專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種植物三磷酸甘油醛脫氫酶基因及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因植物領(lǐng)域，更具體涉及一種植物三磷酸甘油醛脫氫酶基因，同時(shí)還涉及一種植物三磷酸甘油醛脫氫酶基因的制備方法，還涉及植物三磷酸甘油醛脫氫酶基因在水稻抗逆中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：三石舞酸—甘油IIJKS1BI(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase；GAPDH)是糖酵解途徑中必不可少的關(guān)鍵酶之一，它催化D-甘油醛-3-磷酸(G-3P)可逆的氧化和磷酸化，生成1，3-二磷酸甘油酸(DPGA)，是維持生命活動(dòng)最基本的酶之一，廣泛存在與各種生物細(xì)胞中。最近的相關(guān)研究表明，真核及原核生物的3-磷酸甘油醛脫氫酶除了在糖酵解中起重要作用外，它在膜溶解、微管集束、磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡、核RNA輸出、及其在細(xì)胞周期中都發(fā)揮著重要的作用。另外，GAPDH基因還具有較強(qiáng)的抵御環(huán)境脅迫的能力，尤其在高溫、高鹽、低溫等脅迫條件下，利用酵母表達(dá)技術(shù)已經(jīng)證明該基因具有抗鹽、堿和高溫脅迫的功能，是一種重要的抗逆境脅迫基因。該酶在植物中的研究不如在哺乳動(dòng)物中的深入，但研究已經(jīng)陸續(xù)證明，3-磷酸甘油醛脫氫酶在植物中同樣具有許多未被發(fā)現(xiàn)的功能，目前已經(jīng)報(bào)道該酶在厭氧、熱激、傷害以及能量供應(yīng)中可能發(fā)揮著重要作用。目前已從眾多植物中克隆出了3—磷酸甘油醛脫氫酶基因，而單子葉禾本科植物中，大麥、玉米、谷子、水稻的胞質(zhì)3—磷酸甘油醛脫氫酶基因也先后被克隆出來(lái)，在植物中的研究表明，缺氧和熱激都可以誘導(dǎo)GAPDH基因的表達(dá)，早先在煙草愈傷培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基中高濃度的蔗糖也能使GapC類(lèi)基因的表達(dá)量也有上升。植物自身的應(yīng)激反應(yīng)在減小機(jī)械損傷、昆蟲(chóng)和病原體侵襲方面起著重要的作用，GAPDH基因在這些傷害反應(yīng)中也有較高水平的表達(dá)。最近，以擬南芥原生質(zhì)體和酵母為材料的研究證明了GAPDH基因參與了H202調(diào)控的細(xì)胞凋亡，在H2O2處理?xiàng)l件下，擬南芥GAPDH基因的表達(dá)上調(diào)，并且可以抑制由熱激導(dǎo)致的H2O2含量的提高和細(xì)胞死亡，本發(fā)明中分離出一個(gè)水稻中新的GAPDH家族成員，該基因抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株在水稻幼苗時(shí)期表現(xiàn)為耐鹽，為水稻抗逆品系的篩選和獲得提供了一種新的方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供了一種植物三磷酸甘油醛脫氫酶基因，所獲得的轉(zhuǎn)基因植株遺傳穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)室的過(guò)量表達(dá)載體PUbiO為高效的組成型的表達(dá)載體，可獲得目的基因高表達(dá)量的轉(zhuǎn)基因植株；另外本實(shí)驗(yàn)室所用的轉(zhuǎn)化材料中花11相對(duì)其他品種在水稻轉(zhuǎn)化的應(yīng)用中也有很高的轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種植物三磷酸甘油醛脫氫酶基因的制備方法，該方法獲得的水稻三磷酸甘油醛脫氫酶基因的全長(zhǎng)cDNA序列，而非全長(zhǎng)的基因組序列，因?yàn)檎婧松锘蚪MDNA十分龐大，其復(fù)雜程度是蛋白質(zhì)和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重復(fù)序列，因此由mRNA出發(fā)的cDNA克隆，其復(fù)雜程度要比直接從基因組克隆要簡(jiǎn)單得多；另外，本方法獲得的該基因處于單子葉植物的強(qiáng)效啟動(dòng)子-泛素啟動(dòng)子的調(diào)控之下，使得該基因可組成型的表達(dá)，不受外界環(huán)境因素的干擾，且遺傳穩(wěn)定。一種能過(guò)量表達(dá)該3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的植株，該轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為耐鹽。