用于檢測新布尼亞病毒的核酸和實時熒光定量檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于PCR檢測新布尼亞病毒的核酸和實時熒光RT-PCR試劑盒，其核酸序列如SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示；其用于檢測新布尼亞病毒的實時熒光RT-PCR試劑盒，包括2×RT-PCR緩沖液，25×RT-PCRenzymeMix，上下游引物，探針，陰性對照，陽性對照。提供的實時熒光定量PCR檢測試劑盒使用方便，試劑盒所用的試劑少，大大簡化了操作過程，減少了在操作過程的污染，檢測特異性強，靈敏度高，適用于快速檢測新型蜱傳新布尼亞病毒。
【專利說明】用于檢測新布尼亞病毒的核酸和實時熒光定量檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體設(shè)計一種用于檢測新布尼亞病毒的核酸和實時熒光RT-PCR檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]新布尼亞病毒(SFTSV)屬于布尼亞病毒科白蛉病毒屬，是一種有包膜分階段的負鏈RNA病毒。病毒基因組包括L、M、S三個片段，分別編碼RNA依賴的RNA聚合酶和包膜糖蛋白G1、G2以及核蛋白。
[0003]中國疾控中心病毒病所通過大量的調(diào)查研究，明確了新布尼亞病毒致病的臨床表現(xiàn)和流行病學(xué)特征。比如患者的主要癥狀是發(fā)熱、消化道癥狀、血小板減少、白細胞減少、肝腎功能損害，部分患者有出血表現(xiàn)。該病主要發(fā)生在丘陵、山區(qū)，患者以成年農(nóng)民為主，部分患者被蜱叮咬過。發(fā)病的流行期為4-10月，流行高峰為5-7月，這也是蜱蟲活躍的時間段。同時經(jīng)過實驗室檢測，在200多位病人的血清標本中，發(fā)現(xiàn)70%左右病人有新布尼亞病毒感染的證據(jù)，就是分離到病毒、檢出了病毒的基因和/或抗體。這些患者來自湖北、河南、山東、江蘇、安徽和遼寧，一共6個省，分布很廣，中東部和東北部都有，這也提示新布尼亞病毒的傳播范圍可能很廣泛。
[0004]目前認為急性期病人血液可能有傳染性，已有部分證據(jù)表明該病可能人傳人。
[0005]作為自然疫源性疾病病原體以及該病的廣泛分布和傳染性，提示了境外也存在該病原體的可能性。發(fā)熱板血小板減少綜合征病毒作為我國自主發(fā)現(xiàn)的新發(fā)傳染病病原體，世界衛(wèi)生組織也對此高度關(guān)注，并在國內(nèi)啟動了《發(fā)熱伴血小板減少綜合征危險因素調(diào)查》等多個研究項目，并鼓勵開展中國周邊地區(qū)該病的監(jiān)測調(diào)查工作，口岸地區(qū)作為傳染病防控的重要節(jié)點和關(guān)口，開展蜱傳`新布尼亞病毒檢測、監(jiān)測等相關(guān)研究工作，可以提供未來該病國際傳播事件重要的科學(xué)依據(jù)。同時，也可能通過口岸截獲蜱媒、發(fā)熱人員等發(fā)現(xiàn)該病原體境外存在的證據(jù)。
[0006]SFTSV為我國最新發(fā)現(xiàn)并分離的病毒，國外未見相關(guān)病毒的報道，但不能排除國外輸入病原的危險因素存在，國內(nèi)相關(guān)檢測試劑盒相對缺乏，常規(guī)的病毒分離技術(shù)和免疫學(xué)檢測技術(shù)，檢測分離鑒定又費時費力，可快速、靈敏、特異性檢測SFTSV的試劑盒還未見有商品化廣品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的主要目的是提供一組用于檢測新布尼亞病毒的核酸序列。
[0008]本發(fā)明還提供一種用于檢測新布尼亞病毒的實時熒光定量RT-PCR試劑盒及其檢測方法。
[0009]本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0010]一種用于RT-PCR檢測新布尼亞病毒的引物對，所述引物對的核苷酸序列如SEQ IDN0.1 和 SEQ ID N0.2 所示。[0011]—組用于檢測新布尼亞病毒的實時突光定量RT-PCR核酸,該組核酸包括引物對、探針和作為陽性對照的擴增產(chǎn)物，所述引物對的核苷酸序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，所述探針的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，所述作為陽性對照的擴增產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
[0012]一種用于檢測新布尼亞病毒的實時熒光RT-PCR的試劑盒，該試劑盒包括:
[0013]2 X RT-PCR 緩沖液；
[0014]25 X RT-PCRenzymeMix ；
[0015]上游引物:核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；
[0016]下游引物:核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；
[0017]探針:核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，所述探針5丨端連接熒光基團，3丨端連接熒光淬滅基團；
[0018]陰性對照:無核酸酶滅菌超純水；
[0019]陽性對照:攜帶有擴增產(chǎn)物的質(zhì)粒DNA，所述擴增產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQ IDN0.4所示。 [0020]如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，所述2 X RT-PCR緩沖液為2 X One-step RT-PCRbuffer。
[0021]如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，所述探針與熒光基團相連，所述熒光基團為FAM、CY3中任——種，所述淬滅基團為BHQl、TAMARA、BHQ2中任——種。
