專利名稱：一種抗結(jié)核多肽的免疫制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗結(jié)核多肽的免疫制備方法，屬免疫醫(yī)學(xué)和生物制藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是一種由結(jié)合分枝桿菌引起的嚴(yán)重危害人民健康的慢性傳染病，目前全球有約20億人被感染。我國(guó)是結(jié)核病的重災(zāi)區(qū)之一，每年死亡人數(shù)是其他傳染病死亡人數(shù)的總和的2倍以上?？菇Y(jié)核化學(xué)藥物治療對(duì)控制結(jié)核病具有較好療效，但存在服藥時(shí)間長(zhǎng)和易產(chǎn)生耐藥性等問題。
抗結(jié)核多肽能傳遞結(jié)核桿菌的特異性細(xì)胞免疫信息，具有調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體特異性抗結(jié)核感染的細(xì)胞免疫的功能。當(dāng)其進(jìn)入人體后，可使患者的正常T細(xì)胞轉(zhuǎn)變成特異性致敏T細(xì)胞。致敏T細(xì)胞分為殺傷性致敏T細(xì)胞(TC)和遲發(fā)型超敏反應(yīng)性T細(xì)胞(TDTH)兩種。殺傷性致敏T細(xì)胞(TC)能對(duì)帶有結(jié)核桿菌寄生的細(xì)胞實(shí)行特異性殺傷，遲發(fā)型超敏反應(yīng)性T細(xì)胞(TDTH)則可釋放出多種淋巴因子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)殺傷結(jié)核桿菌作用。同時(shí)釋放的淋巴因子又可使機(jī)體內(nèi)其他淋巴細(xì)胞致敏，形成更多的效應(yīng)淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)、擴(kuò)大細(xì)胞免疫效應(yīng)，從而達(dá)到調(diào)節(jié)人體特性免疫功能。尤其對(duì)臨床上的難治性結(jié)核病人顯示出明顯療效。
國(guó)內(nèi)外多采用純蛋白衍生物(purified protein derivative,PPD)或卡介苗單次免疫制備抗結(jié)核多肽，其免疫效果不穩(wěn)定，進(jìn)而容易特異性免疫效果低的問題。且其多肽的提取多采用反相色譜法進(jìn)行分離純化，也有少數(shù)用親和色譜法(抗原吸咐柱層析分離純化) 進(jìn)行分離純化的報(bào)道，親和色譜法分離純化特異性有效組分相對(duì)快、步驟簡(jiǎn)單，但需要大量可溶性抗原擴(kuò)相應(yīng)抗體，在短期內(nèi)難以完成，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種抗結(jié)核多肽的免疫制備方法，該制備工藝簡(jiǎn)便可控，制備的抗結(jié)核多肽的白細(xì)胞粘附抑制率可達(dá)33. 9-38%。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種抗結(jié)核多肽的免疫制備方法，其特征在于它是以卡介苗脂質(zhì)體皮下注射健康豬， 使其進(jìn)行免疫反應(yīng)，其中所述的卡介苗脂質(zhì)體是由卡介苗和免疫增強(qiáng)劑混合而得；取免疫健康豬的脾和淋巴結(jié)，去脂肪及粘膜，得待處理物，向待處理物中加入生理鹽水，搗碎制取勻漿；將勻漿于一 20 一 30°C反復(fù)凍融后經(jīng)超濾膜超濾，得到的濾液為抗結(jié)核多肽粗品； 再經(jīng)白細(xì)胞粘附抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)得其白細(xì)胞粘附抑制率滿足33. 9-38%的范圍值要求后，經(jīng)交聯(lián)葡聚糖凝膠層析柱分離純化，冷凍干燥，得到抗結(jié)核多肽。