本發(fā)明的再一個(gè)目的是在于提供了一種植物三磷酸甘油醛脫氫酶基因在水稻抗逆中的應(yīng)用，該酶在糖酵解途徑中催化D-甘油醛-3-磷酸(G-3P)可逆的氧化和磷酸化，生成1，3-二磷酸甘油酸(DPGA)，是維持生命活動(dòng)最基本的酶之一，同時(shí)，近期的研究還表明該基因參與了植物的脅迫應(yīng)答，由于糖分子也是一種重要的信號(hào)分子，所以對(duì)該基因的研究，將對(duì)申請(qǐng)人理解由營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、生物激素和一些化學(xué)分子組成的復(fù)雜的植物信號(hào)途徑以及它們所調(diào)控的植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境應(yīng)答有十分重要的意義。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方法—種植物三磷酸甘油醛脫氫酶基因的制備方法，該方法包括以下步驟A、利用PCR技術(shù)，以水稻兩周幼苗的總cDNA(提取兩周水稻幼苗的RNA，并以此RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得雙鏈的水稻總cDNA)為模板，并根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的基因的cDNA序列(其序列為SEQIDNO:3所示的核苷酸序列)，設(shè)計(jì)一對(duì)包含了該基因全長(zhǎng)ORF(開(kāi)放閱讀框)的特異引物，以B-Taq(TC)YOBA公司)為DNA聚合酶PCR擴(kuò)增(940C3min，94°C30s,55°C30s,72°Clmin,30cycles,72°CIOmin)；產(chǎn)物電泳并切膠回收(安比奧公司膠回收試劑盒)，從而獲得包含該水稻三磷酸甘油醛脫氫酶基因的全長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框的cDNA序列(1200bp)，其序列為SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。B、將A步獲得的基因片段連接到商業(yè)中間載體PBS-TII(TIANGEN公司)中(載體圖譜如圖1)，測(cè)序驗(yàn)證，獲得堿基序列完全正確的該水稻三磷酸甘油醛脫氫酶基因片段，一種分離植物三磷酸甘油醛脫氫酶基因，其序列為SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。C、將B步驗(yàn)證獲得的正確的基因片斷連接到改造獲得的載體PUbiO(王瑩博士畢業(yè)論文水稻胚胎發(fā)生過(guò)程中的基因表達(dá)分析，2004年)中，pUbiO載體是在載體pAHC17(ALANH.CHRISTENSENandPETERH.QUAIL.Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,1996,5:213_218)禾口pCAMBIA1301(http://www.patentlens.net/daisy/bios/585.html)的基礎(chǔ)上改造而來(lái)的，載體pAHC17含有改造過(guò)的玉米泛素啟動(dòng)子及NOS尾巴，而載體pCAMBIA1300(http://www.patentlens.net/daisy/bios/585.html)系列是目前植物轉(zhuǎn)甚因中使用較多的植物表達(dá)載體之一。一種載體PUbiO的構(gòu)建步驟是首先將載體PAHC17的NOS尾巴之前引入四個(gè)多克隆位點(diǎn)-BamHI,KpnI.SacI.SmalI。隨后將改造過(guò)的pAHC17利用雙酶切得到包含玉米泛素啟動(dòng)子及NOS尾巴的片段，同時(shí)用相同的雙酶切處理pCAMBIA1301，并與上述的片段進(jìn)行連接，從而得到含有玉米泛素啟動(dòng)子和NOS尾巴的可用于水稻過(guò)量表達(dá)的載體，如圖2所示，使得水稻三磷酸甘油醛脫氫酶基因置于玉米泛素啟動(dòng)子和NOS尾巴之間，形成可轉(zhuǎn)化或表達(dá)的載體；D、將制備的含有目的基因的過(guò)量表達(dá)載體pUbiO轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105(來(lái)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，)，導(dǎo)入成熟胚誘導(dǎo)的水稻愈傷組織中，并經(jīng)過(guò)再分化最終獲得過(guò)量表達(dá)該基因的水稻轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明中涉及的此水稻三磷酸甘油醛脫氫酶基因參與水稻幼苗期的鹽脅迫反應(yīng)途徑。