[0022]如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，在應(yīng)用該試劑盒時，按照以下終濃度配置實時熒光定量PCR反應(yīng)液:
[0023]I XRT-PCR buffer ；
[0024]I X RT-PCRenzymeMix ；
[0025]0.8 μ mol/L 上游引物；
[0026]0.8 μ mol/L 下游引物；
[0027]0.12 μ mol/L 探針。
[0028]利用上述實時熒光定量RT-PCR試劑盒檢測新布尼亞病毒擴增條件可采用:反應(yīng)條件為逆轉(zhuǎn)錄 45°C，25min, 95°C，IOmin,然后 95°C，15sec 和 45°C，45sec 反應(yīng) 40 個循環(huán)。
[0029]本發(fā)明的有益效果在于:
[0030]本發(fā)明建立了比較高效、靈敏的新布尼亞病毒的快速檢測方法，提供實時熒光RT-PCR檢測試劑盒。提供的檢測試劑盒使用方便，操作簡便，自動化程度高，有效替代傳統(tǒng)PCR利用電泳觀察結(jié)果，且試劑盒所用的試劑少，大大簡化了操作過程，減少了在操作過程的污染，檢測效果好，特異性強，靈敏度高。
[0031]本發(fā)明的試劑盒和方法適用于蜱傳新布尼亞病毒檢測、監(jiān)測等相關(guān)研究工作和對蜱媒、發(fā)熱人員等的新布尼亞病毒篩查與檢測。針對出入境檢驗檢疫的特點研究各口岸蜱傳新布尼亞病毒的分布及輸入輸出情況。開展蜱傳新布尼亞病毒檢測、監(jiān)測等相關(guān)研究工作，可以提供未來該病國際傳播事件重要的科學(xué)依據(jù)。同時，也可能通過口岸截獲蜱媒、發(fā)熱人員等發(fā)現(xiàn)該病原體境外存在的證據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】[0032]圖1本發(fā)明試劑盒實時熒光定量PCR靈敏度的檢測結(jié)果。
[0033]圖2本發(fā)明試劑盒實時熒光定量PCR的標準曲線。
[0034]圖3本發(fā)明試劑盒實時熒光定量PCR的特異性檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0035]以下結(jié)合具體實例對本發(fā)明做進一步詳細說明，并非對本發(fā)明的限定，本發(fā)明的實施上方式并不限于此，因此凡依照本公開內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0036]實施例1檢測新布尼亞病毒引物設(shè)計
[0037]在本發(fā)明引物和探針設(shè)計中，篩選的新布尼亞病毒是NCBI公布的所有新布尼亞病毒S基因全長序列，利用DNASTAR軟件進行序列的同源性比對。首先在比對的序列保守區(qū)設(shè)計上下游引物，根據(jù)引物設(shè)計原理，在保守區(qū)之間設(shè)計上游和下游引物及探針，并提交GENEBANK檢測探針的特異性。引物和探針在合成時探針Y端連接FAM熒光基團和:^端連接BHQl淬滅基團。設(shè)計的引物和探針的序列見表1。
[0038]表1引物和探針序列
[0039]
【權(quán)利要求】
1.一種用于RT-PCR檢測新布尼亞病毒的引物對，其特征在于，所述引物對的核苷酸序列如 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 所示。
2.一組用于檢測新布尼亞病毒的實時熒光定量RT-PCR核酸，其特征在于，該組核酸包括引物對、探針和作為陽性對照的擴增產(chǎn)物，所述引物對的核苷酸序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，所述探針的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，所述作為陽性對照的擴增產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
3.一種用于檢測新布尼亞病毒的實時熒光RT-PCR的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括: . 2X RT-PCR緩沖液； . 25 X RT-PCRenzymeMix ； 上游引物:核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示； 下游引物:核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示； 探針:核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，所述探針5 ^端連接熒光基團，3 ^端連接淬滅基團； 陰性對照:無核酸酶滅菌超純水； 陽性對照:攜帶有擴增產(chǎn)物的質(zhì)粒DNA，所述擴增產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述2XRT-PCR緩沖液為2XOne-stepRT-PCR buffer。
5.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光基團為FAM、CY3中任一一種，所述淬滅基團為BHQl、TAMARA、BHQ2中任——種。
6.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，在應(yīng)用該試劑盒時，按照以下終濃度配置實時熒光定量PCR反應(yīng)液:
IXRT-PCR buffer ；
I XRT-PCRenzymeMix ； . 0.8ymol/L上游引物； . 0.8ymol/L下游引物； . 0.12ymol/L 探針。
【文檔編號】C12Q1/70GK103602762SQ201310652622
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年12月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月5日
【發(fā)明者】張麗萍, 馬雪征, 甄維, 劉麗娟, 胡孔新 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院