一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基及其制備方法
【專利摘要】一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基及其制備方法，屬于獸用生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】。其每1000ml磷酸緩沖液中含有PPLO20～50g、酵母粉2～10g、葡萄糖3～15g、1%酚紅0.5～4ml、氨基酸組合2～10g、復(fù)方中藥多糖15～30g和豬血清50～100ml。本發(fā)明的豬肺炎支原體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)豬肺炎支原體時(shí)可以提高豬肺炎支原體耐受力，降低豬肺炎支原體凋亡率；本發(fā)明的豬肺炎支原體培養(yǎng)基，可以提高豬肺炎支原體培養(yǎng)菌數(shù)，培養(yǎng)菌液濃度達(dá)1010-11/ml，比普通培養(yǎng)基提高5-10倍以上；本發(fā)明的豬肺炎支原體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)豬肺炎支原體時(shí)可以同時(shí)抑制其他細(xì)菌生長，降低培養(yǎng)豬肺炎支原體培養(yǎng)的污染風(fēng)險(xiǎn)。
【專利說明】一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于獸用生物制品【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬支原體肺炎是豬場一種極為常見的呼吸道疾病，在全世界范圍內(nèi)流行，俗稱豬氣喘病，由豬肺炎支原體(Mhp)所導(dǎo)致，該病原在豬體內(nèi)主要寄居在氣管、支氣管和細(xì)支氣管的纖毛上，嚴(yán)重破壞豬呼吸道的物理防衛(wèi)機(jī)制-防御粘膜，增加了豬群對其它呼吸性病原體的易感性，如豬流感病毒，豬繁殖和呼吸道綜合征病毒，II型豬圓環(huán)病毒，支氣管敗血波氏桿菌，胸膜肺炎放線桿菌和副豬嗜血桿菌等，所以常常造成多種病原的復(fù)合感染，引發(fā)豬呼吸道綜合征(PRDC)或者其他疾病，肺炎支原體可降低豬生長率12.7%和降低飼料報(bào)酬13.8%，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。
[0003]豬肺炎支原體為兼性厭氧菌，生長需求極為苛刻，分離相當(dāng)困難，它對營養(yǎng)要求比一般的支原體高。豬肺炎支原體雖然能夠利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)合成自身生長繁殖所需的物質(zhì)，但由于其基因組的分子量較小，攜帶的信息量不多，生物合成能力有限，因此需要從體外攝取膽固醇、氨基酸、脂肪酸、核酸前體及維生素等物質(zhì)，這就促使支原體的培養(yǎng)基成分比較復(fù)雜，必須添加一些特殊營養(yǎng)物質(zhì)。
[0004]由于豬肺炎支原體對營養(yǎng)要求比一般支原體高，培養(yǎng)基成分比較復(fù)雜，培養(yǎng)時(shí)間長，培養(yǎng)物濃度較低，大大地影響了人們對其進(jìn)一步地研究，同時(shí)也阻礙了豬肺炎支原體疫苗開發(fā)與生產(chǎn)。目前不少學(xué)者 設(shè)計(jì)了多種培養(yǎng)基來供其生長，盡管它們各具特色，但總的說來都沒有解決培養(yǎng)困難的問題。所以在豬肺炎支原體的培養(yǎng)上還要做進(jìn)一步研究。
[0005]多糖是中藥活性成分之一，大量研究表明，多糖及糖復(fù)合物在生物體內(nèi)不僅是作為能量資源和構(gòu)成材料，更重要的是它存在于一切細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中，參與生命現(xiàn)象中細(xì)胞的各種活動(dòng)。多糖類物質(zhì)是所有生命有機(jī)體的重要組成部分，具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質(zhì)過氧化的能力。此外，中藥多糖對低等生物具有特殊的保護(hù)作用。中藥多糖富含羥基，可以和低等活性生物活體結(jié)合，構(gòu)建多維網(wǎng)絡(luò)空間氫鍵結(jié)構(gòu)，在活性生物活體表面形成保護(hù)膜，實(shí)現(xiàn)對活性生物的保護(hù)作用。
[0006]本發(fā)明基于上述技術(shù)背景，提出一種支原體培養(yǎng)基，具體是一種特別適用于豬肺炎支原體的培養(yǎng)基，提高了豬肺炎支原體菌液濃度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基及其制備方法的技術(shù)方案，通過該培養(yǎng)基培養(yǎng)豬肺炎支原體，可提高豬肺炎支原體菌液濃度，提高豬肺炎支原體抗原產(chǎn)量。
[0008]所述的一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基，其特征在于每1000ml磷酸緩沖液中含有以下重量配比的組分:PPLO20 ~50g
酵母粉2~IOg
葡萄糖3~15g
1%酚紅0.5~4ml
氨基酸組合 2~IOg 復(fù)方中藥多糖 15~30g 豬血清50~100ml ；
所述的氨基酸組合中含有L-精氨酸、甘氨酸、酪氨酸、L-半胱氨酸和絲氨酸；
所述的復(fù)方中藥多糖從以下中藥組合物中提取得到:黃連、銀杏葉、懷牛膝、黨參、茯苓、枸杞、甘草和丹參。
[0009]所述的一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基，其特征在于每1000ml磷酸緩沖液中含有以下重量配比的組分:
PPLO30 ~40g
酵母粉4~8g
葡萄糖5~IOg
1%酚紅I~3ml
氨基酸組合 4~Sg 復(fù)方中藥多糖 20~25g 豬血清60~80ml。
[0010]所述的一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基，其特征在于所述的氨基酸組合含有L-精氨酸10~30%、甘氨酸5~15%、酪氨酸10~30%、L-半胱氨酸20~40%和絲氨酸10~30%。