對(duì)該脫氫酶的蛋白分析(http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/)表明，它含有三磷酸甘油醛脫氫酶的保守的結(jié)構(gòu)域(如圖6)，對(duì)其他物種，如玉米、擬南芥，的研究表明，植物三磷酸甘油醛脫氫酶基因參與了一系列脅迫應(yīng)答反應(yīng)，因此，申請(qǐng)入對(duì)這一水稻的三磷酸甘油醛脫氫酶基因在各種脅迫條件下的基因表達(dá)進(jìn)行的分析，野生型中花11在正常的MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一周后，分別置于42°C、200mM鹽、20%PEG中，并在0、1、2、4、8、12、24小時(shí)后取樣，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后進(jìn)行半定量PCR分析，結(jié)果表明，該基因在高鹽、干旱、熱激條件下的表達(dá)量均出現(xiàn)上調(diào)(如圖7)，同時(shí)，申請(qǐng)人還對(duì)該水稻基因的過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了耐鹽分析，將轉(zhuǎn)基因過(guò)量表達(dá)植株的T2代種子和野生型的中花11水稻種子剝殼，無(wú)菌處理，將種子接種在MS培養(yǎng)基上，28°C，16hr光/Shr暗，生長(zhǎng)一周后統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因植株和野生型的株高，選擇與野生型植株長(zhǎng)勢(shì)一致的過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，以野生型為對(duì)照，再進(jìn)行消毒處理后，接種到含有200mMNaCl的MS培養(yǎng)基中，28°C，16hr光/8hr暗，培養(yǎng)兩周后統(tǒng)計(jì)株高，結(jié)果顯示，野生型的水稻在高鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)兩周后的株高平均為4.71厘米，而兩個(gè)過(guò)量表達(dá)株系的平均株高則分別達(dá)到了6.10厘米和5.77厘米，相對(duì)野生型為高，表明該3-磷酸甘油醛脫氫酶基因過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)化植株在高鹽濃度的培養(yǎng)基上，相對(duì)野生型，該基因的過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株在高鹽脅迫下生長(zhǎng)兩周后的植株高度明顯比野生型要高，證明過(guò)量表達(dá)該基因提高了水稻抗逆性。一種植物三磷酸甘油醛脫氫酶基因在水稻抗逆中的應(yīng)用，其應(yīng)用過(guò)程是在本發(fā)明中，該絲氨酸-色氨酸蛋白激酶基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中基因序列號(hào)為0s02g0601300，該基因序列為SEQIDNO:3所示序列。通過(guò)兩種引物GAPF(CGGGATCCCGTTTGCACTCCTCTCGATCTC)和GAI3R(CGGGATCCTCTGCAGGCCTCCATGAGGAG)，其核酸序列分別為SEQIDNO1和SEQIDNO:2，以已得到的水稻cDNA文庫(kù)作為模板，通過(guò)PCR方式合成并獲得了一段1200bp長(zhǎng)度的包含了該激酶基因全長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框的片斷。將該片斷連接到商業(yè)中間過(guò)渡載體PBS-TII中其插入片斷經(jīng)過(guò)核酸測(cè)序鑒定正確，然后通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶BamHI酶切獲得該片段，并將其連入同樣用BamHI處理過(guò)的過(guò)量表達(dá)載體pUbiO中，獲得正向的插入。將含有目的片斷的載體轉(zhuǎn)染農(nóng)桿菌EHA105，培養(yǎng)農(nóng)桿菌于YM培養(yǎng)基中，并將成熟胚誘導(dǎo)的水稻愈傷組織在菌液中浸泡，最后在加潮霉素的選擇培養(yǎng)基中篩選陽(yáng)性克隆。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，愈傷組織選自水稻，通過(guò)選擇培養(yǎng)基最后篩選得到3-磷酸甘油醛脫氫酶基因過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，該植株在幼苗時(shí)期表現(xiàn)為耐鹽特性。