按上述方案，所述免疫增強(qiáng)劑為不完全弗氏佐劑和卵磷脂、殼聚糖兩者中至少一種的混合，當(dāng)不完全弗氏佐劑和卵磷脂兩者混合時(shí)，兩種的質(zhì)量比為1: O. 2-2， 當(dāng)不完全弗氏佐劑和殼聚糖兩種混合時(shí)，兩者的質(zhì)量比為1:0. 2-1 ;當(dāng)不完全弗氏佐劑、卵磷脂和殼聚糖三種混合時(shí)，三者的質(zhì)量比為1: O. 2-1 :0. 2-0. 8。
按上述方案，所述的卡介苗脂質(zhì)體為將卡介苗和免疫增強(qiáng)劑按質(zhì)量比為1:O.7-3. O，混合后超聲處理30-60min而得，其中卡介苗的用量為O. 1-0. 6mg/Kg豬。
按上述方案，所述的注射為每10天一次，連續(xù)注射3 6次。
按上述方案，所述的凍融次數(shù)為3 7次。
按上述方案，按重量比計(jì)，所述的生理鹽水的用量為待處理物的I 3倍。
按上述方案，所述超濾膜的孔徑為3000 8000道爾頓。
按上述方案，所述交聯(lián)葡聚糖凝膠層析柱為交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G_15層析柱或交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G_25層析柱。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明針對(duì)特定免疫對(duì)象豬，采用設(shè)定用量的卡介苗和特定的免疫增強(qiáng)劑混合而得的卡介苗脂質(zhì)體通過皮下注射健康豬，經(jīng)周期性多次注射免疫，可顯著地提高其特異性免疫效果，而達(dá)到增加特異性抗結(jié)核多肽產(chǎn)量的效果，同時(shí)降低制備成本，由此制備而得的抗結(jié)核多肽的白細(xì)胞粘附抑制率可達(dá)33. 9-38%。
具體實(shí)施方式
以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的發(fā)明內(nèi)容作詳細(xì)說明。
實(shí)施例1將卡介苗20mg和不完全弗氏佐劑10mg、卵磷脂3mg、殼聚糖2mg于超聲波下混合攪拌 40min,制成卡介苗脂質(zhì)體。選取50-60公斤的健康豬,皮下注射卡介苗脂質(zhì)體，每10天注射一次，連續(xù)注射4次。宰殺卡介苗免疫的健康豬。取其豬脾和淋巴結(jié)，去脂肪及粘膜，得待處理物，向待處理物中加入重量比為1:2的生理鹽水，用組織搗碎勻漿機(jī)搗碎制取勻漿。于零下20度反復(fù)凍融4次后，再用5000道爾頓超濾膜超濾，得到的濾液為抗結(jié)核多肽粗品。經(jīng)白細(xì)胞粘附抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，得白細(xì)胞粘附抑制率為37. 1%，再采用交聯(lián)葡 聚糖凝膠Sephadex G-15層析柱分離純化，冷凍干燥，得到抗結(jié)核多肽。
實(shí)施例2將卡介苗25mg和不完全弗氏佐劑15mg、卵磷脂4mg、殼聚糖3. 5mg于超聲波下混合攪拌60min,制成卡介苗脂質(zhì)體。選取60-70公斤的健康豬,皮下注射卡介苗脂質(zhì)體，每10天注射一次，連續(xù)注射5次。宰殺卡介苗免疫的健康豬。取其豬脾和淋巴結(jié)，去脂肪及粘膜，得待處理物，向待處理物中加入重量比為1:3的生理鹽水，用組織搗碎勻漿機(jī)搗碎制取勻漿。 于一 30度反復(fù)凍融5次后，再用6000道爾頓膜超濾，得到的濾液為抗結(jié)核多肽粗品。經(jīng)白細(xì)胞粘附抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，得白細(xì)胞粘附抑制率為33. 9%，再采用交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G-15層析柱分離純化，冷凍干燥，得到抗結(jié)核多肽。