[0011]所述的一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基，其特征在于所述的復(fù)方中藥多糖從以下中藥組合物中提取得到:黃連5~15份、銀杏葉10~30份、懷牛膝10~20份、黨參10~30份、獲茶5~50份、構(gòu)祀10~30份、甘草10~20份和丹參5~15份。
[0012]所述的一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基，其特征在于所述的復(fù)方中藥多糖通過以下步驟制得:
a、稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時(shí)，熬制過程中每10分鐘攪拌一次；
b、棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上
清；
C、將b中上清進(jìn)行醇沉，沉淀即為粗制中藥多糖；
d、用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進(jìn)行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清；
e、將d中上清經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌后，進(jìn)行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液；
f、將e中中藥多糖濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥即得到復(fù)方中藥多糖。
[0013]所述的一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于包括以下工藝步驟:
O配制磷酸緩沖溶液；
2)從黃連5~15份、銀杏葉10~30份、懷牛膝10~20份、黨參10~30份、茯苓5~50份、枸杞10~30份、甘草10~20份和丹參5~15份中提取得到復(fù)方中藥多糖；
3)稱取PPLO 20~50g、酵母粉2~10g、葡萄糖3~15g、氨基酸組合2~10g、復(fù)方中藥多糖15~30g，溶解于步驟I)制得的1000mL磷酸緩沖溶液中，加入1%酚紅0.5~4ml充分混勻，用酸或堿調(diào)節(jié)pH至7.4~7.8之間，無菌條件下通過0.22 μ m濾膜，過濾除菌后置4°C保存?zhèn)溆?，使用前添加健康豬血清50~100ml，得到豬肺炎支原體培養(yǎng)基。
[0014]所述的一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于所述的步驟2)中復(fù)方中藥多糖通過以下步驟制得:
a、稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時(shí)，熬制過程中每10分鐘攪拌一次；
b、棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上
清；
C、將b中上清進(jìn)行醇沉，沉淀即為粗制中藥多糖；
d、用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進(jìn)行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清；
e、將d中上清經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌后，進(jìn)行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液；
f、將e中中藥多糖濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥即得到復(fù)方中藥多糖。
[0015]所述的一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于所述的步驟3)中所述的氨基酸組合含有L-精氨酸10~30%、甘氨酸5~15%、酪氨酸10~30%、L_半胱氨酸20~40%和絲氨酸10~30%。
[0016]所述的一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于所述的步驟3)中稱取PPLO 30~40g、酵母粉7~8g、葡萄糖5~10g、氨基酸組合4~8g、復(fù)方中藥多糖20~25g，溶解于步驟I)制得的1000mL磷酸緩沖溶液中，加入1%酚紅I~3ml充分混勻，用酸或堿調(diào)節(jié)pH至7.4~7.8之間，無菌條件下通過0.22 μ m濾膜，過濾除菌后置4°C保存?zhèn)溆茫褂们疤砑咏】地i血清60~80ml。
[0017]本發(fā)明中PPLO為PPLO培養(yǎng)基由森貝伽(南京)生物科技有限公司購得。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
(I)本發(fā)明所制備的豬肺炎支原體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)豬肺炎支原體時(shí)可以提高豬肺炎支原體耐受力，降低豬肺炎支原體凋亡率。
[0019](2)本發(fā)明所制備的豬肺炎支原體培養(yǎng)基，可以提高豬肺炎支原體培養(yǎng)菌數(shù)，培養(yǎng)菌液濃度達(dá)IOich11AiI (ccu計(jì)數(shù)法)，比普通培養(yǎng)基提高5_10倍以上。
[0020](3)本發(fā)明所制備的豬肺炎支原體培養(yǎng)基，在培養(yǎng)豬肺炎支原體時(shí)可以同時(shí)抑制其他細(xì)菌生長，降低培養(yǎng)豬肺炎支原體培養(yǎng)的污染風(fēng)險(xiǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0021]為了使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0022]實(shí)施例1
