預防豬鼻支原體感染細胞的方法及制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種新的預防豬鼻支原體感染細胞的方法及制劑。具體地，本發(fā)明提供了針對豬鼻支原體膜蛋白P37或宿主細胞膜蛋白Annexin?A2的拮抗劑在制備預防豬鼻支原體感染細胞或促細胞遷移的制劑中的應用。本發(fā)明主要是發(fā)現(xiàn)了豬鼻支原體通過其表面的膜蛋白P37的氨基端22個氨基酸片段與細胞膜蛋白Annexin?A2氨基端25個氨基酸片段相互作用感染細胞，從而可以利用抗P37蛋白抗體、或豬鼻支原體P37的氨基端多肽、或Annexin?A2氨基端多肽或抗宿主細胞膜蛋白Annexin?A2的抗體預防豬鼻支原體感染細胞。
【專利說明】預防豬鼻支原體感染細胞的方法及制劑

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及預防豬鼻支原體感染細胞的方法及制劑，具體地涉及針對豬鼻支原體 通過其表面的膜蛋白P37的氨基端22個氨基酸片段與細胞膜蛋白Annexin A2相互作用感 染細胞這一發(fā)現(xiàn)、而提供的針對豬鼻支原體膜蛋白P37或宿主細胞膜蛋白Annexin A2的拮 抗劑在制備預防豬鼻支原體感染細胞或促細胞遷移的制劑中的應用，以及預防豬鼻支原體 感染細胞或促細胞遷移的方法。

【背景技術】
[0002] 支原體屬于原核生物中的柔膜體綱，是自然界存在的、能獨立復制的最小 微生物，其大小約為〇. lm，能透過微孔濾膜，存在于宿主細胞的膜表面或內吞到胞內 (Lo SC. Mycoplasmas and AIDS. In:Maniloff J, McElheney, RN, Finch LR, Baseman JB, editors. Mycoplasmas:molecular biology and pathogenesis. Washington, DC:Am Soc Microbiol Press ;1992. p.525-45)。值得注意的是，越來越多的實驗數(shù)據(jù)提示支原體的持 續(xù)性慢性感染與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有一定的相關性（Namiki K，Goodison S，Porvasnik S，et al. (2009)Persistent Exposure to Mycoplasma Induces Malignant Transformation of Human Prostate Cells. PLoS ONE 4,e6872 ;Urbanek C, Goodison S，Chang M，et al. (2011) Detection of antibodies directed at M. hyorhinis p37 in the serum of men with newly diagnosed prostate cancer. BMC Cancer 11, 233 ；Yang H，Qu LK，Ma HC，et al. (2010)Mycoplasma hyorhinis infection in gastric carcinoma and its effects on the malignant phenotypes of gastric cancer cells. BMC Gastroenterol 10, 132)。早在1965年，Paton等報道口腔支原體可引起人類二倍體細胞株WI38的染色體異 常，并誘導其發(fā)生細胞轉化（Paton GR，Jacobs JP，Perkins FT. (1965) Chromosome changes in human Diploid-cell cultures infected with mycoplasmas. Nature 207,43-45)〇 1986年，H. Kotani等發(fā)現(xiàn)非凡螺原體可使鼠 NIH3T3細胞及猴腎CV21細胞發(fā)生惡性轉化 (Kotani H, Phillips D,McGarrity GJ. Malignant transformation of NIH-3T3 and CV-1 cells by a helical mycoplasma, Spiroplasma mirum，strain SMCA. (1986)In Vitro Cell Dev Biol 22,756-762)。引起研究者更多興趣的是Tsai等的研究工作，他們用發(fā) 酵支原體及穿透支原體感染小鼠胚胎細胞系C3H10T1/2,在感染11周后細胞出現(xiàn)惡性改 變，在感染18周之后細胞可在軟瓊脂上形成集落，在裸鼠體內成瘤（Tsai S，Wear DJ，Shih JW, et al. Mycoplasmas and oncogenesis:persistent infection and multistage malignant transformation. (1995)Proc Natl Acad Sci USA 92, 10197-10201)。 2009 年 Namiki等人研究發(fā)現(xiàn)生殖支原體或豬鼻支原體的持續(xù)感染可以增加前列腺增生上皮細胞 BPH-1的迀移和侵襲能力，引起細胞核型異常，并可在裸鼠體內成瘤（Namiki K，Goodison S,Porvasnik S，et al. (2009)Persistent Exposure to Mycoplasma Induces Malignant Transformation of Human Prostate Cells. PLoS ONE 4, e6872)。這些研究均說明支原體 感染與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關系。
