氨糖類產(chǎn)品中甲殼源致敏性物質(zhì)的pcr檢測技術(shù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種通過PCR技術(shù)檢測氨糖類產(chǎn)品中是 否含有甲殼源致敏物質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 氨基葡萄糖指的是葡萄糖的一個羥基被一個氨基取代的化合物。分子式C6H 13O5N, 俗稱氨基糖，簡稱氨糖，又名葡萄糖胺，廣泛存在于自然界，2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖通常 以N-乙?；苌?如甲殼素）或以N-硫酸酯和N-乙酰-3-0-乳酸醚(胞壁酸）形式存在 于微生物、動物來源的多糖和結(jié)合多糖中。因此可以從微生物（以絲狀真菌、高等真菌為主） 或甲殼類動物(蝦蟹）殼中提取氨糖。
[0003] 氨基葡萄糖是形成軟骨細胞的重要營養(yǎng)素，是健康關(guān)節(jié)軟骨的天然組織成份。隨 著年齡的增長，人體內(nèi)的氨基葡萄糖的缺乏越來越嚴重，關(guān)節(jié)軟骨不斷退化和磨損。美國、 歐洲和日本的大量醫(yī)學(xué)研究表明：氨基葡萄糖可以幫助修復(fù)和維護軟骨，并能刺激軟骨細 胞的生長。
[0004] 氨糖能舒緩因關(guān)節(jié)炎引起的疼痛、僵硬和腫脹：骨質(zhì)疏松癥使軟骨耗損，最終導(dǎo)致 碎裂剝落，關(guān)節(jié)少了軟骨的緩沖，易產(chǎn)生痛苦的僵硬和發(fā)炎，而氨糖有助于修復(fù)受損軟骨， 刺激新軟骨的生成，改善發(fā)炎癥狀，舒緩關(guān)節(jié)疼痛、僵硬及腫脹；能強化軟骨結(jié)構(gòu)，預(yù)防關(guān)節(jié) 功能失效：隨著身體老化，關(guān)節(jié)組織會嚴重磨損，氨糖可以保護并強化軟骨結(jié)構(gòu)，預(yù)防因關(guān) 節(jié)老化而產(chǎn)生的關(guān)節(jié)功能失效；能潤滑關(guān)節(jié)及維持關(guān)節(jié)功能：氨糖可制造蛋白多糖潤滑關(guān) 節(jié)，防止骨關(guān)節(jié)摩擦疼痛，使關(guān)節(jié)活動自如。氨糖在美國食品藥品監(jiān)督管理局作為膳食添加 劑進行管理，在歐洲，氨基葡萄糖被批準為藥物，以硫酸鹽的形式銷售。
[0005] 然而在聯(lián)合國糧農(nóng)組織提出的8大類引起過敏的食物中，蝦、蟹等甲殼類動物及 其制品是重要的一類致敏原。因此，源自甲殼類的氨糖有可能因為蝦、蟹肉（蛋白）的清除不 徹底，導(dǎo)致易過敏人群服用后發(fā)生過敏。所以對氨糖進行甲殼源致敏性物質(zhì)的檢測可以預(yù) 防相應(yīng)人群的發(fā)生誤服過敏，并為氨糖的原料來源鑒定提供技術(shù)基礎(chǔ)，為產(chǎn)品標志提供依 據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一種利用PCR技術(shù)對氨糖產(chǎn)品進行檢測的方法，能夠快速、方便、準 確的獲知氨糖及其產(chǎn)品中是否含有甲殼類致敏原物質(zhì)。具體方法如下： (1)擴增引物序列： crustaceanI F5' -TCTAAGCTGCGTACATATCG-3' crustaceanI R5' -ATTATCACACTATTTCCTAC -3' 擴增片段長度為140bp ; crustacean2 F5' -CGCTAATCCAACAAGACAT -3' crustacean2 R5' -CCATTCTGAACAGACATCA -3' 擴增片段長度為150bp。
[0007] (2 )待測樣品的DNA提取 處理方法按照 Universal Genomic DNA Extraction Kit TaKaRa，Ver. 3.0,抽提樣品 DM。
[0008] (3) PCR 擴增 PCR反應(yīng)采用25 μ L體系，按以下組分配制PCR反應(yīng)液：10 X PCR緩沖液2 μ L，10 μ mol/ L的正向和反向引物各I yL，dNTP (10mmol/L)2yL，Taq DNA聚合酶（5U/yL)0. 2yL，模板 DNA (含 50±10ngDNA)lyL，加 dH20 補足 25yL。PCR 反應(yīng)條件如下：94°C3min，94°C lmin， 66°C lmin，72°C lmin，35個循環(huán)；72°C 7min結(jié)束反應(yīng)。4°C保存反應(yīng)產(chǎn)物，產(chǎn)物采用2%瓊 脂糖凝膠電泳進行觀察。
[0009] 本發(fā)明的優(yōu)點：首次提出使用PCR方法檢測氨糖中可能存在的甲殼源致敏物質(zhì)， 為提供高質(zhì)量的氨糖提供了快速、方便的方法。
[0010]
【具體實施方式】
[0011] 實施例1采用蝦、蟹殼制備的氨基葡萄糖樣品檢測 將蝦、蟹殼通過水解、脫色、濃縮、結(jié)晶、烘干的方法制備氨基葡萄糖(參考中國專利[0012] 結(jié)果顯示，兩種引物均擴增出明顯的相應(yīng)條帶，提示在氨糖制備過程中，可能殘留 蝦、蟹肉（蛋白質(zhì)）未清除干凈，對于特定人群是潛在的致敏源。