一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基每1000ml磷酸緩沖液中含有以下重量配比的組分:
PPLO20g
酵母粉6g
葡萄糖8g
1%酌.紅4ml
氨基酸組合 4g 復(fù)方中藥多糖 15g 豬血清50ml
一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基的制備方法，其步驟是:
(I)磷酸緩沖溶液的配制:準(zhǔn)確稱取氯化鈉Sg，氯化鉀0.2g，磷酸氫二鈉1.15g，磷酸二氫鉀0.2g，氯化鈣0.1g,含6個(gè)結(jié)晶水的氯化鎂0.1g溶于1000ml雙蒸水中，無菌條件下通過0.22 μ m濾膜,過濾除菌備用。
[0023](2)復(fù)方中藥多糖的制備
按黃連15份、銀杏葉30份、懷牛膝10份、黨參10份、茯苓20份、枸杞10份、甘草10份和丹參15份稱取各中藥原 料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時(shí)，熬制過程中每10分鐘攪拌一次；
b、棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上
清；
C、將b中上清進(jìn)行醇沉，沉淀即為粗制中藥多糖；
d、用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進(jìn)行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清；
e、將d中上清經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌后，進(jìn)行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液；
f、將e中中藥多糖濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥即得到復(fù)方中藥多糖。
[0024](3)豬肺炎支原體培養(yǎng)基的配制:按比例稱取PPLO 20g、酵母粉6g、葡萄糖8g、l%酚紅4ml、氨基酸組合4g (L-精氨酸0.Sg、甘氨酸0.4g、酪氨酸1.0g、L_半胱氨酸1.2g和絲氨酸0.6g)、復(fù)方中藥多糖15g，溶解于步驟(1)制得的磷酸緩沖溶液中，加入1%酚紅4mL充分混勻，用酸或堿調(diào)節(jié)pH至7.4~7.8之間，無菌條件下通過0.22 μ m濾膜，過濾除菌后置4°C保存?zhèn)溆?，使用前添加健康豬血清50ml。
[0025]實(shí)施例2
一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基每1000ml磷酸緩沖液中含有以下重量配比的組
分:
PPLO35g
酵母粉2g
葡萄糖15g
1% 酚紅0.5ml
氨基酸組合 IOg 復(fù)方中藥多糖 30g 豬血清80ml。[0026]一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基的制備方法，其步驟同實(shí)施例1。其中復(fù)方中藥多糖從黃連10份、銀杏葉20份、懷牛膝15份、黨參20份、茯苓50份、枸杞20份、甘草15份和丹參5份中提取得到。
[0027]實(shí)施例3
一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基每1000ml磷酸緩沖液中含有以下重量配比的組分:
PPLO50g
酵母粉IOg
葡萄糖3g
1% 酚紅2.5ml
氨基酸組合 2g 復(fù)方中藥多糖 25g 豬血清100ml。
[0028]一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基的制備方法，其步驟同實(shí)施例1。其中復(fù)方中藥多糖從黃連5份、銀杏葉10份、懷牛膝20份、黨參30份、茯苓5份、枸杞30份、甘草20份和丹參10份中提取得到。
[0029]比較例I本發(fā)明所制備的培養(yǎng)基與常用培養(yǎng)基比較試驗(yàn)
IMhp菌株和培養(yǎng)條件
將購自ATCC的豬肺炎支原體J株分別接種實(shí)施例1的豬肺炎支原體培養(yǎng)基和現(xiàn)有技術(shù)的2種豬肺炎支原體培養(yǎng)基，按5% (V/V)的比例接種豬肺炎支原體于各培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基顏色變黃，PH降至6.4-6.8時(shí)，無菌取出培養(yǎng)物。
[0030]2活菌計(jì)數(shù)(CCU法)
每個(gè)菌株培養(yǎng)物取14只無菌試管，每管裝4.5ml含豬肺炎支原體培養(yǎng)基，在第I管加入0.5ml生長良好的培養(yǎng)物，混合均勻后，吸取0.5ml加入第2只管，如此進(jìn)行10倍系列稀釋至最后一管，同時(shí)設(shè)未加菌液的豬肺炎支原體培養(yǎng)基作為陰性對照。試驗(yàn)管作三個(gè)重復(fù)。系列稀釋后將試管放置37°C恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，每日觀察一次，主要觀察培養(yǎng)基的顏色變化和渾濁度，連續(xù)觀察時(shí)間為14日，最后發(fā)生顏色變化的小管稀釋度即為該培養(yǎng)物的CCU滴度。
[0031]3 結(jié)果
3.1豬肺炎支原體Z株接種3種培養(yǎng)基3次生長實(shí)驗(yàn)CCU測定結(jié)果見表1。
[0032]表1豬肺炎支原體Z株接種3種培養(yǎng)基3次生長實(shí)驗(yàn)CXU測定結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基，其特征在于每1000ml磷酸緩沖液中含有以下重量配比的組分: PPLO20 ~50g 酵母粉2~IOg 葡萄糖3~15g 1%酚紅0.5~4ml 氨基酸組合 2~IOg 復(fù)方中藥多糖 15~30g 豬血清50~100ml ； 所述的氨基酸組合中含有L-精氨酸、甘氨酸、酪氨酸、L-半胱氨酸和絲氨酸； 所述的復(fù)方中藥多糖從以下中藥組合物中提取得到:黃連、銀杏葉、懷牛膝、黨參、茯苓、枸杞、甘草和丹參。