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果本發(fā)明提供了一個(gè)水稻三磷酸甘油醛脫氫酶基因的制備方法以及該基因在水稻中的應(yīng)用，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻愈傷遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得了該基因的水稻過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，發(fā)明中的水稻愈傷是由種胚誘導(dǎo)而成，所獲得的轉(zhuǎn)基因植株遺傳穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)室的過(guò)量表達(dá)載體PUbiO為高效的組成型的表達(dá)載體，可獲得目的基因高表達(dá)量的轉(zhuǎn)基因植株；另外本實(shí)驗(yàn)室所用的轉(zhuǎn)化材料中花11相對(duì)其他品種在水稻轉(zhuǎn)化的應(yīng)用中也有很高的轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明中過(guò)量表達(dá)了一個(gè)植物生長(zhǎng)發(fā)育中的一個(gè)關(guān)鍵酶基因三磷酸甘油醛脫氫酶基因，并發(fā)現(xiàn)該基因的過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為耐鹽，發(fā)現(xiàn)了該基因在植物抗逆反面新的功能。本方法獲得的該基因處于單子葉植物的強(qiáng)效啟動(dòng)子-泛素啟動(dòng)子的調(diào)控之下，使得該基因可組成型的表達(dá)，不受外界環(huán)境因素的干擾，且遺傳穩(wěn)定。一種能過(guò)量表達(dá)該3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的植株，該轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)為耐鹽。圖1為一種植物表達(dá)載體示意圖中間載體PBS-TII圖2為一種植物表達(dá)載體示意圖過(guò)量表達(dá)載體pUbiOHygromycin為潮霉素抗性，promoter為泛素啟動(dòng)子，NOS尾巴為轉(zhuǎn)錄終止子。圖3為一種轉(zhuǎn)化植株基因組PCR鑒定結(jié)果其中1為對(duì)照野生型植株，2-10為轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果顯示1_5#轉(zhuǎn)基因植株均有插入。圖4為一種轉(zhuǎn)化植株半定量PCR分析鑒定結(jié)果其中7為對(duì)照野生型植株，1-6為轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果顯示1、2、3轉(zhuǎn)基因植株目的片斷表達(dá)量有上調(diào)。圖5為一種轉(zhuǎn)基因植株耐鹽表型統(tǒng)計(jì)分析橫坐標(biāo)為株系類(lèi)型，從左至右依次為野生型、過(guò)量表達(dá)株系3、過(guò)量表達(dá)株系2，縱坐標(biāo)為在高鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)兩周后的株高統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示在高鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)兩周后過(guò)量表達(dá)株系相對(duì)野生型株高較高。圖6為一種植物蛋白結(jié)構(gòu)域分析其中Gp_dh_Csuperfamily為三磷酸甘油醛脫氫酶的C-端結(jié)構(gòu)域，Gp_dh_Nsuperfamily為三磷酸甘油醛脫氫酶的N-端的NAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域，GAPDH-I為三磷酸甘油醛脫氫酶I的保守結(jié)構(gòu)域。圖7為一種基因在脅迫條件下的表達(dá)量半定量PCR分析其中由左至右為基因在高溫、高鹽和干旱條件下的表達(dá)量的變化，上標(biāo)為處理厚的時(shí)間，中間為基因的表達(dá)，下面為內(nèi)標(biāo)的表達(dá)，結(jié)果表明，該基因在這些脅迫條件下的表達(dá)有所上調(diào)。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件如陳正華主編，高等教育出版社，1986，木本植物組織培養(yǎng)及其應(yīng)用；(德國(guó))賴(lài)納特(REINERT，J.)，(英)約曼(YEOMAN，Μ.M.)