿菌的分子生物學檢測的【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]慢性胃炎、胃十二指腸潰瘍、胃癌、胃黏膜相關(guān)性淋巴樣組織惡性瘤等的發(fā)病與幽門螺桿菌(Hp)的感染密切相關(guān)，因此根除Hp可以減少Hp相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展。近年來，Hp的耐藥性呈全球性分布，且日趨嚴重，常導致根除治療的失敗。越來越多的耐藥基因突變位點被發(fā)現(xiàn)(如Hp對克拉霉素耐藥與23SrRNA基因A2142G、A2143G、A2144G和C2182T等點突變相關(guān))，這些位點的存在無疑將為臨床醫(yī)師提供相當有價值的參考，幫助其了解患者所感染的菌株的情況，選擇高效敏感的治療藥物和治療方案。
[0003]目前，對于Hp耐藥基因的檢測主要依賴于通過胃內(nèi)窺鏡檢查從獲取的胃黏膜組織抽提基因組DNA，基于PCR為基礎(chǔ)的及分子雜交的生物學方法。
[0004]大多數(shù)研究表明口腔可能是Hp的長期聚集地，口腔Hp感染與胃內(nèi)Hp感染存在一定的相關(guān)性，有研究證實口腔Hp與胃內(nèi)的Hp多為同一菌株，兩者具有同源性，因此口腔Hp可能是胃內(nèi)Hp感染的重要儲存庫。本發(fā)明以口腔唾液為檢測對象，建立一種非侵入性的Hp耐藥基因的檢測方法，能夠更好地指導臨床用藥。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種簡單易行、非侵入性的幽門螺桿菌耐藥基因的檢測試劑盒。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:為達到上述目的，本發(fā)明以口腔唾液為檢測對象，采用巢氏PCR聯(lián)合等位基因特異性引物擴增技術(shù)從人口腔唾液中擴增幽門螺桿菌的耐藥基因。
[0007]上述技術(shù)方案中所說的以口腔唾液為檢測對象，即從口腔唾液中抽提基因組DNA用于檢測。
[0008]巢氏PCR的外道引物被用于擴增幽門螺桿菌的23S and 5S ribosomal RNAgenes (GenBank Access1n:N0.U27270)的 1962 ~2466bp,共 505bp。
[0009]巢氏PCR的內(nèi)道引物即等位基因特異性引物被用來擴增幽門螺桿菌的23S and 5Sribosomal RNA genes (GenBank Access1n:N0.U27270)的 2122 ~2415bp,共 294bp。
[0010]本發(fā)明所述的檢測幽門螺桿菌的耐藥基因的方法，是用巢式PCR特異性外道引物擴增幽門螺桿菌23Sand 5S ribosomal RNA genes 中的23S rRNA基因的第 1962至2466bp，以巢式PCR的外道產(chǎn)物作為模板，用等位基因特異性引物作為內(nèi)道引物來檢測其耐藥突變位點；該項反應(yīng)體系由10倍濃縮的PCR擴增反應(yīng)液、Taq DNA聚合酶、dNTP、內(nèi)道引物、外道引物、雙蒸水、待檢樣本基因組DNA、陰性對照標本和DNA抽提試劑盒組成；
[0011]其中巢氏PCR特異性外道和內(nèi)道引物如下:
[0012]I)巢氏PCR外道引物
[0013]外道上游引物:23s1962-F 5’ -GCGTTGAATTGAAGCCCGAGTAAAC-3’ (SEQ ID N0.1)
[0014]外道下游引物:23s2466-R 5’ -CCGACTTTCGTCTCTGCTTGA-3’ (SEQ ID N0.2)
[0015]2)巢氏PCR內(nèi)道引物
[0016]2142WT 23S 2142A-F 5’ -TCCTACCCGCGGCAAGACGGA-3J (SEQ ID N0.3)
[0017]2142MUT 23S A2142G-F 5，-TCCTACCCGCGGCAAGACGGG-3J (SEQ ID N0.4)
[0018]2143WT 23S 2143A-F 5’ -CCTACCCGCGGCAAGACGGAA-3J (SEQ ID N0.5)
[0019]2143MUT 23S A2143G-F 5’ -CCTACCCGCGGCAAGACGGAG-3J (SEQ ID N0.6)
[0020]2144WT 23S 2144A-F 5’ -TCCTACCCGCGGCAAGACGGAAA-3J (SEQ ID N0.7)