實(shí)施例3將卡介苗15mg和不完全弗氏佐劑8mg、卵磷脂2mg、殼聚糖1. 6mg于超聲波下混合攪拌 60min,制成卡介苗脂質(zhì)體。選取40-50公斤的健康豬,皮下注射卡介苗脂質(zhì)體，每10天注射一次，連續(xù)注射3次。宰殺卡介苗免疫的健康豬。取其豬脾和淋巴結(jié)，去脂肪及粘膜，得待處理物，向待處理物中加入重量比為1:2的生理鹽水，用組織搗碎勻漿機(jī)搗碎制取勻漿。于零下30度反復(fù)凍融3次后，再用5000道爾頓膜超濾，得到的濾液為抗結(jié)核多肽粗品，經(jīng)白細(xì)胞粘附抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，得白細(xì)胞粘附抑制率為35. 2%。再采用交聯(lián)葡聚糖凝膠SephadexG-15層析柱分離純化，冷凍干燥，得到抗結(jié)核多肽。
實(shí)施例4將卡介苗28mg和不完全弗氏佐劑15mg、卵磷脂4mg、殼聚糖3. 5mg于超聲波下混合攪拌60min,制成卡介苗脂質(zhì)體。選取50-60公斤的健康豬,皮下注射卡介苗脂質(zhì)體，免疫健康豬每10天一次，連續(xù)注射5次。宰殺卡介苗免疫的健康豬。取其豬脾和淋巴結(jié)，去脂肪及粘膜，得待處理物，向待處理物中加入重量比為1:1的生理鹽水，用組織搗碎勻漿機(jī)搗碎制取勻漿。于零下20度反復(fù)凍融4次后，再用5000道爾頓膜超濾，得到的濾液為抗結(jié)核多肽粗品。經(jīng)白細(xì)胞粘附抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，得白細(xì)胞粘附抑制率為37.9%，再采用交聯(lián)葡聚糖凝膠 Sephadex G_25層析柱分離純化,冷凍干燥,得到抗結(jié)核多肽。
實(shí)施例5將卡介苗6mg和不完全弗氏佐劑7mg、卵磷脂6mg、殼聚糖5mg于超聲波下混合攪拌 40min,制成卡介苗脂質(zhì)體。選取50-60公斤的健康豬,皮下注射卡介苗脂質(zhì)體，每10天注射一次，連續(xù)注射4次。宰殺卡介苗免疫的健康豬。取其豬脾和淋巴結(jié)，去脂肪及粘膜，得待處理物，向待處理物中加入重量比為1:2的生理鹽水，用組織搗碎勻漿機(jī)搗碎制取勻漿。于零下20度反復(fù)凍融4次后，再用6000道爾頓超濾膜超濾，得到的濾液為抗結(jié)核多肽粗品。經(jīng)白細(xì)胞粘附抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，得白細(xì)胞粘附抑制率為34. 7%，再采用交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G-15層析柱分離純化，冷凍干燥，得到抗結(jié)核多肽。
實(shí)施例6將卡介苗30mg和不完全弗氏佐劑15mg、殼聚糖6mg于超聲波下混合攪拌60min,制成卡介苗脂質(zhì)體。選取50-60公斤的健康豬，皮下注射卡介苗脂質(zhì)體，每10天注射一次，連續(xù)注射5次。宰殺卡介苗免疫的健康豬。取其豬脾和淋巴結(jié)，去脂肪及粘膜，得待處理物，向待處 理物中加入重量比為1:2的生理鹽水，用組織搗碎勻漿機(jī)搗碎制取勻漿。于零下20度反復(fù)凍融4次后，再用5000道爾頓超濾膜超濾，得到的濾液為抗結(jié)核多肽粗品。經(jīng)白細(xì)胞粘附抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，得白細(xì)胞粘附抑制率為35. 4%，再采用交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G_15 層析柱分離純化，冷凍干燥，得到抗結(jié)核多肽。
權(quán)利要求