[0003] 發(fā)明人所在的實驗室在上世紀八十年代通過采用腫瘤細胞免疫，制備獲得了鼠源 性的抗腫瘤單克隆抗體PD4 (Dong ZW, Wan WH, Li ZF，et al. A monoclonal antibodies PD4 against gastric cancer cell line MGC803. (1985)Shengwu Huaxue Zazhi 2,52-58), 但后續(xù)的抗原鑒定工作卻發(fā)現(xiàn)單抗PD4對應的抗原并非來自于腫瘤細胞，而是來自于 豬鼻支原體，提示豬鼻支原體可能和腫瘤相關。2001年，發(fā)明人所在的實驗室黃甦等人 采用TO4,通過免疫組織化學染色的方法對包括胃癌及腸癌組織在內的600例組織樣本 進行檢測，結果顯示該抗體與胃癌組織的陽性反應率為56%，而相應的非腫瘤組織陽性 率分別為：慢性淺表型胃炎：28%，胃良性潰瘍：30%，腸上皮：37% (Huang S，Li JY，· J, et al. Mycoplasma infections in different human carcinomas. (2001)World J Gastroenterol 7,266-269)。由此可見，胃癌與胃良性疾患的豬鼻支原體感染率有顯著的 差異，胃癌組明顯高于胃良性疾病各組，并且，隨著疾病的加重，豬鼻支原體的感染率也隨 之增加。這些結果提示豬鼻支原體的感染可能和疾病以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在一定相關 性。此外，來自第四軍醫(yī)大學的曹軍等人亦利用同樣的方法檢測了 95例腎癌組織中的豬 鼻支原體感染情況，發(fā)現(xiàn)64. 2%的組織中存在豬鼻支原體感染，而對豬鼻支原體膜表面蛋 白P40蛋白在不同病理類型腎癌組織中的表達分析結果表明，豬鼻支原體感染與人類腎癌 的病理類型不存在某種相關性（曹軍，李建平，程偉，等.豬鼻支原體P40蛋白在腎癌組 織中的表達及意義.（2008)西安交通大學學報（醫(yī)學版）29,556-558)。2010年，楊華等 人用PD4對61例胃癌組織樣本和109例卵巢癌組織標本進行了免疫組織化學染色分析， 結果發(fā)現(xiàn)，61例胃癌標本中豬鼻支原體感染率為45. 9%，豬鼻支原體感染與胃癌的淋巴結 轉移、Lauren 分型和 TNM 分期呈正相關（Yang H，Qu LK，Ma HC，et al· (2010)Mycoplasma hyorhinis infection in gastric carcinoma and its effects on the malignant phenotypes of gastric cancer cells. BMC Gastroenterol 10,132) ;109 例卵巢癌標本 中豬鼻支原體感染率為43. 1% (47/109)。
[0004] 既然腫瘤組織中有較高的豬鼻支原體感染率，那么，豬鼻支原體感染與腫瘤發(fā) 生發(fā)展之間的關系如何？ 2009年，Namiki等報道了豬鼻支原體慢性感染可以誘導前列 腺良性增生細胞BPH發(fā)生染色體核型異常，最終導致其惡性轉化（Namiki K，G〇〇dis〇n S,Porvasnik S, et al. (2009)Persistent Exposure to Mycoplasma Induces Malignant Transformation of Human Prostate Cells. PLoS ONE 4, e6872)。豬鼻支原體可以增 強腫瘤細胞系的侵潤并抑制細胞的接觸抑制（Elkind E，Rechnitzer H，Vaisid T，et al. Mycoplasma hyorhinis upregulates calpastatin and inhibits calpain-dependent proteolysis in SH-SY5Y neuroblastoma cells. (2010)FEMS Microbiol Lett 304, 62-68)。發(fā)明人所在實驗室的研究發(fā)現(xiàn)，豬鼻支原體感染的胃癌細胞MGC803在軟瓊 脂中形成集落的能力遠遠大于無支原體感染的細胞（Yang H，Qu LK，Ma HC，et al. (2010) Mycoplasma hyorhinis infection in gastric carcinoma and its effects on the malignant phenotypes of gastric cancer cells. BMC Gastroenterol 10,132)。此夕卜， 多項研究顯示豬鼻支原體可以增強腫瘤細胞的體外遷移和侵襲能力。
[0005] 以上臨床標本的檢測及實驗室的相關研究結果均提示，豬鼻支原體感染和腫瘤的 發(fā)生發(fā)展有密切的關系。但對豬鼻支原體感染細胞的分子機制尚不明確，故缺乏特異性預 防豬鼻支原體感染細胞的方法。


【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的一個目的在于對豬鼻支原體感染細胞的分子機制進行研究，提供一種特 異性預防豬鼻支原體感染細胞的方法。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種預防豬鼻支原體感染細胞或促細胞遷移的制劑。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供針對豬鼻支原體膜蛋白P37或宿主細胞膜蛋白 Annexin A2的拮抗劑在制備預防豬鼻支原體感染細胞或促細胞遷移的制劑中的應用。
[0009] 本案發(fā)明人通過對豬鼻支原體感染細胞的分子機制研究，發(fā)現(xiàn)豬鼻支原體感染哺 乳動物細胞依賴于其表面膜蛋白P37,具體而言是豬鼻支原體通過其表面的膜蛋白P37的 氨基端多肽（更具體而言是膜蛋白P37的氨基端第2-23位氨基酸序列）與細胞膜蛋白 Annexin A2(更具體而言是其氨基端多肽，例如第2-26位氨基酸序列）的相互作用感染細 胞。
