一種采用酶復(fù)合改性降低大豆分離蛋白致敏性的方法
【專利摘要】一種采用酶復(fù)合改性降低大豆分離蛋白致敏性的方法，所述的方法包括：首先用Alcalase堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白，水解液經(jīng)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)，蛋白交聯(lián)產(chǎn)物在60-70℃下進行真空濃縮，再利用噴霧干燥得到含水量小于5%的大豆分離蛋白粉。本發(fā)明方法所得大豆分離蛋白粉致敏性低，產(chǎn)品經(jīng)ELISA檢測，致敏性下降為60.4-91.3%，且加工性能好，無不良風(fēng)味；具有良好的推廣和應(yīng)用前景，可廣泛用于食品、藥品等領(lǐng)域，特別適用作過敏患者的食品原料。
【專利說明】一種采用酶復(fù)合改性降低大豆分離蛋白致敏性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于?制品加工【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]大豆是我國主要的植物性蛋白食物資源，但同時也是8類主要過敏食物之一，目前約有0.3%-0.4%的嬰幼兒患有大豆過敏癥，隨著大豆制品種類和數(shù)量的增多，成年人大豆過敏的發(fā)病率也在不斷上升。顯而易見，大豆過敏已經(jīng)嚴重影響了部分人群的生活質(zhì)量，甚至危及生命。因此，開發(fā)低致敏性大豆制品，保護大豆過敏患者的攝入安全，具有重要的現(xiàn)實意義。
[0003]據(jù)有關(guān)文獻報道，降低大豆過敏原的加工方法主要有熱處理、輻照、酶法改性、糖基化反應(yīng)和發(fā)酵等。在這些方法中，酶解法是一種較常用的蛋白改性法。蛋白酶可以破壞大豆蛋白的一些過敏原表位，特別是其構(gòu)象表位，也可以通過斷裂一些化學(xué)鍵來破壞致敏原表位的一級結(jié)構(gòu)，從而降低或者消除大豆蛋白致敏性。因此，采用酶解法對大豆蛋白進行脫敏愈來愈受到人們關(guān)注。但是，水解過程中大量疏水基團的暴露，使得水解物帶有苦腥味。酶交聯(lián)是酶法改性蛋白質(zhì)的另一種有效方法，其中，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)己經(jīng)成為蛋白質(zhì)改性的研究熱點。酶交聯(lián)能使過敏原蛋白內(nèi)部多肽鏈之間或蛋白質(zhì)分子之間形成共價鍵，使原先暴露在表面的過敏原表位包埋入蛋白質(zhì)分子內(nèi)部而消除其致敏性，該方法已被應(yīng)用于低致敏性花生和牛奶等食品的開發(fā)；同時，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶還可以通過催化蛋白質(zhì)分子發(fā)生聚合，改善蛋白質(zhì)的功能特性(如乳化性和發(fā)泡性等)。由于酶水解和酶交聯(lián)兩種酶法改性在降低蛋白致敏性方面具有一定的互補性，這種酶復(fù)合改性法將為低致敏或無致敏大豆制品的開發(fā)提供一條很好的途徑。目前，基于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)大豆蛋白改善其加工特性的研究報道較多，而酶解結(jié)合酶交聯(lián)對大豆分離蛋白致敏性影響的研究還沒有相關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有酶解技術(shù)在降低過敏蛋白致敏性的不足之處，提供一種酶復(fù)合改性降低大豆分離蛋白致敏性的方法。
[0005]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。
[0006]本發(fā)明所述的一種采用酶復(fù)合改性降低大豆分離蛋白致敏性的方法，按以下步驟:
(I)用磷酸鹽緩沖溶液將大豆分離蛋白配制成濃度為10mg/mL的均勻溶液，之后轉(zhuǎn)移至水解罐，然后按酶活與蛋白底物的比例為5000-30000 U/g蛋白質(zhì)加入Alcalase堿性蛋白酶，混勻后于恒溫水浴鍋中水解，期間不斷攪拌，控制溫度為40-60°C，pH值6.0-9.0，水解時間為1.0-2.5 h，當水解度為15%-20%時，終止水解反應(yīng)，立即將水解樣放入沸水中加熱10 min滅酶，收集大豆分離蛋白酶解液。
[0007](2)取步驟(1)收集的蛋白酶解液攪拌預(yù)熱后，調(diào)整pH至7.0,按酶活與蛋白底物的比例為5.0-30.0U/g的量加入轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進行交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)體系溫度維持在40-60°C，時間為1.0-3.0 h，反應(yīng)結(jié)束后80°C加熱5min使酶失活，冷卻至室溫后調(diào)整pH至7.0。
[0008](3)將步驟(2)所處理的酶解液交聯(lián)產(chǎn)物在真空度為0.08 MPa、溫度為50°C的條件下，進行真空濃縮，濃縮至固形物在60%以上。
[0009](4)將步驟(3)所得的濃縮物在進風(fēng)口溫度為170_180°C、排風(fēng)口溫度80_85°C、進料溫度為60°C的條件下進行噴霧干燥，控制水分含量在5%以下得到低致敏大豆分離蛋白粉。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點是:1、本發(fā)明能顯著降低大豆分離蛋白的致敏性，產(chǎn)品經(jīng)ELISA檢測，致敏性下降為60.4-91.3% ;2、本發(fā)明方法所得大豆分離蛋白粉加工特性良好，營養(yǎng)價值高，且無苦腥味和其它不良風(fēng)味；3、本發(fā)明所得產(chǎn)品具有良好的推廣和應(yīng)用前景，可廣泛的用作過敏患者的食品原料。
【具體實施方式】
[0011 ] 本發(fā)明將通過以下具體實例作進一步說明。
[0012]實施例1。
[0013]1.低致敏大豆分離蛋白生產(chǎn)工藝。
[0014](I)用緩沖溶液將大豆分離蛋白配制成濃度為10mg/mL的均勻溶液，之后轉(zhuǎn)移至水解罐，然后按酶活與蛋白底物的比例為5000 U/g蛋白質(zhì)加入Alcalase堿性蛋白酶，混勻后于恒溫水浴鍋中水解，期間不斷攪拌，控制溫度為40°C，pH值9.0，水解時間為2.0 h，當水解度為15%時，終止水解反應(yīng)，立即將水解樣放入沸水中加熱10 min滅酶，調(diào)節(jié)pH至一定值，收集大豆分離蛋白酶解液。
[0015](2)取步驟(I)收集的蛋白酶解液攪拌預(yù)熱后，調(diào)整pH至7.0，按酶活與蛋白底物的比例為5.0U/g的量加入轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進行交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)體系溫度維持在60°C，時間為
2.0 h，反應(yīng)結(jié)束后80°C加熱5min使酶失活，冷卻至室溫后調(diào)整pH至7.0。
[0016](3)將步驟(2)所處理的酶解液交聯(lián)產(chǎn)物在真空度為0.08 MPa、溫度為50°C的條件下，進行真空濃縮，濃縮至固形物在60%以上。
[0017](4)將步驟(3)所得的濃縮物在進風(fēng)口溫度為170°C，排風(fēng)口溫度80°C，進料溫度為60°C的條件下進行噴霧干燥，控制水分含量在5%以下得到低致敏大豆分離蛋白粉。
[0018]2.產(chǎn)品致敏性檢測。
[0019]通過間接ELISA檢測IgE結(jié)合能力反映產(chǎn)品的致敏性變化。