[0021]2144MUT 23S A2144G-F 5’ -TCCTACCCGCGGCAAGACGGAAG-3J (SEQ ID N0.8)
[0022]內(nèi)道下游引物:23S 2415-R 5’ -GCCATTACACTCAACTTGCGATTTC-3’ (SEQ ID N0.9)
[0023]注:WT指野生株，MUT指突變型。
[0024]所述的引物濃度為10 μ M ;
[0025]所述的DNA聚合酶為Taq DNA聚合酶，活性單位為8U/ μ L ;
[0026]10 倍濃縮的 PCR 擴增反應(yīng)液為 1x Takara Taq TMBuffer (Mg2+pIus)；
[0027]所述的陰性樣本為快速尿素酶和13C呼氣試驗陰性，且細菌培養(yǎng)陰性的標本；
[0028]所述的樣本DNA 抽提試劑盒包括:3SColumn、2.0ml coll tube、Digest1nBuffer、Solut1n B> Wash Solut1n、Proteinase k、TE pH8.0。
[0029]本發(fā)明方法具體是以待檢樣本基因組DNA為模板，用巢氏PCR外道引物進行PCR反應(yīng)；再以巢式PCR的外道產(chǎn)物作為模板，用等位基因特異性引物作為內(nèi)道引物進行PCR ;內(nèi)道PCR擴增后的產(chǎn)物在含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，并在紫外線透射儀下檢查有無特異擴增條帶；在相應(yīng)的位置處，若出現(xiàn)亮光條帶，則為陽性；若無條帶，則為陰性。
[0030]本發(fā)明還公開了檢測幽門螺桿菌的耐藥基因的試劑盒，包括一套巢式PCR特異性外道引物和6套等位基因特異性的內(nèi)道引物，反應(yīng)體系由10倍濃縮的PCR擴增反應(yīng)液、TaqDNA聚合酶、dNTP、內(nèi)道引物、外道引物、雙蒸水、待檢樣本基因組DNA、陰性對照標本和DNA抽提試劑盒組成；
[0031]所述的一套巢式PCR特異性外道引物和6套等位基因特異性的內(nèi)道引物如下:
[0032]I)巢氏PCR外道引物，其序列如SEQ ID N0.1和2所示；
[0033]2)巢氏PCR內(nèi)道引物；其序列如SEQ ID N0.3-9所示。
[0034]本發(fā)明利用巢氏RCR聯(lián)合等位基因特異性引物擴增技術(shù)檢測唾液中的幽門螺桿菌的耐藥基因，具有便捷、特異性高、靈敏度高、無創(chuàng)傷等優(yōu)點。通過對Hp耐藥基因的突變進行篩查，在基因水平上了解菌株對根除治療抗生素的耐藥情況，對個體化用藥、減少抗生素濫用具有重要的指導意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1是胃黏膜組織與口腔唾液中Hp耐藥基因的檢測結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖。

【具體實施方式】
[0036]除非特別說明，本發(fā)明中所使用的術(shù)語，一般為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。
[0037]下面結(jié)合具體的實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細地描述本發(fā)明。在以下的實施案例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時標明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標明的內(nèi)容相同。
[0038]實施例1
[0039]1、唾液的采集
[0040]獲患者知情同意后，在上消化道癥狀準備進行胃鏡檢查之前，于清晨做胃鏡前收集患者的口腔唾液。
[0041]2、抽提唾液中的基因組DNA
[0042]采用基因組DNA快速制備試劑盒(上海博彩生物科技有限公司)，從唾液中抽提基因組DNA，作為以下聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增的模板。具體實驗操作流程如下:
[0043](I)標本的處理
[0044]I) 25~10mg組織樣品用手術(shù)刀切成小塊，再用液氮碾碎，或用組織勻漿器勻漿。將粉末收集到1.5mL離心管中，用400 μ L Disgest1n Buffer懸浮。