[0010] 在此研究結果的基礎上，本發(fā)明提供了一種預防抗豬鼻支原體感染細胞的方法， 其包括采用針對豬鼻支原體膜蛋白P37的拮抗劑抑制豬鼻支原體與細胞結合。由于拮抗劑 (例如蛋白、核酸、碳水化合物）可以與膜蛋白P37結合并抑制或封閉膜蛋白P37的生物活 性，從而可以用于防止豬鼻支原體與細胞結合而感染細胞。例如，可以用抗豬鼻支原體P37 蛋白的抗體，它與豬鼻支原體P37蛋白的結合可通過封閉作用抑制豬鼻支原體感染細胞。 在本發(fā)明的一具體實施方案中，發(fā)明人通過實驗證實，抗P37抗體不僅可以阻斷豬鼻支原 體感染細胞，也可以阻斷豬鼻支原體所引起的細胞遷移能力增強。
[0011] 基于上述研究結果，本發(fā)明還提供了另外一種預防豬鼻支原體感染細胞的方法， 其包括采用針對宿主細胞膜蛋白Annexin A2的拮抗劑抑制豬鼻支原體與細胞結合。類似 的，由于拮抗劑（例如蛋白、核酸、碳水化合物）可以與蛋白Annexin A2結合并抑制或封閉 蛋白Annexin A2的生物活性，從而可以用于防止豬鼻支原體與細胞結合而感染細胞。
[0012] 例如，可以用抗Annexin A2的抗體封閉宿主細胞上與可與豬鼻支原體結合的分子 Annexin A2,使豬鼻支原體的P37蛋白不能與其結合，進而可以抑制豬鼻支原體感染細胞。 在本發(fā)明的一具體實施方案中，發(fā)明人通過實驗證實，抗Annexin A2抗體處理細胞后豬鼻 支原體與細胞的結合顯著減少，可以明顯阻斷豬鼻支原體感染細胞。
[0013] 再如，可以采用小分子RNA干擾Annexin A2的表達，使細胞不表達或減少Annexin A2的表達，進而可以抑制豬鼻支原體感染細胞。在本發(fā)明的一具體實施方案中，發(fā)明人通過 實驗證實，用小分子RNA干擾Annexin A2表達后豬鼻支原體感染細胞及促進細胞遷移的能 力明顯下降。
[0014] 又如，還可以采用P37的氨基端多肽，例如，包含P37蛋白氨基端22個氨基酸片段 LKKLKNFILFSSIFSPIAFAIS(SEQ ID No. 1，P37蛋白氨基端第2-23位氨基酸序列）的多肽，使 其通過與宿主細胞膜蛋白Annexin A2的結合，從而競爭性抑制豬鼻支原體與細胞的結合， 進而預防豬鼻支原體感染細胞。在本發(fā)明的一具體實施方案中，發(fā)明人通過實驗證實，原核 重組表達的氨基端多肽融合蛋白（GST-p37-2-23)可以和胃癌細胞系結合；把氨基端多肽 直接標記熒光素 FITC(FITC-p37-2-23)后得到的FITC-p37-2-23也可以直接和細胞結合； 此外，合成的P37-2-23多肽也可呈濃度梯度依賴性地阻斷豬鼻支原體和胃癌細胞AGS的結 合。
[0015] 此外，還可以采用Annexin A2的氨基端多肽，例如，包含Annexin A2蛋白氨基端 25 個氨基酸片段 STVHEILCKLSLE⑶HSTPPSAYGS(SEQ ID No. 2，Annexin A2 蛋白氨基端第 2-26位氨基酸序列）的多肽，使其通過與豬皮支原體膜蛋白P37的結合，從而競爭性抑制豬 鼻支原體與宿主細胞的結合，進而預防豬鼻支原體感染細胞。在本發(fā)明的一具體實施方案 中，發(fā)明人通過定量PCR實驗驗證了 Annexin A2氨基端2至25位氨基酸的多肽可通過競 爭性結合阻斷豬鼻支原體同細胞Annexin A2的結合，可以有效阻斷支原體的感染。
[0016] 本發(fā)明中，所述的"針對豬鼻支原體膜蛋白P37的拮抗劑"是指與P37結合并抑制 或封閉P37的生物活性的物質，可以是蛋白、核酸或碳水化合物等。其中所述的"生物活性" 是指P37與宿主細胞結合的生物活性，特別是指與宿主細胞膜蛋白Annexin A2結合的生物 活性。
[0017] 本發(fā)明中，所述的"針對宿主細胞膜蛋白Annexin A2的拮抗劑"是指與Annexin A2結合并抑制或封閉Annexin A2的生物活性的物質，可以是蛋白、核酸或碳水化合物等。 其中所述的"生物活性"是指Annexin A2與豬鼻支原體結合的生物活性，特別是指與豬鼻 支原體膜蛋白P37結合的生物活性。
[0018] 本發(fā)明中，所述"結合"是指豬鼻支原體與細胞的相互作用并在此基礎上感染細 胞。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)豬鼻支原體能夠通過其表面的膜蛋白P37,具體地說是通過P37蛋白氨基 端的第2至23位氨基酸的多肽片段，與細胞膜蛋白Annexin A2的結合，具體地說是通過與 Annexin A2蛋白氨基端的第2至26位氨基酸多肽片段的結合，進而實現(xiàn)豬鼻支原體與細 胞的結合并感染細胞。根據(jù)這一發(fā)現(xiàn)，不管是采用P37或Annexin A2的單抗或多抗封閉相 應的抗原，還是采用P37或Annexin A2氨基端的多肽以競爭抑制P37蛋白與Annexin A2 的結合，還是通過敲除細胞Annexin A2的表達，凡是能夠阻斷P37蛋白與Annexin A2的結 合，都可以實現(xiàn)預防豬鼻支原體感染細胞并促進細胞遷移的目的。
[0019] 從而，本發(fā)明還提供了針對豬鼻支原體膜蛋白P37或宿主細胞膜蛋白Annexin A2 的拮抗劑在制備預防豬鼻支原體感染細胞或促細胞遷移的制劑中的應用。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明中，針對豬鼻支原體膜蛋白P37的拮抗劑為 與豬鼻支原體膜蛋白P37結合、從而抑制豬鼻支原體與細胞結合的試劑。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明中，針對豬鼻支原體膜蛋白P37的拮抗劑為 與豬鼻支原體膜蛋白P37氨基端第2-23位氨基酸結合、從而抑制豬鼻支原體與細胞結合的 試劑。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明中，針對豬鼻支原體膜蛋白P37的拮抗劑為 抗豬鼻支原體膜蛋白P37或其抗原性片段的特異性單克隆抗體或多克隆抗體。這里所述的 "特異性"是指抗體能結合于本發(fā)明的P37或其片段，優(yōu)選那些能與本發(fā)明的P37結合但不 識別且不與其它非相關抗原分子結合的抗體。本領域普通技術人員已知，所述的單克隆抗 體或多克隆抗體可以參照現(xiàn)有技術通過P37的全長或其抗原性的片段作為抗原進行免疫 獲得。