血清中甘油三酯的甘油脫氫酶測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種應(yīng)用甘油脫氫酶測(cè)定血清中甘油三酯的方法，屬于利用可見(jiàn)光，通過(guò)測(cè)試反應(yīng)的結(jié)果產(chǎn)生顏色變化來(lái)測(cè)試材料的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是：甘油脫氫酶及NAD+同在試劑I中，試劑II含有脂蛋白脂肪酶有效成分；其測(cè)定方法為：血清先與試劑I于37℃溫浴3～5分鐘，血清中游離甘油與試劑I反應(yīng)生成NADH，加入試劑II后于37℃溫浴4～7分鐘，甘油三酯水解后生成甘油經(jīng)反應(yīng)產(chǎn)生NADH，儀器在340nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，以試劑I反應(yīng)產(chǎn)生的NADH為空白，由試劑II反應(yīng)產(chǎn)生的NADH計(jì)算出甘油三酯的含量。本發(fā)明檢測(cè)時(shí)不受內(nèi)源性甘油影響，其使用方法和范圍與其它酶法相同，所用工具酶少，受雜酶干擾少，試劑成本低，經(jīng)濟(jì)方便易行，是一種準(zhǔn)確性更高的甘油三酯檢測(cè)方法。
【專利說(shuō)明】血清中甘油三酯的甘油脫氫酶測(cè)定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于一種包含酶的測(cè)定方法；或是利用可見(jiàn)光，通過(guò)測(cè)試反應(yīng)的結(jié)果產(chǎn)生顏色變化來(lái)測(cè)試材料的方法，特別是涉及一種用生化分析儀檢測(cè)血清中甘油三酯的甘油脫氫酶測(cè)定方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]血清中甘油三脂(TG)的測(cè)定方法一般可分為化學(xué)法、酶法和色譜法3大類。早期測(cè)定方法是以總脂質(zhì)與膽固醇和磷脂之差估算。比較準(zhǔn)確的是二氯甲烷-硅酸-變色酸法(Van Handel-Caslson法)，此法抽提完全、能去除磷脂及甘油干擾、變色酸顯色靈敏度高、顯色穩(wěn)定，至今還是美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心(CDC)的內(nèi)部參考方法。但因操作步驟繁多、技術(shù)要求高而不適于臨床常規(guī)檢測(cè)工作中應(yīng)用。色譜法包括核素稀釋/氣相色譜/質(zhì)譜等方法(ID/GC/MS)，主要用作參考系統(tǒng)中決定性方法的建立及參考物質(zhì)的制備與定值，此法費(fèi)用昂貴，樣品處理復(fù)雜，難以推廣應(yīng)用，應(yīng)用高效液相色譜儀測(cè)定血清中的甘油三酯，檢測(cè)成本高，難以在臨床推廣。
[0003]目前國(guó)內(nèi)幾乎所有的臨床實(shí)驗(yàn)室都用酶法檢測(cè)血清TG水平，此方法分為一步法和兩步法，雖然方法各異，但一般都包括以下幾個(gè)基本反應(yīng)步驟:用最合適的脂蛋白脂肪酶(LPL)水解TG生成甘油和脂肪酸；水解后的甘油和三磷酸腺苷(ATP)在甘油激酶(GK)和甘油磷酸氧化酶(GPO)的催化下生成H2O2，在過(guò)氧化物酶(POD)的催化下，H2O2,4-氨基安替比林(4-AAP)和2，4-二氯酚形成有色染料(常為醌亞胺類)，這些物質(zhì)的生成量與樣本中的甘油三酯含量成正比。本發(fā)明采用甘油脫氫酶為工具酶，是將試劑分成兩部分，僅以脂蛋白脂肪酶為第二試劑，由于試劑組成成分加入順序不同，對(duì)甘油三酯測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生不同效果，具有消除游離甘油干擾的特性，本法應(yīng)用工具酶少，降低雜酶干擾和試劑成本等優(yōu)點(diǎn)，具體反應(yīng)步驟如下:
[0004]第一步反應(yīng):
[0005]
【權(quán)利要求】
1.一種血清中甘油三酯的甘油脫氫酶測(cè)定方法，其特征在于甘油脫氫酶及NAD+同在試劑I中，試劑II僅含有脂蛋白脂肪酶有效成分；其測(cè)定方法為:血清先與試劑I于37°c溫浴3~5分鐘，血清中游離甘油與試劑I的反應(yīng)生成NADH，加入試劑II后于37°C溫浴4~7分鐘，甘油三酯水解后經(jīng)反應(yīng)也生成NADH，儀器在334~340nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，以試劑I反應(yīng)產(chǎn)生的NADH為空白，由試劑II反應(yīng)產(chǎn)生的NADH計(jì)算出甘油三酯的含量，計(jì)算公式為:
ODtg = OD2-OD1X [ (SV+RJi) / (SY+R1Y,+R2Y2)] 甘油三酯濃度=FXODtg 其中ODtc是甘油三酯產(chǎn)生的吸光度，OD1是樣品加入試劑I反應(yīng)后測(cè)得的吸光度，OD2是樣品加入試劑II反應(yīng)后測(cè)得的吸光度，SV是血清的體積，R1V1是試劑I的體積，R2V2是試劑II的體積，F(xiàn)是校正因數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血清中甘油三酯的甘油脫氫酶測(cè)定方法，其特征在于試劑I中含有甘油脫氫酶及NAD+。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的血清中甘油三酯的甘油脫氫酶測(cè)定方法，其特征在于試劑I中每升碳酸鹽緩沖液溶解碳酸鉀100~300mmol,碳酸氫鈉100~300mmol, NAD+5~15mmol，甘油脫氫酶 40000 ~50000U, Proclin-300 防腐劑 100 μ I ~300 μ I ;試劑 II 中每升碳酸鹽緩沖液溶解碳酸鉀100~300mmol，碳酸氫鈉100~300mmol，溶解脂蛋白脂肪酶1800 ~2100U，Triton X-100 0.08g ~0.16g, Proclin-300 防腐劑 100 μ I ~300 μ I。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的血清中甘油三酯的甘油脫氫酶測(cè)定方法，其特征在于試劑I和試劑II中碳酸鹽緩沖 液的PH值為10.5~11.5。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的血清中甘油三酯的甘油脫氫酶測(cè)定方法，其特征在于測(cè)定的體積比為:樣品:試劑1:試劑II = I: 70~80: 20~30。
【文檔編號(hào)】C12Q1/32GK103602718SQ201310601425
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月20日
【發(fā)明者】李立和, 張超, 白會(huì)倉(cāng), 丁弘, 郭秋紅 申請(qǐng)人:天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院