[0045]2)取新鮮唾液lmL，加入2mL PBS (或生理鹽水)，室溫浸泡2_5h。
[0046](2)在按要求處理的樣品中加入3 μ L Proteinase K,混勻，55°C保溫10~60min。
[0047](3)高速室溫12000轉(zhuǎn)/分離心5min，將上清轉(zhuǎn)移到1.5mL無菌離心管中，加入300 μ L Solut1n B,混勻。
[0048](4)將樣品全部轉(zhuǎn)移到3S柱,柱子放入2.0mL Collect1n Tube,蓋上離心管蓋，轉(zhuǎn)移時用ImL Tip頭取樣品。
[0049](5)用臺式離心機,12, 000轉(zhuǎn)/分,室溫Imin。
[0050](6)取下3S柱，棄去離心管中的廢液。將柱子放回同一根離心管中，加入500μ LWash Solut1n, 12000r/min,室溫離心 Imin0
[0051](7)重復步驟(6) 一次。
[0052](8)取下3S柱，棄去離心管中的廢液。將柱子放回同一根離心管中，10000轉(zhuǎn)/min，室溫離心2min,以除去殘留的Wash Solut1n。
[0053](9)在柱子中加入10yL的TE，將柱子加入新的干凈1.5mL或2mL離心管中，室溫37~55°C放置2min。12000r/min，室溫離心lmin，收集管中的液體即為基因組DNA。根據(jù)用途，樣品可以放4°C或_20°C保存。
[0054]3、巢氏PCR聯(lián)合等位基因特異性引物擴增技術(shù)的建立
[0055](I)用巢氏PCR外道引物進行PCR反應(yīng)
[0056]I)巢氏PCR外道引物
[0057]外道上游引物:23s1962-F 5’ -GCGTTGAATTGAAGCCCGAGTAAAC-3’ (SEQ ID N0.1)
[0058]外道下游引物:23s2466-R 5’ -CCGACTTTCGTCTCTGCTTGA-3’ (SEQ ID N0.2)
[0059]2)反應(yīng)體系:10XPCR緩沖液5 μ 1，10 μ M dNTP 1.0 μ 1，外道上游引物1.0 μ 1，外道下游引物Ι.Ομ l，Taq DNA聚合酶I μ I，雙蒸水40 μ I，唾液的基因組DNA I μ 1，共50 μ I。
[0060]3)反應(yīng)條件:預(yù)變性 94°C 5min;變性 94°C 30s，退火 55°C 30s，延伸 72°C 30s，35個循環(huán)；延伸72°C 5min ;4°C保存。
[0061]4)巢式PCR外道產(chǎn)物DNA片段:幽門螺桿菌23S and 5S ribosomal RNA genes中的 23S rRNA 基因的第 1962 至 2466bp，共 505bp ;如 SEQ ID N0.10 所示。
[0062](2)用巢氏PCR的內(nèi)道引物(即等位基因特異性引物)進行PCR反應(yīng)
[0063]I)巢氏PCR內(nèi)道引物
[0064]內(nèi)道上游引物:
[0065]2142WT 23S 2142A-F 5’ -TCCTACCCGCGGCAAGACGGA-3J (SEQ ID N0.3)
[0066]2142MUT 23S A2142G-F 5，-TCCTACCCGCGGCAAGACGGG-3J (SEQ ID N0.4)
[0067]2143WT 23S 2143A-F 5’ -CCTACCCGCGGCAAGACGGAA-3J (SEQ ID N0.5)
[0068]2143MUT 23S A2143G-F 5’ -CCTACCCGCGGCAAGACGGAG-3J (SEQ ID N0.6)
[0069]2144WT 23S 2144A-F 5’ -TCCTACCCGCGGCAAGACGGAAA-3J (SEQ ID N0.7)
[0070]2144MUT 23S A2144G-F 5’ -TCCTACCCGCGGCAAGACGGAAG-3J (SEQ ID N0.8)
[0071]內(nèi)道下游引物:23S 2415-R 5’ -GCCATTACACTCAACTTGCGATTTC-3’ (SEQ ID N0.9)
[0072]注:WT指野生株，MUT指突變型。