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的另一具體實施方案，針對豬鼻支原體膜蛋白P37的拮抗劑為包含宿 主細胞膜蛋白Annexin A2氨基端氨基酸序列（例如Annexin A2氨基端第2-26位氨基酸 序列）的多肽或蛋白。其中，包含Annexin A2蛋白氨基端第2-26位氨基酸序列的多肽或 蛋白，例如可以是SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列組成的多肽，也可以是在SEQ ID No. 2所 示的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且與SEQ ID No. 2所示的氨基 酸序列組成的多肽具有相同功能（這里是指與豬鼻支原體膜蛋白P37結合的功能）的衍生 多肽或蛋白。所述多肽或蛋白可不帶有或帶有重組標簽或熒光素等標記物。本領域普通技 術人員已知，這樣的多肽或蛋白可以參照現(xiàn)有技術通過原核重組表達融合蛋白來制備，或 者通過化學方法合成來制備。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明中，針對宿主細胞膜蛋白Annexin A2的拮抗 劑為與Annexin A2結合、從而抑制豬鼻支原體與細胞結合的試劑。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明中，針對宿主細胞膜蛋白Annexin A2的拮抗 劑為與Annexin A2氨基端第2-26位氨基酸結合、從而抑制豬鼻支原體與細胞結合的試劑。
[0026] 在本發(fā)明的一具體實施方案中，針對宿主細胞膜蛋白Annexin A2的拮抗劑為針對 Annexin A2或其抗原性片段的特異性單克隆抗體或多克隆抗體。這里所述的"特異性"是 指抗體能結合于本發(fā)明的Annexin A2或其片段，優(yōu)選那些能與本發(fā)明的Annexin A2結合 但不識別且不與其它非相關抗原分子結合的抗體。本領域普通技術人員已知，所述的單克 隆抗體或多克隆抗體可以參照現(xiàn)有技術通過Annexin A2的全長或其抗原性的片段作為抗 原進行免疫獲得。
[0027] 在本發(fā)明的另一具體實施方案中，針對宿主細胞膜蛋白Annexin A2的拮抗劑為干 擾Annexin A2表達的小分子干擾RNA。優(yōu)選地，所述小分子干擾RNA具有SEQ ID No. 3所 示核苷酸序列。所述小分子干擾RNA可以通過諸如化學合成等現(xiàn)有技術方法來制備。
[0028] 在本發(fā)明的另一具體實施方案中，針對宿主細胞膜蛋白Annexin A2的拮抗劑為包 含豬鼻支原體膜蛋白P37氨基端氨基酸序列（例如P37氨基端第2-23位氨基酸序列）的 多肽或蛋白。其中，包含P37蛋白氨基端第2-23位氨基酸序列的多肽或蛋白，例如可以是 SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的多肽，也可以是在SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列中 經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且與SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列組成的多肽 具有相同功能（這里是指與宿主細胞膜蛋白Annexin A2結合的功能）的衍生多肽或蛋白。 所述多肽或蛋白可不帶有或帶有重組標簽或熒光素等標記物。本領域普通技術人員已知， 這樣的多肽或蛋白可以參照現(xiàn)有技術通過原核重組表達融合蛋白來制備，或者通過化學方 法合成來制備。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，本發(fā)明中，抑制豬鼻支原體感染細胞、抑制豬鼻支 原體促進細胞遷移中所說的細胞，可以為胃癌細胞MGC803、胃癌細胞AGS、人腎上皮細 胞293T、人胃粘膜永生化上皮細胞GES-1、非洲綠猴腎細胞C0S-7或人臍靜脈內皮細胞 (HUVEC)等。
[0030] 此外，本發(fā)明還提供了一種預防豬鼻支原體感染細胞或促細胞遷移的制劑，其包 含針對豬鼻支原體膜蛋白P37或宿主細胞膜蛋白Annexin A2的拮抗劑。所述的針對豬鼻 支原體膜蛋白P37的拮抗劑或針對宿主細胞膜蛋白Annexin A2的拮抗劑如前所述。
[0031] 綜上所述，本發(fā)明針對豬鼻支原體通過其表面的膜蛋白P37的氨基端與細胞膜蛋 白Annexin A2氨基端相互作用感染細胞這一發(fā)現(xiàn)，提供了新的預防豬鼻支原體感染細胞或 促細胞遷移的方法及相關制劑，可以從阻止或抑制P37與Annexin A2結合的角度預防豬鼻 支原體感染細胞。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 圖1A :顯示豬鼻支原體感染胃癌細胞MGC803和AGS且呈時間一濃度梯度依賴性 的細胞ELISA實驗結果。
[0033] 圖1B :顯示GST-p37與胃癌細胞MGC803和AGS結合呈時間一濃度梯度依賴性的 ELISA實驗結果。
[0034] 圖1C :顯示抗p37抗體能阻斷豬鼻支原體感染293T、GES-1、C0S-7和HUVEC等非 腫瘤細胞的PCR檢測結果。
[0035] 圖1D :顯示抗p37抗體阻斷豬鼻支原體和胃癌細胞結合的ELISA實驗結果。
[0036] 圖1E :顯示抗p37抗體阻斷豬鼻支原體和胃癌細胞結合的免疫熒光染色結果。
[0037] 圖1F :顯示抗p37抗體可以阻斷豬鼻支原體的促胃癌細胞遷移作用的Transwell 實驗結果。
[0038] 圖2A :顯示支原體p37氨基端多肽融合蛋白GST-p37-2-23能和胃癌細胞MGC803、 AGS結合，并呈時間一濃度梯度依賴性的細胞ELISA結果。
[0039] 圖2B :顯示支原體氨基端多肽FITC-p37-2-23可以和胃癌細胞膜表面結合的激光 共聚焦檢測結果。