著；尤瑞麟，王模善譯，北京大學(xué)出版社，1988，植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)；以及(德)巴爾茨(W.BARZ)等主編；夏鎮(zhèn)澳等譯，科學(xué)出版社，1983，植物組織培養(yǎng)及其在生物技術(shù)上的應(yīng)用等書(shū)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1一種植物三磷酸甘油醛脫氫酶基因的制備方法，其步驟是A利用PCR技術(shù)，以水稻兩周幼苗總cDNA(提取兩周水稻幼苗的RNA，并以此RNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得雙鏈的水稻總cDNA)為模板，并根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提供的基因的cDNA序列(SEQIDNO3)設(shè)計(jì)一對(duì)包含了該基因全長(zhǎng)ORF的特異引物，其核酸序列分別為SEQIDNO:1禾口SEQIDNO:2，以B-Taq(TOYOBA公司)為DNA聚合酶PCR擴(kuò)增(94°C3min,94°C30s,55°C30s,72°Clmin,30cycles,72°CIOmin)；產(chǎn)物電泳并切膠回收(安比奧公司膠回收試劑盒)，從而獲得該水稻三磷酸甘油醛脫氫酶基因cDNA序列(1200bp)；其序列為SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。B將A步獲得的基因片段連接到商業(yè)中間載體PBS-TII(TIANGEN公司)中，測(cè)序驗(yàn)證，獲得堿基序列完全正確的該水稻三磷酸甘油醛脫氫酶基因的片段，一種分離植物三磷酸甘油醛脫氫酶基因，其序列為SEQIDNO:4所示的核苷酸序列。C將B步驗(yàn)證獲得的正確的基因片斷通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶BamHI酶切，獲得的片段連接到同樣用BamHI酶切的本實(shí)驗(yàn)室改造獲得的載體pUbiO中，pUbiO載體是在載體PAHC17和pCAMBIA1301的基礎(chǔ)上改造而來(lái)的，載體pAHC17含有改造過(guò)的玉米泛素啟動(dòng)子及NOS尾巴，而載體pCAMBIA1300系列是目前植物轉(zhuǎn)基因中使用較多的植物表達(dá)載體之一。一種載體PUbiO其構(gòu)建過(guò)程是首先將載體PAHC17的NOS尾巴之前引入四個(gè)多克隆位點(diǎn)-BamHI、KpnI、SacI.SmalI。隨后將改造過(guò)的pAHC17利用雙酶切得到包含玉米泛素啟動(dòng)子及NOS尾巴的片段，同時(shí)用相同的雙酶切處理pCAMBIA1301，并與上述的片段進(jìn)行連接，從而得到含有玉米泛素啟動(dòng)子和NOS尾巴的可用于水稻過(guò)量表達(dá)的載體，如圖2所示，使得水稻三磷酸甘油醛脫氫酶基因置于玉米泛素啟動(dòng)子和NOS尾巴之間，形成可轉(zhuǎn)化或表達(dá)的載體；D將制備的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105(來(lái)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)，導(dǎo)入成熟胚誘導(dǎo)的水稻愈傷組織中，并經(jīng)過(guò)再分化最終獲得過(guò)量表達(dá)該基因的水稻轉(zhuǎn)基因植株。實(shí)施例2該3-磷酸甘油醛脫氫酶基因過(guò)量表達(dá)植株的轉(zhuǎn)化與篩選水稻農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化成熟的水稻種子去殼，所用品系為粳稻中花11(來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所)。超凈臺(tái)上無(wú)菌水洗3次，在70%(體積比)乙醇潤(rùn)洗，后消毒5分鐘，無(wú)菌水清洗種子3次，5%(質(zhì)量體積比)次氯酸鈉消毒種子45分鐘。無(wú)菌水清洗種子5-6次，將種子倒入滅菌濾紙上吸干，吹干后將種子接種在N6培養(yǎng)基(參照《植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》)中，28°C，暗培養(yǎng)4周。觀察誘導(dǎo)的愈傷，把淡黃色、致密的胚性愈傷與小盾牌分離后，轉(zhuǎn)入新的N6培養(yǎng)基中，繼代培養(yǎng)2周。選擇致密、相對(duì)干燥的胚性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基(N6培養(yǎng)基大量微量減半，并添加200uM的AS(乙酰丁香酮))上，28°C下暗培養(yǎng)2_4天。同時(shí)挑取農(nóng)桿菌EHA105(來(lái)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)陽(yáng)性克隆，將適量農(nóng)桿菌涂布接種在含有相應(yīng)抗生素的YM固體培養(yǎng)基上，28°C下暗培養(yǎng)36小時(shí)。收集農(nóng)桿菌重懸于1/2N6+AS培養(yǎng)基，使細(xì)菌懸液的0D600達(dá)到0.8-1.0。