[0073]2)反應(yīng)體系:10XPCR緩沖液2.5μ 1，10μΜ dNTP 1.0 μ 1，內(nèi)道上游引物 1.0 μ 1，內(nèi)道下游引物Ι.ομ l，Taq DNA聚合酶I μ I，雙蒸水17.5 μ I，外道PCR產(chǎn)物I μ I，共25 μ I。為明確幽門螺桿菌的突變類型，每份唾液樣本執(zhí)行6管的內(nèi)道PCR反應(yīng)，用以確定是否為2142野生型、2142突變型、2143野生型、2143突變型、2144野生型和2144突變型。
[0074]3)反應(yīng)條件:預(yù)變性 94°C 5min;變性 94°C 30s，退火 55°C 30s，延伸 72°C 30s，35個循環(huán)；延伸72°C 5min ;4°C保存。
[0075]4)得到幽門螺桿菌的23S and 5S ribosomal RNA genes (GenBank Access1n:N0.U27270)的 2122 ~2415bp，共 294bp，序列如 SEQ ID N0.11。其中 21_23bp “aaa” 為耐藥基因2142-2144突變位點。
[0076]4、瓊脂糖凝膠電泳
[0077]內(nèi)道PCR擴增后的產(chǎn)物在含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，并在紫外線透射儀下檢查有無特異擴增條帶。圖1顯示口腔唾液中Hp耐藥基因的檢測結(jié)果(與胃黏膜組織的檢測相對照)。
[0078]備注:加樣順序分別為:Maker、Twt2142 (胃黏膜組織2142野生株)、Tmut2142 (胃黏膜組織2142突變株)、Twt2143 (胃黏膜組織2143野生株)、Tmut2143 (胃黏膜組織2143突變株)、Twt2144(胃黏膜組織2144野生株)、Tmut2144(胃黏膜組織2144突變株)、Swt2142 ( 口腔唾液2142野生株)、Smut2H2 ( 口腔唾液2142突變株)、Swt2H3 ( 口腔唾液2143野生株)、Smut2143( 口腔唾液2143突變株)、Swt2144( 口腔唾液2144野生株)、Smut2144( 口腔唾液2144突變株)。
[0079]2142 突變株
[0080]分別在胃黏膜組織Tmut2142、Twt2143、Twt2144 出現(xiàn)條帶，Twt2142、Tmut2143、Tmut2144位點未出現(xiàn)條帶。唾液與胃黏膜的檢測結(jié)果一致。此標本為2142單位點突變純合株。
[0081]2143 突變株
[0082]分別在胃黏膜組織T1、T4、T5出現(xiàn)條帶，T2、T3、T6位點未出現(xiàn)條帶。唾液與胃黏膜的檢測結(jié)果一致。此標本為2143單位點突變純合株。
[0083]2144 突變株
[0084]分別在胃黏膜組織T1、T3、T6出現(xiàn)條帶，T2、T4、T5位點未出現(xiàn)條帶。唾液與胃黏膜的檢測結(jié)果一致。此標本為2144單位點突變純合株。
[0085]野生和突變混合株
[0086]快速尿素酶陽性的標本分別在胃黏膜組織Twt2142、Tmut2142、Twt2143、Tmut2143、Twt2144、Tmut2144均出現(xiàn)條帶。唾液與胃黏膜一致性相同。
[0087]野生株
[0088]快速尿素酶陽性的標本分別在胃黏膜組織Twt2142、Twt2143、Twt2144均出現(xiàn)條帶,而Tmut2142、Tmut2143、Tmut2144未出現(xiàn)條帶。唾液與胃黏膜組織的檢測條帶一致。
[0089]陰性對照株
[0090]Hp陰性的標本在胃黏膜組織和口腔唾液均未出現(xiàn)條帶。
[0091]由上圖可示:同一標本胃黏膜組織與口腔唾液的突變檢出基本一致，但從胃黏膜組織中擴增的條帶比從口腔唾液中擴增的條帶清晰，可能與胃黏膜組織中DNA的含量比唾液中DNA的含量高有關(guān)。
[0092]實施例2采集60例有上消化道癥狀且快速尿素酶試驗陽性病人的唾液和胃黏膜組織。采用基因組DNA 快速制備試劑盒(上海博彩生物科技有限公司)，分別從唾液和胃黏膜組織中抽提基因組DNA，采用兩種PCR法進行檢測。第一種為普通PCR法，以唾液(或胃黏膜組織)中基因組DNA為模板，采用等位基因特異性引物直接進行PCR擴增。第二種為巢氏PCR法，即第一輪PCR以唾液(或胃黏膜組織)中基因組DNA為模板，采用巢氏PCR外道引物進行擴增；第二輪PCR以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，采用等位基因特異性引物進行擴增。PCR結(jié)束后，普通PCR產(chǎn)物和巢氏PCR產(chǎn)物均在1.5%瓊脂糖凝膠中進行電泳，并用紫外線透射儀檢查有無特異擴增條帶，由此記錄陽性/陰性結(jié)果。60位患者中，巢式PCR胃黏膜組織的檢出率為92%，口腔唾液的檢出率為80% ;普通PCR組織的檢出率62%，口腔唾液的檢出率為63%，因此巢式PCR的檢出率明顯高于普通PCR的檢出率，且胃黏膜組織的檢出率大于口腔唾液的檢出率。