[0040] 圖2C :顯示p37氨基端多肽p37-2-23可阻斷支原體感染細胞的PCR檢測結果。
[0041] 圖3A :MALDI-T0F質譜分析結果顯示p37和ANXA2相互作用。
[0042] 圖3B :雙向免疫共沉淀實驗證實p37和ANXA2的相互作用。
[0043] 圖3C :顯示p37和ANXA2存在共定位的激光共聚焦免疫熒光檢測結果。
[0044] 圖3D :顯示p37的氨基端多肽介導p37和ANXA2的相互作用的GST pull-down檢 測結果。
[0045] 圖3E :顯示ANXA2的氨基端介導p37和ANXA2相互作用的GST pull-down檢測結 果。
[0046] 圖 3F :顯示 GST-p37 以及 GST-p37-2-23 和 ANXA2-2-26 的相互作用的 ELISA 實驗 結果。
[0047] 圖3G :顯示p37的氨基端多肽p37-2-23阻斷GST-p37和ANXA2的相互作用的 ELISA實驗結果。
[0048] 圖3H:顯示ANXA2氨基端2至26位的多肽片段可以阻斷豬鼻支原體的感染的定 量PCR檢測結果。
[0049] 圖4A :顯示抗ANXA2抗體阻斷豬鼻支原體與胃癌細胞結合的激光共聚焦免疫熒光 染色實驗結果。
[0050] 圖4B :顯示抗ANXA2抗體阻斷豬鼻支原體感染293T、GES-1、C0S-7和HUVEC等非 腫瘤細胞的PCR檢測結果。
[0051] 圖4C :顯示抗p37抗體可以阻斷豬鼻支原體的促胃癌細胞遷移作用的Transwell 實驗結果。
[0052] 圖4D :顯示ANXA2的RNAi干擾效果的Western Blot檢測結果。
[0053] 圖4E :顯示干擾ANXA2表達后抑制豬鼻支原體感染細胞的PCR檢測結果。
[0054] 圖4F :顯示干擾ANXA2后阻斷豬鼻支原體和胃癌細胞結合的激光共聚焦免疫熒光 染色檢測結果。
[0055] 圖4G:顯示干擾ANXA2表達后抑制阻斷豬鼻支原體的促胃癌細胞遷移作用的 Transwell實驗結果。
[0056] 圖5A :胃癌組織中有豬鼻支原體的感染（p37蛋白免疫組化檢測的代表圖）。
[0057] 圖5B :胃癌組織豬鼻支原體感染與各種臨床病理參數(shù)的相關性分析。
[0058] 圖5C :豬鼻支原體感染胃癌患者的生存期短（Kaplan-Meier曲線分析）。

【具體實施方式】
[0059] 下面結合具體實施例進一步闡明本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照本領域 的常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件進行。實施例中所用各原始試劑和材料均可商購 獲得。
[0060] 實施例1、豬鼻支原體感染哺乳動物細胞依賴于其表面膜蛋白p37
[0061] 本實施例中，通過文獻報道的常用細胞ELISA實驗證實豬鼻支原體和p37蛋白均 可以分別與細胞結合。
[0062] 細胞ELISA實驗即首先將胃癌細胞MGC803和AGS(這些細胞源自中國醫(yī)學科學 院腫瘤細胞庫）接種于96孔板進行培養(yǎng)48小時，然后分別加入1 X 103(XU，1 X 104(XU， 1 x 105(XU/mL的豬鼻支原體以感染細胞。感染持續(xù)24小時后，用PBS洗三遍，用0. 4%戊 二醛室溫固定lOmin，用5%奶粉/PBST室溫封閉2h，然后依次常規(guī)加入抗豬鼻支原體抗體、 酶標二抗及底物液，最后用ELISA READER測0D492nm。讀數(shù)越高表明支原體與細胞的結合越 多。結果顯示，豬鼻支原體和細胞結合呈濃度梯度依賴性（圖1A)。
[0063] 接下來，采用上述1 X 104(XU/mL的豬鼻支原體分別感染胃癌細胞MGC803和AGSO、 24、48小時，細胞ELISA結果顯示豬鼻支原體和細胞結合呈時間梯度依賴性（圖1A)。
[0064] 另外，用原核細胞重組表達純化的GST-p37處理胃癌細胞后，發(fā)現(xiàn)重組表達的 GST-p37蛋白也可以和胃癌細胞系結合，而且這種結合也呈明顯的時間和濃度梯度依賴性 (圖1B)。這提示豬鼻支原體感染胃癌細胞很可能是通過其表面膜蛋白p37所介導的。
[0065] 上述原核細胞重組表達蛋白GST-P37通過常規(guī)基因重組、細菌表達及蛋白純化的 方法獲得。簡言之，即將通過突變、能在細胞及細菌表達全長P37蛋白的cDNA(見Wen-Bin Liu,Jian-Zhi Zhang, Bei-Hai Jiang, et al: Lipoprotein p37 from mycoplasma hyorinis inhibiting mammalian cell adhesion J Biomedical. Science 2006 13:323-331)與原核 表達質粒PGEX4T-1進行重組，將重組質粒導入大腸桿菌BL21培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基中，待0D_ 達到1. 0時加入IPTG進行誘導表達，4小時后收集細菌，經溶菌酶處理及超聲裂解后離心， 取其上清用GST凝膠柱純化，獲得的GST-P37融合蛋白用蛋白電泳對其純度進行鑒定和定 量。
[0066] 用多聚酶鏈式反應實驗（PCR)擴增細胞中豬鼻支原體特異性DNA片段，結果揭示， 豬鼻支原體不僅可以感染腫瘤細胞系，也可以感染293T、GES-l、C0S-7和HUVEC等非腫瘤細 胞系（所用細胞除胃粘膜永生化細胞GES-1由北京市腫瘤防治研究所提供外，其余非腫瘤 細胞均源自美國ATCC細胞庫）（圖1C)。
[0067] 為了揭示p37在豬鼻支原體感染細胞中是否發(fā)揮重要作用，本實施例中采用了 P37抗體阻斷的方法，即先用抗P37的兔抗體與豬鼻支原體反應2小時，隨后把反應混合液 加到細胞培養(yǎng)體系中，培養(yǎng)24小時后棄去培養(yǎng)液，收集細胞并提取DNA，然后用PCR擴增細 胞中豬鼻支原體特異性DNA片段。結果顯示，5 μ g/mL的抗p37抗體可以明顯阻斷豬鼻支原 體對細胞的感染（圖1C)。其中，抗P37兔抗體的制備采用常規(guī)方法，簡言之用細菌表達獲 得的P37蛋白與福氏佐劑充分混合后常規(guī)皮下多點免疫家兔，共免疫三次，每次免疫至少 間隔四周，在末次免疫后第十至十四天采血，待血自然凝固后離心獲得抗血清，然后用蛋白 A凝膠柱純化，獲得兔抗P37蛋白抗體。