[0020]將酶復(fù)合改性處理后的大豆分離蛋白溶液稀釋至2.5 μ g /mL,在酶標板上每孔加入100 μ L，以未處理大豆分離蛋白溶液為對照。4°C過夜后，PBST洗板三次，每次5min，拍干。每孔加入250 μ L 3%明膠，37°C封阻lh，洗板三次。另準備一塊酶標板將倍比稀釋的競爭抗原以同樣的方式進行封阻，洗板之后，每孔加入1:20稀釋度的人血清100 μ L，37°C反應(yīng)lh。反應(yīng)結(jié)束后，每孔吸取100 μ L轉(zhuǎn)移至第一塊板內(nèi)，37°C孵育lh，PBST洗板三次。每孔加入100μL稀釋 5000 倍的HRP標記羊抗人IgE，37°C反應(yīng)lh，PBST洗滌拍干。每孔加入OPD顯色液100μ L，37°C避光反應(yīng)15min后，每孔50 μ L加入2M H2SO4終止液，在490nm處用酶標儀測定OD值。
[0021]IgE結(jié)合能力(％)= (1-B/B0) X 100%, BO:無競爭蛋白時的OD值；B:各加工條件下競爭蛋白對應(yīng)的OD值。
[0022]致敏性降低(％)= (1-1gE#p/ IgE對照)X 100%，采用本發(fā)明所述方法處理的大豆分離蛋白，樣品的致敏性下降為60.4%。
[0023]實施例2。
[0024]1.低致敏大豆分離蛋白生產(chǎn)工藝。
[0025](I)用磷酸鹽緩沖溶液將大豆分離蛋白配制成濃度為10mg/mL的均勻溶液，之后轉(zhuǎn)移至水解罐，然后按酶活與蛋白底物的比例為10000 U/g蛋白質(zhì)加入Alcalase堿性蛋白酶，混勻后于恒溫水浴鍋中水解，期間不斷攪拌，控制溫度為45°C，pH值7.0，水解時間為1.5 h，當水解度為17%時，終止水解反應(yīng)，立即將水解樣放入沸水中加熱10 min滅酶，調(diào)節(jié)pH至一定值，收集大豆分離蛋白酶解液。
[0026](2)取步驟(I)收集的蛋白酶解液攪拌預(yù)熱后，調(diào)整pH至7.0，按酶活與蛋白底物的比例為10.0U/g的量加入轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進行交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)體系溫度維持在50°C，時間為3.0 h，反應(yīng)結(jié)束后80°C加熱5min使酶失活，冷卻至室溫后調(diào)整pH至7.0。
[0027](3)將步驟(2)所處理的酶解液交聯(lián)產(chǎn)物在真空度為0.08 MPa、溫度為50°C的條件下，進行真空濃縮，濃縮至固形物在60%以上。
[0028](4)將步驟(3)所得的濃縮物在進風(fēng)口溫度為175°C，排風(fēng)口溫度80°C，進料溫度為60°C的條件下進行噴霧干燥，控制水分含量在5%以下得到低致敏大豆分離蛋白粉。
[0029]2.產(chǎn)品致敏性檢測。
[0030]檢測方法同實施例1，采用本發(fā)明所述方法處理的大豆分離蛋白，樣品的致敏性下降為83.7%。
[0031]實施例3。
[0032]1.低致敏大豆分離蛋白生產(chǎn)工藝。
[0033](I)用磷酸鹽緩沖溶液將大豆分離蛋白配制成濃度為10mg/mL的均勻溶液，之后轉(zhuǎn)移至水解罐，然后按酶活與蛋白底物的比例為20000 U/g蛋白質(zhì)加入Alcalase堿性蛋白酶，混勻后于恒溫水浴鍋中水解，期間不斷攪拌，控制溫度為50°C，pH值8.0，水解時間為
2.0 h，當水解度為20%時，終止水解反應(yīng)，立即將水解樣放入沸水中加熱10 min滅酶，調(diào)節(jié)pH至一定值,收集大豆分離蛋白酶解液。
[0034](2)取步驟(I)收集的蛋白酶解液攪拌預(yù)熱后，調(diào)整pH至7.0，按酶活與蛋白底物的比例為20.0U/g的量加入轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進行交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)體系溫度維持在50°C，時間為2.0 h，反應(yīng)結(jié)束后80°C加熱5min使酶失活，冷卻至室溫后調(diào)整pH至7.0。
[0035](3)將步驟(2)所處理的酶解液交聯(lián)產(chǎn)物在真空度為0.08 MPa、溫度為50°C的條件下，進行真空濃縮，濃縮至固形物在60%以上。