[0093]表160例胃黏膜組織中Hp耐藥基因的檢出情況

【權(quán)利要求】
1.一種檢測幽門螺桿菌的耐藥基因的方法，其特征在于:以待檢樣本基因組DNA為模板，用巢氏PCR外道引物進行PCR反應(yīng)；再以巢式PCR的外道產(chǎn)物作為模板，用等位基因特異性引物作為內(nèi)道弓丨物進行PCR ;內(nèi)道PCR擴增后的產(chǎn)物在含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，并在紫外線透射儀下檢查有無特異擴增條帶；在相應(yīng)的位置處，若出現(xiàn)亮光條帶，則為陽性；若無條帶，則為陰性；其中巢氏PCR特異性外道引物，其序列如SEQ ID N0.1和2所示；內(nèi)道引物序列如SEQ ID N0.3-9所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于:PCR反應(yīng)體系由10倍濃縮的PCR擴增反應(yīng)液、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物、雙蒸水、待檢樣本基因組DNA、陰性對照標本和DNA抽提試劑盒組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于所述的TaqDNA聚合酶，活性單位為8υ/μ L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于10倍濃縮的PCR擴增反應(yīng)液為1xTakara Taq TMBuffer (Mg2+ plus)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于.所述的陰性樣本為快速尿素酶和13C呼氣試驗陰性，且細菌培養(yǎng)陰性的標本。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于所述的DNA抽提試劑盒組成為:3SColumn、2.0ml coll tube、Digest1n Buffer、Solut1n B、Wash SoIut1nΛProteinasek、TE pH8.00
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于PCR反應(yīng)DNA的擴增條件如下: 1)反應(yīng)體系:10XPCR緩沖液5μ1，10μΜdNTP 1.0 μ 1，外道上游引物1.0 μ 1，外道下游引物Ι.Ομ l，Taq DNA聚合酶I μ 1，雙蒸水40 μ I，唾液的基因組DNA 1μ1，*50μ1; 2)反應(yīng)條件:預(yù)變性94°C5 min;變性94°C 30s，退火55°C 30 s，延伸72°C 30s, 35個循環(huán)；延伸72 °C 5 min ;4°C保存。
8.—種檢測幽門螺桿菌的耐藥基因的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括:一套巢式PCR特異性外道引物和6套等位基因特異性的內(nèi)道引物，反應(yīng)體系由10倍濃縮的PCR擴增反應(yīng)液、Taq DNA聚合酶、dNTP、內(nèi)道引物和外道引物、雙蒸水、待檢樣本基因組DNA、陰性對照標本和DNA抽提試劑盒組成； 所述的一套巢式PCR特異性外道引物和6套等位基因特異性的內(nèi)道引物如下: 1)巢氏PCR外道引物，其序列如SEQID N0.1和2所示； 2)巢氏PCR內(nèi)道引物；其序列如SEQID N0.3-9所示。
【文檔編號】C12Q1/68GK104164509SQ201410410194
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月19日
【發(fā)明者】季旻珺, 焦健華, 普漢明, 駱曉鳳, 屈保進, 錢明芳, 楊丙雅, 侯敏 申請人:南京醫(yī)科大學