[0013] 實施例2采用真菌菌絲體提取的幾丁質(zhì)制備的氨基葡萄糖樣品檢測 利用幾丁質(zhì)制備氨基葡萄糖，步驟如下：微生物發(fā)酵產(chǎn)幾丁質(zhì)酶；獲取粗酶液；濃縮酶 液；生產(chǎn)N-乙酰氨基葡萄糖（具體方法參考中國專利公開號CN104388496A)。采用試劑盒 Universal Genomic DNA Extraction Kit TaKaRa，Ver. 3.0提取其中的DNA，然后進行PCR。 PCR條件見下： 擴增引物序列：crustaceanl F5'-TCTAAGCTGCGTACATATCG-3'，crustaceanl R5'-ATTATCACACTATTTCCTAC -3'，擴增片段長度為 140bp;crustacean2 F5' -CGCTAATCCAACAAGACAT -3'，crustacean2 R5' -CCATTCTGAACAGACATCA -3'，擴增片段 長度為150bp。 PCR反應(yīng)采用25 μ L體系，按以下組分配制PCR反應(yīng)液：10XPCR緩沖液 2 41^，1〇4111〇1/1的正向和反向引物各141^(1犯13(10臟〇1/1)2 41^丁&9〇嫩聚合酶（51]/ 4 1〇0.2 4 1^，模板0嫩（含50±10即0嫩）14 1^，加(1!120補足25 4匕？0?反應(yīng)條件如下： 94°C 3min，94°C lmin，66°C lmin，72°C lmin，35 個循環(huán)；72°C 7min 結(jié)束反應(yīng)。4°C保存反應(yīng) 產(chǎn)物，產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳進行觀察。
[0014] 結(jié)果顯示，兩種引物均未擴增出相應(yīng)條帶，該氨糖對甲殼類過敏人群是安全的。
[0015] 實施例3市售氨糖產(chǎn)品的檢測 購買市售氨糖產(chǎn)品，分別為：樣品1鹽酸氨基葡萄糖膠囊，樣品2硫酸氨基葡萄糖鉀膠 囊，樣品3氨糖軟骨素加鈣片，樣品4氨糖軟骨素透明質(zhì)酸膠囊。采用試劑盒Universal Genomic DNA Extraction Kit TaKaRa，Ver. 3.0 提取其中的 DNA，然后進行 PCR。PCR 條件 見下： 擴增引物序列：crustaceanl F5'-TCTAAGCTGCGTACATATCG-3'，crustaceanl R5'-ATTATCACACTATTTCCTAC -3'，擴增片段長度為 140bp;crustacean2 F5' -CGCTAATCCAACAAGACAT -3'，crustacean2 R5' -CCATTCTGAACAGACATCA -3'，擴增片段 長度為150bp。 PCR反應(yīng)采用25 μ L體系，按以下組分配制PCR反應(yīng)液：10XPCR緩沖液 2 41^，1〇4111〇1/1的正向和反向引物各141^(1犯13(10臟〇1/1)2 41^丁&9〇嫩聚合酶（51]/ μ UO. 2 μ L，模板 DNA (含 50± IOngDNAM μ L，加 ClH2O 補足 25 μ L。PCR 反應(yīng)條件如下： 94°C 3min，94°C lmin，66°C lmin，72°C lmin，35 個循環(huán)；72°C 7min 結(jié)束反應(yīng)。4°C保存反應(yīng) 產(chǎn)物，產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳進行觀察。
[0016] 結(jié)果見下表
該結(jié)果提示，樣品1、樣品2、樣品4中的氨糖均來源于甲殼類提取，對易過敏人群是不 安全的；樣品3的氨糖未見擴增條帶，可以安全使用。
【主權(quán)項】
1. 一種利用PCR技術(shù)對氨糖產(chǎn)品進行檢測的方法，可以根據(jù)結(jié)果判斷氨糖中是否含有 甲殼類致敏源，具體特征為PCR引物如下所示： crustacean I F5> -TCTAAGCTGCGTA CA TA TCG- 3>，crustacean1 R5'-ATTATCACACTAITTCCTAC-3'，擴增片段長度為 140bp ;crustacean2 F5'-CGCTAATCCAA CAAGACAT-3'，crustacean2 R5'-CCAITCTGAACAGACATCA-3'，擴增片段長度為 150bp〇2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征為PCR條件如下：采用25 y L體系，按以下組分配 制PCR反應(yīng)液=IOXPCR緩沖液2 yL，IOy mol/L的正向和反向引物各I yL，dNTP( IOmmol/ U2yL，Taq DNA聚合酶（5U/yU〇.2yL，豐莫板 DNA (含 50±10ngDNA) lyL，加 dH20 補足 25 y L ; 94°C 3min，94。。Imin，66。。Imin，72。。Imin，35 個循環(huán)；72 cC 7min 結(jié)束反應(yīng)；4cC 保 存反應(yīng)產(chǎn)物，產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳進行觀察。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種利用PCR技術(shù)對氨糖產(chǎn)品進行檢測的方法，能夠快速、方便、準確的獲知氨糖及其產(chǎn)品中是否含有甲殼類致敏原物質(zhì)。樣品抽提DNA后，利用本發(fā)明提供的PCR引物及條件進行擴增，瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增結(jié)果。結(jié)果陽性提示含有甲殼類致敏源，陰性表示不含。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105018627
【申請?zhí)枴緾N201510482785
【發(fā)明人】史勁松, 耿燕, 龔勁松, 錢建瑛
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2015年11月4日
【申請日】2015年8月10日