[0036](4)將步驟(3)所得的濃縮物在進風(fēng)口溫度為180°C，排風(fēng)口溫度85°C，進料溫度為60°C的條件下進行噴霧干燥，控制水分含量在5%以下得到低致敏大豆分離蛋白粉。
[0037]2.產(chǎn)品致敏性檢測。
[0038]檢測方法同實施例1，采用本發(fā)明所述方法處理的大豆分離蛋白，樣品的致敏性下降為91.3%ο
[0039]實施例4。
[0040]1.低致敏大豆分離蛋白生產(chǎn)工藝。[0041](I)用磷酸鹽緩沖溶液將大豆分離蛋白配制成濃度為10mg/mL的均勻溶液，之后轉(zhuǎn)移至水解罐，然后按酶活與蛋白底物的比例為30000 U/g蛋白質(zhì)加入Alcalase堿性蛋白酶，混勻后于恒溫水浴鍋中水解，期間不斷攪拌，控制溫度為60°C，pH值9.0，水解時間為
1.0 h，當水解度為18%時，終止水解反應(yīng)，立即將水解樣放入沸水中加熱10 min滅酶，調(diào)節(jié)pH至一定值，收集大豆分離蛋白酶解液。
[0042](2)取步驟(1)收集的蛋白酶解液攪拌預(yù)熱后，調(diào)整pH至7.0，按酶活與蛋白底物的比例為30.0U/g的量加入轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進行交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)體系溫度維持在40°C，時間為1.0 11，反應(yīng)結(jié)束后801:加熱51^11使酶失活，冷卻至室溫后調(diào)整？!1至7.0。
[0043](3)將步驟(2)所處理的酶解液交聯(lián)產(chǎn)物在真空度為0.08 MPa、溫度為50°C的條件下，進行真空濃縮，濃縮至固形物在60%以上。
[0044](4)將步驟(3)所得的濃縮物在進風(fēng)口溫度為175°C，排風(fēng)口溫度85°C，進料溫度為60°C的條件下進行噴霧干燥，控制水分含量在5%以下得到低致敏大豆分離蛋白粉。
[0045]2.產(chǎn)品致敏性檢測。
[0046]檢測方法同實施例1，采用本發(fā)明所述方法處理的大豆分離蛋白，樣品的致敏性下降為78.9 %.
【權(quán)利要求】
1.一種采用酶復(fù)合改性降低大豆分離蛋白致敏性的方法，其特征是按以下步驟: (1)用磷酸鹽緩沖溶液將大豆分離蛋白配制成濃度為10mg/mL的均勻溶液，之后轉(zhuǎn)移至水解罐，然后按酶活與蛋白底物的比例為5000-30000 U/g蛋白質(zhì)加入Alcalase堿性蛋白酶，混勻后于恒溫水浴鍋中水解，期間不斷攪拌，控制溫度為40-60°C，pH值6.0-9.0,水解時間為1.0-2.5 h，當水解度為15%-20%時，終止水解反應(yīng)，立即將水解樣放入沸水中加熱10 min滅酶,收集大豆分離蛋白酶解液； (2)取步驟(I)收集的蛋白酶解液攪拌預(yù)熱后，調(diào)整pH至7.0，按酶活與蛋白底物的比例為5.0-30.0U/g的量加入轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進行交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)體系溫度維持在40-60°C，時間為1.0-3.0 h，反應(yīng)結(jié)束后80°C加熱5min使酶失活，冷卻至室溫后調(diào)整pH至7.0 ; (3)將步驟(2)所處理的酶解液交聯(lián)產(chǎn)物在真空度為0.08 MPa、溫度為50°C的條件下，進行真空濃縮，濃縮至固形物在60%以上； (4)將步驟(3)所得的濃縮物在進風(fēng)口溫度為170-180°C、排風(fēng)口溫度80-85°C、進料溫度為60°C的條件下進行噴霧干燥，控制水分含量在5%以下得到低致敏大豆分離蛋白粉。
【文檔編號】A23J3/16GK103652315SQ201310568332
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月15日
【發(fā)明者】楊安樹, 陳紅兵, 吳志華, 李欣, 佟平 申請人:南昌大學(xué)