1.一種抗結(jié)核多肽的免疫制備方法，其特征在于它是以卡介苗脂質(zhì)體皮下注射健康豬，使其進(jìn)行免疫反應(yīng)，其中所述的卡介苗脂質(zhì)體是由卡介苗和免疫增強(qiáng)劑混合而得；取免疫健康豬的脾和淋巴結(jié)，去脂肪及粘膜，得待處理物，向待處理物中加入生理鹽水，搗碎制取勻漿；將勻漿于一 20 一 30°C反復(fù)凍融后經(jīng)超濾膜超濾，得到的濾液為抗結(jié)核多肽粗品；再經(jīng)白細(xì)胞粘附抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)得其白細(xì)胞粘附抑制率滿足33. 9-38%的范圍值要求后， 經(jīng)交聯(lián)葡聚糖凝膠層析柱分離純化，冷凍干燥，得到抗結(jié)核多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗結(jié)核多肽的免疫制備方法，其特征在于所述免疫增強(qiáng)劑為不完全弗氏佐劑和卵磷脂、殼聚糖兩者中至少一種的混合，當(dāng)不完全弗氏佐劑和卵磷脂兩者混合時(shí)，兩種的質(zhì)量比為1: O. 2-2，當(dāng)不完全弗氏佐劑和殼聚糖兩種混合時(shí)，兩者的質(zhì)量比為1:0. 2-1 ;當(dāng)不完全弗氏佐劑、卵磷脂和殼聚糖三種混合時(shí)，三者的質(zhì)量比為1:O.2~1 :0· 2_0· 8ο
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗結(jié)核多肽的免疫制備方法，其特征在于所述的卡介苗脂質(zhì)體為將卡介苗和免疫增強(qiáng)劑按質(zhì)量比為1:0. 7-3. 0，混合后超聲處理30-60min而得，其中卡介苗的用量為O. 1-0. 6mg/Kg豬。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗結(jié)核多肽的免疫制備方法，其特征在于所述的注射為每 10天一次,連續(xù)注射3 6次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗結(jié)核多肽的免疫制備方法，其特征在于所述的凍融次數(shù)為3 7次。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗結(jié)核多肽的免疫制備方法，其特征在于按重量比計(jì)，所述的生理鹽水的用量為待處理物的I 3倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗結(jié)核多肽的免疫制備方法，其特征在于所述超濾膜的孔徑為3000 8000道爾頓。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗結(jié)核多肽的免疫制備方法，其特征在于所述交聯(lián)葡聚糖凝膠層析柱為交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G_15層析柱或交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G_25層析柱。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗結(jié)核多肽的免疫制備方法。其特征在于它是以卡介苗脂質(zhì)體皮下注射健康豬，使其進(jìn)行免疫反應(yīng)，其中所述的卡介苗脂質(zhì)體是由卡介苗和免疫增強(qiáng)劑混合而得；取免疫健康豬的脾和淋巴結(jié)，去脂肪及粘膜，得待處理物，向待處理物中加入生理鹽水，搗碎制取勻漿；將勻漿于-20～-30℃反復(fù)凍融后經(jīng)超濾膜超濾，得到的濾液為抗結(jié)核多肽粗品；再經(jīng)白細(xì)胞粘附抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)得其白細(xì)胞粘附抑制率滿足33.9-38%的范圍值要求后，經(jīng)交聯(lián)葡聚糖凝膠層析柱分離純化，冷凍干燥，得到抗結(jié)核多肽。該制備工藝簡(jiǎn)便可控，制備的抗結(jié)核多肽的白細(xì)胞粘附抑制率可達(dá)33.9-38%。
文檔編號(hào)C07K16/12GK103059134SQ20131001816
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月18日
發(fā)明者吳建國(guó), 鄧兆群, 張儒林, 楊小鋼, 劉君炎, 劉勝武, 屈雪菊, 譚秋萍 申請(qǐng)人:武漢輝斯特科技有限公司