[0068] 細胞ELISA實驗結果也揭示抗p37抗體可以明顯阻斷豬鼻支原體對細胞的感染， 并且這種阻斷作用呈濃度梯度依賴性（圖1D)。
[0069] 免疫熒光染色結果也顯示抗p37抗體可以明顯阻斷豬鼻支原體感染胃癌細胞系 (圖 1E)。
[0070] 抗p37抗體不僅可以阻斷豬鼻支原體感染細胞，也可以阻斷豬鼻支原體所引起的 細胞遷移能力增強（圖1F)。
[0071] 以上實驗結果充分表明，豬鼻支原體感染細胞是依賴于其表面膜蛋白P37的，用 抗P37的抗體可以阻斷豬鼻支原體感染細胞。
[0072] 實施例2、p37的氨基端多肽阻斷支原體感染細胞
[0073] p37的氨基端序列（p37蛋白序列的第2位至第23位氨基酸序列，記做p37-2-23 : LKKLKNFILFSSIFSPIAFAIS，SEQ ID No. 1)是豬鼻支原體所特有的，而在其他類型的支原體 中并不存在（Dudler R, Schmidhauser C, Parish Rff, et al. A mycoplasma high-affinity transport system and the in vitro invasiveness of mouse sarcoma cells. (1988)The ΕΜΒ0 Journal 7, 3963-3970)。
[0074] 為了探討p37的氨基端在介導豬鼻支原體感染細胞中所發(fā)揮的作用，本實施例中 用GST融合蛋白通過ELISA檢測了其與細胞的結合。結果發(fā)現(xiàn)，原核重組表達的氨基端多 肽融合蛋白（GST-p37-2-23)可以和胃癌細胞系結合，并呈時間和濃度梯度依賴性，而缺失 氨基端多肽的P37蛋白（GST-p37- Λ 2-23)并不能夠和細胞結合（圖2A)。
[0075] 本實施例中GST-p37-2-23和GST-p37- Λ 2-23制備方法與上述GST-P37蛋白的 制備相類似。在制備GST-p37-2-23時，首先合成能編碼Ρ37第2至23位多肽片段的正義 寡核苷酸（5, -GATCCGAGGTAGCTTTTATGCTCAAAAAATTTAAAAATTTTATTC TATTTTCATCTATATTT TCGCCAATAGCATTTGCTATATCA JGA ￡-3'，SEQ ID No. 4)和反義寡核苷酸（5, -AATTC TC：A TGATATAGCAAATGCTATTGGCGAAAATATA GATGAAAATAGAATAAAATTTTTAAATTTTTTGAGCATAAAAGCT ACCTC ￡-3'，SEQ ID No. 5)，將二者退火形成雙鏈寡核苷酸后再與原核表達質粒pGEX4T-l 進行重組（寡核苷酸鏈中用黑體標出的為內切酶粘性末端序列）、表達及純化。在制備缺 失P37氨基端22個氨基酸片段的融合蛋白GST-p37- Λ 2-23時，采用相應的引物（正義 鏈引物為：5' -CGC GGATCC TTTGCTATATCATGTTC-3'，SEQ ID No. 6 ;反義鏈引物為：5' -CCG GAATTC TC'A TAATGGCTTTTTCAT-3'，SEQ ID No. 7 ;黑體為引入的酶切位點）通過常規(guī) PCR 擴增獲得缺少編碼P37氨基端22個氨基酸的P37 cDNA，經過常規(guī)酶切和與pGEX4T-l進行 重組、表達及純化。
[0076] 把氨基端多肽直接標記熒光素 FITC (FITC-p37-2-23)后進行免疫熒光染色，結果 顯示，F(xiàn)ITC-p37-2-23也可以直接和細胞結合（圖2B)。
[0077] 此外，合成的p37-2-23多肽可呈濃度梯度依賴性地阻斷豬鼻支原體和胃癌細胞 AGS的結合，在30 μ Μ時達到了接近完全阻斷的效果，而序列與p37-2-23多肽無關的對照肽 (序列為：DSGE⑶FLAEGGGVR，SEQ ID No. 8)沒有阻斷作用（圖2C)。
[0078] 以上結果表明，p37的氨基端多肽介導了其與細胞的結合，豬鼻支原體感染細胞依 賴于P37的氨基端多肽，用p37的氨基端多肽可以通過與細胞的結合競爭性抑制豬鼻支原 體的感染。
[0079] 實施例3、p37蛋白和宿主ANXA2蛋白分別通過氨基端發(fā)生相互作用
[0080] 為了尋找和p37相互作用的宿主細胞表面受體分子，本實施例首先通過GST pull-down技術將細胞裂解液中和p37相互作用蛋白進行富集，然后通過SDS-PAGE及考馬 斯亮藍染色找出差異條帶（圖3A中箭頭所示），將該條帶通過MALDI-T0F質譜分析鑒定，發(fā) 現(xiàn)其多肽片段為Annexin A2序列（圖3A)，表明p37的相互作用蛋白為Annexin A2(以下 稱 ANXA2)。
[0081] 為了驗證p37和Annexin A2之間存在相互作用，本實施例中，還分別用p37和 ANXA2抗體（該抗體購自Novus Biotechnology公司）通過常規(guī)雙向免疫共沉淀實驗，結果 表明用P37抗體進行免疫沉淀可以將ANXA2沉淀下來，反之用ANXA2抗體也能將P37沉淀 下來，說明P37和ANXA2確實存在相互作用（圖3B)，在實施例中也檢測了 P37與Annexin 蛋白家族其他分子，如ANXA1和ANXA4的相互作用，發(fā)現(xiàn)p37和它們并不存在相互作用（圖 3B)。
[0082] 在本實施例中還通過特異抗體分別將P37蛋白和ANXA2蛋白分別標記為綠色和紅 色，通過激光共聚焦免疫熒光實驗以更為直觀地判斷兩種蛋白之間是否存在相互作用，二 者如果存在共同的細胞定位，則綠色和紅色重疊顯示黃色。結果表明，P37和ANXA2在細胞 膜上存在共定位（圖3C)。
[0083] 為了確定P37蛋白與ANXA2相互作用的具體區(qū)域，在本實施例中，還進行了 GST pull-down實驗。結果顯示，p37的N端多肽融合蛋白GST-p37-2-23可以與ANXA2直接相 互作用，而缺失N端多肽的p37融合蛋白GST-p37- Λ 2-23和ANXA2并不能相互作用（圖 3D)，說明ρ37的Ν端多肽介導了 ρ37蛋白與ΑΝΧΑ2的相互作用。