2.如權(quán)利要求1所述的一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基，其特征在于每1000ml磷酸緩沖液中含有以下重量配比的組分: PPLO30 ~40g`` 酵母粉4~8g 葡萄糖5~IOg 1%酚紅I~3ml 氨基酸組合 4~Sg 復(fù)方中藥多糖 20~25g 豬血清60~80ml。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基，其特征在于所述的氨基酸組合含有L-精氨酸10~30%、甘氨酸5~15%、酪氨酸10~30%、L_半胱氨酸20~40%和絲氨酸10~30%。
4.如權(quán)利要求1或2所述的一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基，其特征在于所述的復(fù)方中藥多糖從以下中藥組合物中提取得到:黃連5~15份、銀杏葉10~30份、懷牛膝10~20份、黨參10~30份、獲茶5~50份、構(gòu)祀10~30份、甘草10~20份和丹參5~15份。
5.如權(quán)利要求1所述的一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基，其特征在于所述的復(fù)方中藥多糖通過以下步驟制得: a、稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時(shí)，熬制過程中每10分鐘攪拌一次； b、棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清； C、將b中上清進(jìn)行醇沉，沉淀即為粗制中藥多糖； d、用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進(jìn)行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清； e、將d中上清經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌后，進(jìn)行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液； f、將e中中藥多糖濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥即得到復(fù)方中藥多糖。
6.一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于包括以下工藝步驟: O配制磷酸緩沖溶液； 2)從黃連5~15份、銀杏葉10~30份、懷牛膝10~20份、黨參10~30份、茯苓5~.50份、枸杞10~30份、甘草10~20份和丹參5~15份中提取得到復(fù)方中藥多糖； 3)稱取PPLO20~50g、酵母粉2~10g、葡萄糖3~15g、氨基酸組合2~10g、復(fù)方中藥多糖15~30g，溶解于步驟I)制得的1000mL磷酸緩沖溶液中，加入1%酚紅0.5~4ml充分混勻，用酸或堿調(diào)節(jié)pH至7.4~7.8之間，無菌條件下通過0.22 μ m濾膜，過濾除菌后置4°C保存?zhèn)溆茫褂们疤砑咏】地i血清50~100ml，得到豬肺炎支原體培養(yǎng)基。
7.如權(quán)利要求6所述的一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于所述的步驟.2)中復(fù)方中藥多糖通過以下步驟制得: a、稱取各中藥原料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬制2小時(shí)，熬制過程中每10分鐘攪拌一次； b、棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清； C、將b中上清進(jìn)行醇沉，沉淀即為粗制中藥多糖； d、用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進(jìn)行溶解，溶解后，按0.5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經(jīng)1000Orpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清； e、將d中上清經(jīng)0.22um濾膜過濾除菌后，進(jìn)行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液； f、將e中中藥多糖濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥即得到復(fù)方中藥多糖。
8.如權(quán)利要求6所述的一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于所述的步驟.3)中所述的氨基酸組合含有L-精氨酸10~30%、甘氨酸5~15%、酪氨酸10~30%、L_半胱氨酸20~40%和絲氨酸10~30%。
9.如權(quán)利要求6所述的一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于所述的步驟.3)中稱取PPLO 30~40g、酵母粉7~8g、葡萄糖5~10g、氨基酸組合4~8g、復(fù)方中藥多糖20~25g，溶解于步驟I)制得的1000mL磷酸緩沖溶液中，加入1%酚紅I~3ml充分混勻，用酸或堿調(diào)節(jié)pH至7.4~7.8之間，無菌條件下通過0.22 μ m濾膜，過濾除菌后置4°C保存?zhèn)溆?，使用前添加健康豬血清60~80ml。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK103555641SQ201310579845
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月19日
【發(fā)明者】張秀文, 李陽, 閆艷麗, 劉雪, 王二先, 盛璐絲 申請人:浙江美保龍生物技術(shù)有限公司