將經(jīng)過(guò)前培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)入其中浸泡約15-25分鐘。將菌液倒出，把愈傷在無(wú)菌紙上，保證菌液洗干，再轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基上于20°C暗培養(yǎng)3天。將共培養(yǎng)的愈傷用無(wú)菌水清洗3次，再加入含有頭孢霉素(500mg/L)的N6液體培養(yǎng)基清洗，重復(fù)2-3次。將干燥的愈傷轉(zhuǎn)入含有頭孢霉素(250mg/L)和潮霉素(50mg/L)的N6培養(yǎng)基，28°C，暗培養(yǎng)兩周，再轉(zhuǎn)入新的選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)兩周。將最后一次篩選的愈傷培養(yǎng)組織轉(zhuǎn)入含有潮霉素(50mg/L)的預(yù)分化培養(yǎng)基中，28°C，暗培養(yǎng)一周。選出長(zhǎng)勢(shì)良好的淡黃色愈傷，移入含有潮霉素(50mg/L)的MS培養(yǎng)基中，光培養(yǎng)1520天，可以看到有綠芽長(zhǎng)出，15天換一次培養(yǎng)基。當(dāng)綠芽的長(zhǎng)度達(dá)到2厘米左右時(shí)，移入1/2MS生根培養(yǎng)基中。等長(zhǎng)出根系后，將再生植株轉(zhuǎn)入培養(yǎng)缽中培養(yǎng)。移栽后的幼苗放在溫室培養(yǎng)成成苗。實(shí)施例3該3-磷酸甘油醛脫氫酶基因過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)化植株的核酸分析1、用于PCR的轉(zhuǎn)化植株總DNA的提取采用CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法提取轉(zhuǎn)基因植株的總DNA，首先，取長(zhǎng)約2厘米的幼嫩水稻葉片，放于研缽中，加入1.5XCTAB提取液(CTAB15g，IMTris·Cl，pH8.0，75ml，0.5MEDTA30ml,NaCl61.4g加水定容至1000ml)溶液300μ1，研磨至漿狀，再加入300μ1的1.5XCTAB提取液，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中。65°C溫浴至少30分鐘。冷卻至室溫(20-25°C以下相同)，加入600μ1體積比為241的氯仿異戊醇(體積比241)，顛倒混勻后，12000rpm,室溫離心5分鐘。吸取上清，加入等體積的異丙醇室溫沉淀10分鐘。4°C，12000rpm，離心10分鐘。棄上清，70%(體積比)乙醇洗滌沉淀一次。干燥沉淀后，力口入50ul雙蒸水或TE(10mmol/lTris-Cl，Immol/IEDTA)溶液溶解。2、轉(zhuǎn)化植株的基因組PCR鑒定PCR反應(yīng)體系為DNA模板Ι.ΟμΙ10XBuffer(含Mg2+)3.0μ12mMdNTP0.6μ1IOmM的上游引物0.6μ1IOmM的下游引物0.6μ1Taq酶(2.5U)0.3μ1加ddH20至30μ1PCR擴(kuò)增條件為-MV，3分鐘；940C30秒，55°C30秒，72°C1分鐘；35個(gè)循環(huán)數(shù)；720C10分鐘。結(jié)果如圖3所示。實(shí)施例4該3-磷酸甘油醛脫氫酶基因過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)化植株的半定量PCR分析1、轉(zhuǎn)化植株mRNA的提取將水稻幼葉用剪刀剪下迅速稱(chēng)量后(50mg)置于液氮中，研磨成粉末狀后加ImlRNA提取液(Trizol)，室溫放置5分鐘；加入0.2ml氯仿(氯仿Trizol=1:5)，猛烈搖動(dòng)15秒，室溫放置約2分鐘，4°C，12000rpm離心15分鐘；取上層無(wú)色上清，加入0.5ml異丙醇(異丙醇Trizol=12)，室溫放置10分鐘后4°C，12000rpm離心15分鐘；加75%(體積比)乙醇Iml洗滌沉淀一次，用槍吹打沉淀使其懸浮，4°C，7500rpm離心5分鐘；吸去上面液體，空氣中干燥5分鐘或超凈臺(tái)上吹干；溶沉淀于DEPC水中。2、通過(guò)RT-PCR反轉(zhuǎn)錄得到水稻cDNA文庫(kù)。3、PCR反應(yīng)用上述反應(yīng)得到的cDNA產(chǎn)物作模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，體系如下PCR反應(yīng)體系為cDNA模板Ι.ΟμΙ10XBuffer(含Mg2+)3.0μ12mMdNTP0.6μ1IOmM的上游引物0.6μ1IOmM的下游引物0.6μ1Taq酶(2.5U)0.3μ1力口ddH20至30μ1PCR擴(kuò)增條件為94°C，3分鐘；94°C30秒，55°C30秒，72°C1分鐘；30個(gè)循環(huán)數(shù);720C10分鐘；4°C保存。結(jié)果如圖4所示實(shí)施例5—種植物三磷酸甘油醛脫氫酶基因在水稻抗逆中的應(yīng)用。