[0084] ΑΝΧΑ2屬于鈣離子依賴型的膜聯(lián)蛋白家族，在人類中這一蛋白家族共有12個成 員。每個成員在蛋白質組成上的區(qū)別主要體現(xiàn)在其氨基端前26個氨基酸上，每個成員 氨基端特有的序列決定了其具有其他家族成員所不具有的某些特定功能（Gerke V，Moss S.Annexins:form structure to function. (2002)Physiol Rev 82, 331-371)。比如ANXA2 的N端結構域介導其與其他蛋白質相互作用。ANXA2的N端也包含一些磷酸化修飾位點， 這些位點被磷酸化激活后，都介導ANXA2的特定生物學功能。比如，ANXA2第23位酪氨酸 磷酸化可以促使其從胞漿里向細胞膜外表面轉運，進而促進相關生物學功能的發(fā)揮（Gerke V，Moss S.Annexins:form structure to function. (2002)Physiol Rev 82,331-371)。
[0085] 通過體外GST pull-down實驗，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)ANXA2的N端結構域介導其與p37結 合，缺失N端25個氨基酸的ANXA2蛋白并不能夠和p37發(fā)生直接相互作用（圖3E)。此外，固 相結合實驗揭示，ANXA2的N端結構域和p37以及p37的N端多肽均存在直接相互作用（圖 3F)，而且p37的N端多肽可以競爭性地阻斷ANXA2與p37的結合（圖3G)。本實施例通過體 外GST pull-down實驗，發(fā)現(xiàn)完整的ANXA2融合蛋白（His-ANXA2-FL)能夠同GST-p37相互 作用，而缺少氨基端25個氨基酸的ANXA2融合蛋白（His-ANXA2- Λ 2-26)不能與GST-p37 相互作用，表明ΑΝΧΑ2氨基端從第2至26的25個氨基酸多肽片段介導了 ΑΝΧΑ2與ρ37的 結合（圖3Ε)。
[0086] 為了進一步證明ρ37和ΑΝΧΑ2的結合是通過它們氨基端的多肽相互作用實現(xiàn)的， 本實施例還采用ELISA方法，用合成的ΑΝΧΑ2氨基端第2至26位的多肽包被96孔板（以 無關多肽SEQ ID No. 8作為對照），然后分別加入含有完整p37的GST-p37融合蛋白、只含 有P37氨基端多肽的GST-p37-2-23融合蛋白及缺失氨基端的GST-p37- Λ 2-23融合蛋白， 在反應一定時間后常規(guī)先后加入抗GST鼠單抗、抗鼠酶標二抗及底物液，然后在酶標儀上 進行度數(shù)檢測，結果表明，GST-p37和GST-p37-2-23均能與包被的ΑΝΧΑ2氨基端多肽特異 結合（與對照肽不結合），而缺少氨基端的Ρ37融合蛋白GST-p37- Λ 2-23與ΑΝΧΑ2氨基端 多肽不結合，這進一步證明了 ΑΝΧΑ2的氨基端結構域和ρ37以及ρ37的氨基端多肽均存在 直接相互作用（圖3F)。
[0087] 采用類似的ELISA實驗，用ΑΝΧΑ2的融合蛋白His-ANXA2包被96孔板，分別加入 GST-p37和GST-p37-2-23或同時加入GST-p37和GST-p37-2-23,檢測結果表明，p37氨基 端多肽融合蛋白GST-p37-2-23可以競爭性地阻斷GST-p37與ANXA2的結合（圖3G)，進一 步佐證了 P37與ANXA2的結合是通過其氨基端的22個多肽片段實現(xiàn)的。
[0088] 在證明豬鼻支原體通過p37氨基端同Annexin A2氨基端2至26位氨基酸的多肽 (STVHEILCKLSLE⑶HSTPPSAYGS，SEQ ID No. 2)結合后，為證明 Annexin A2 氨基端 2 至 26 位 氨基酸的多肽可通過競爭性結合阻斷豬鼻支原體同細胞Annexin A2的結合，進而抑制支原 體感染細胞，本案通過常規(guī)定量PCR對這一設想進行了驗證。實施方法是常規(guī)培養(yǎng)腫瘤細 胞MGC803,然后在加入豬鼻支原體的同時分別加入不同濃度的Annexin A2氨基端2至26 位氨基酸的多肽（分別為4 μ m和20 μ m)，以不加小肽或無關肽做對照，在感染細胞24小時 后洗去細胞培養(yǎng)上清，常規(guī)方法、提取DNA并通過定量PCR擴展p37基因。結果參見圖3H， 圖中①為未加入支原體、②為加只入支原體、③為加入支原體同時加入無關對照肽、④和⑤ 為加入支原體同時加入不同濃度的Annexin A2氨基端2至26位氨基酸的多肽（分別為 4μπι和20 μ m)。結果表明，Annexin A2氨基端2至26位氨基酸的多肽（SEQ ID No. 2)可 以有效阻斷支原體的感染。
[0089] 上述實驗從不同角度充分證明了豬鼻支原體蛋白p37和宿主細胞蛋白ANXA2的相 互作用是是分別通過他們氨基端的直接結合實現(xiàn)的。
[0090] 實施例4、ANXA2在介導豬鼻支原體感染細胞中是必需的
[0091] 為了探討ANXA2在介導豬鼻支原體感染細胞中的作用，本實施例中，在無支原體 感染的細胞培養(yǎng)液中先加入抗ANXA2抗體（5μ g/ml)，以封閉ANXA2蛋白。反應2小時后 再加入豬鼻支原體感染細胞，在培養(yǎng)24小時后分別用免疫熒光染色實驗及PCR擴增支原體 DNA的方法檢測豬鼻支原體感染細胞的情況。實驗結果顯示，抗ANXA2抗體處理細胞后，豬 鼻支原體與細胞的結合顯著減少（表現(xiàn)為熒光染色看不到支原體或PCR擴增支原體DNA的 量顯著減少，圖4A和圖4B)，說明用ANXA2抗體處理細胞可以明顯阻斷豬鼻支原體感染細 胞，表明ANXA2介導了豬鼻支原體對細胞的感染。
[0092] 采用常規(guī)的細胞遷移實驗（即Transwell chamber實驗，可參考文獻Hua Yang, Like Qu，Huachong Ma，et al:Mycoplasma hyorhinis infection in gastric carcinoma and its effets on the malignant phenotypes of gastric cancer cells. 2010, BMC Gastroenterology 10:132)檢測表明，細胞在先經ANXA2抗體處理后，可 顯著降低由豬鼻支原體引起的促細胞遷移作用（圖4C)。
[0093] 為了進一步驗證ANXA2在介導豬鼻支原體在感染細胞中的作用，本實施例中還采 用小分子 RNA (干擾序列為：AAGGACAU-UAUUUCGGACACA，SEQ ID No. 3)干擾 ANXA2 的表達， 使細胞不表達或減少ANXA2的表達（圖4D)，然后通過上述類似方法檢測豬鼻支原體對細 胞的感染情況，結果發(fā)現(xiàn)，用小分子RNA干擾ANXA2表達后豬鼻支原體感染細胞的能力明顯 下降（圖4E，用PCR檢測細胞的支原體DNA ;圖4F，用免疫熒光檢測細胞的豬鼻支原體蛋白 P37)。采用細胞遷移實驗發(fā)現(xiàn)，干擾ANXA2表達后豬鼻支原體的及促進細胞遷移能力也明 顯下降（圖4G)。這進一步證明了豬鼻支原體是通過ANXA2感染細胞的。
[0094] 上述實驗證明，通過抗ANXA2抗體封閉細胞膜上與可與豬鼻支原體結合的分子， 進而可以抑制豬鼻支原體感染細胞，從而本發(fā)明提供了一種可以預防豬鼻支原體感染細胞 的新的方法。
[0095] 實施例5、人胃癌組織的豬鼻支原體感染的檢測及與患者預后的相關性分析 [0096] 為了檢測胃癌組織中豬鼻支原體的感染與臨床病理參數(shù)與患者預后的關系，發(fā)明 人用常規(guī)的免疫組織檢測方法，用特異性抗P37蛋白抗體PD4對339例有隨訪資料的胃癌 組織進行了免疫組織化學的檢測（方法見Yang H，Qu LK，Ma HC，et al. (2010)Mycoplasma hyorhinis infection in gastric carcinoma and its effects on the malignant phenotypes of gastric cancer cells. BMC Gastroenterol 10,132)。圖 5A 提供的檢測 結果陽性的代表性圖片，5A中的1是用無關抗體的陰性對照，2至6分別表示對不同分化程 度的胃癌組織的組化檢測陽性結果。
[0097] 圖5B是胃癌組織豬鼻支原體感染與各種臨床病理參數(shù)的相關性分析，結果顯示， 在339例組織中，134例為染色陽性，陽性率為39. 5% (134/339)，支原體感染檢測陽性的病 例，其腫瘤侵犯血管及發(fā)生遠處轉移的比例明顯高于檢測陰性的病例，說明支原體感染與 腫瘤侵犯血管及發(fā)生遠處轉移呈明顯正相關（P值分別為〇. 021和0. 029,圖5B)。
[0098] 用Kaplan-Meier曲線分析顯示，支原體陽性的胃癌患者預后較支原體陰性的患 者差，生存期短（P值為〇. 040,圖5C)。
[0099] 上述研究結果表明，人胃癌組織中存在豬鼻支原體的感染，有豬鼻支原體感染的 患者其預后差，生存時間短。
【權利要求】
1. 針對豬鼻支原體膜蛋白P37或宿主細胞膜蛋白Annexin A2的拮抗劑在制備預防豬 鼻支原體感染細胞或促細胞遷移的制劑中的應用。
2. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其中，針對豬鼻支原體膜蛋白P37的拮抗劑為與豬鼻支 原體膜蛋白P37結合、從而抑制豬鼻支原體與細胞結合的試劑。
3. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其中，針對豬鼻支原體膜蛋白P37的拮抗劑為與豬鼻支 原體膜蛋白P37氨基端第2-23位氨基酸結合、從而抑制豬鼻支原體與細胞結合的試劑。
4. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其中，針對豬鼻支原體膜蛋白P37的拮抗劑為抗豬鼻支 原體膜蛋白P37或其抗原性片段的特異性單克隆抗體或多克隆抗體，或者包含Annexin A2 氨基端第2-26位氨基酸的多肽或蛋白。
5. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其中，針對宿主細胞膜蛋白Annexin A2的拮抗劑為與 Annexin A2結合、從而抑制豬鼻支原體與細胞結合的試劑。
6. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其中，針對宿主細胞膜蛋白Annexin A2的拮抗劑為與 Annexin A2氨基端第2-26位氨基酸結合、從而抑制豬鼻支原體與細胞結合的試劑。
7. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其中，針對宿主細胞膜蛋白Annexin A2的拮抗劑為包 含豬鼻支原體膜蛋白P37氨基端第2-23位氨基酸的多肽或蛋白。
8. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其中，針對宿主細胞膜蛋白Annexin A2的拮抗劑為： 針對Annexin A2或其抗原性片段的特異性單克隆抗體或多克隆抗體，或者干擾Annexin A2 表達的小分子干擾RNA;優(yōu)選地，所述小分子干擾RNA具有SEQ ID No. 3所示核苷酸序列。
9. 根據(jù)權利要求1所述的應用，其中，所述細胞為哺乳動物細胞，例如，為胃癌細胞 MGC803、胃癌細胞AGS、人腎上皮細胞293T、人胃粘膜永生化上皮細胞GES-1、非洲綠猴腎細 胞C0S-7或人靜脈內皮細胞。
10. -種預防豬鼻支原體感染細胞或促細胞遷移的制劑，其包含針對豬鼻支原體膜蛋 白P37或宿主細胞膜蛋白Annexin A2的拮抗劑。
【文檔編號】A61K39/40GK104138598SQ201410404272
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年8月15日 優(yōu)先權日:2014年8月15日
【發(fā)明者】壽成超, 段紅英, 陳玲, 楊華, 孟麟 申請人:北京市腫瘤防治研究所