將轉(zhuǎn)基因過(guò)量表達(dá)植株的T2代種子和野生型的中花11水稻種子剝殼，無(wú)菌處理超凈工作臺(tái)上操作，步驟如下首先用無(wú)菌水清洗種子三次，洗去表面的種子表面的灰塵，然后再用70%(體積比)乙醇中消毒5分鐘，無(wú)菌水清洗種子3次，5%(質(zhì)量體積比)次氯酸鈉消毒種子45分鐘。無(wú)菌水清洗種子5-6次后，將種子接種在MS培養(yǎng)基上，280C，16hr光/8hr暗，生長(zhǎng)一周后統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因植株和野生型的株高，選擇與野生型植株長(zhǎng)勢(shì)一致的過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，以野生型為對(duì)照，再進(jìn)行消毒處理后，接種到含有200mMNaCl的MS培養(yǎng)基中，28°C，16hr光/Shr暗，培養(yǎng)兩周后統(tǒng)計(jì)株高，結(jié)果顯示，野生型的水稻在高鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)兩周后的株高平均為4.71厘米，而兩個(gè)過(guò)量表達(dá)株系的平均株高則分別達(dá)到了6.10厘米和5.77厘米，結(jié)果顯示，該3-磷酸甘油醛脫氫酶基因過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)化植株在高鹽濃度的培養(yǎng)基上，與野生型比較，株高較高，如圖5所示。權(quán)利要求一種分離的三磷酸甘油醛脫氫酶基因，其序列為SEQIDNO4所示核苷酸序列。2.權(quán)利要求1所述一種植物三磷酸甘油醛脫氫酶基因的制備方法，該方法包括以下步驟A、利用PCR技術(shù)，以水稻兩周幼苗總cDNA為模板，并根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提供的基因的cDNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)包含了該基因全長(zhǎng)0RF的特異引物，以B-Taq為DNA聚合酶PCR擴(kuò)增，94°C3min，94°C30s，55°C30s，72°Clmin,30cycles,72°ClOmin，產(chǎn)物電泳并切膠回收，獲得包含該水稻三磷酸甘油醛脫氫酶基因的全長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框的cDNA序列；B、將(A)步驟獲得的基因片段連接到中間載體PBS-TII中，測(cè)序驗(yàn)證，獲得堿基序列完全正確的水稻三磷酸甘油醛脫氫酶基因的全長(zhǎng)片段；C、將(B)步驗(yàn)證獲得的正確的基因片斷連接到改造獲得的載體pUbiO中，使水稻三磷酸甘油醛脫氫酶基因置于玉米泛素啟動(dòng)子和N0S尾巴之間，形成轉(zhuǎn)化或表達(dá)的載體；D、將制備獲得的含有目的基因的過(guò)量表達(dá)載體pUbiO轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，導(dǎo)入成熟胚誘導(dǎo)的水稻愈傷組織中，并經(jīng)過(guò)再分化終獲得過(guò)量表達(dá)該基因的水稻轉(zhuǎn)基因植株。3.權(quán)利要求1中所示的一種三磷酸甘油醛脫氫酶基因在水稻抗逆中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種植物三磷酸甘油醛脫氫酶基因及制備方法和應(yīng)用，步驟A、以水稻兩周幼苗總cDNA為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，以B-Taq為DNA聚合酶PCR擴(kuò)增，獲得水稻三磷酸甘油醛脫氫酶基因；B、將(A)步驟獲得的基因片段連接到中間載體中，并測(cè)序驗(yàn)證；C、將(B)步驗(yàn)證獲得的基因片斷連接到載體中，使水稻三磷酸甘油醛脫氫酶基因置于玉米泛素啟動(dòng)子和NOS尾巴之間，形成轉(zhuǎn)化；D、將制備獲得的含有目的基因的過(guò)量表達(dá)載體pUbiO轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，導(dǎo)入水稻愈傷組織中，獲得水稻轉(zhuǎn)基因植株。該基因在水稻中的應(yīng)用。獲得的該基因處于單子葉植物的強(qiáng)效啟動(dòng)子-泛素啟動(dòng)子的調(diào)控之下，該基因表達(dá)，不受外界環(huán)境因素的干擾，且遺傳穩(wěn)定。文檔編號(hào)A01H5/00GK101831448SQ20101013628公開(kāi)日2010年9月15日申請(qǐng)日期2010年3月26日優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日發(fā)明者呂應(yīng)堂,張秀紅,饒曉蘭申請(qǐng)人:武漢大學(xué)