一種定量檢測(cè)土壤中活體大豆疫霉菌游動(dòng)孢子的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種定量檢測(cè)土壤中活體大豆疫霉菌游動(dòng)孢子數(shù)量的方法。本發(fā)明所提供的定量檢測(cè)土壤中活體大豆疫霉菌游動(dòng)孢子數(shù)量的方法是基于葉碟誘捕法的創(chuàng)新性定量方法。通過(guò)對(duì)待測(cè)土壤樣品、土壤懸浮液濃度、葉碟大小及其數(shù)量和培養(yǎng)皿大小、培養(yǎng)時(shí)間的嚴(yán)格定量，依據(jù)活體大豆疫霉菌游動(dòng)孢子對(duì)大豆葉碟的趨化性和顯微鏡下大豆疫霉菌游動(dòng)孢子獨(dú)特的形態(tài)特征，實(shí)現(xiàn)對(duì)土壤中活體大豆疫霉菌游動(dòng)孢子數(shù)量的定量檢測(cè)。本發(fā)明方法適合定量檢測(cè)大豆易發(fā)病季節(jié)新鮮土壤中的活體大豆疫霉菌游動(dòng)孢子數(shù)量，適合推廣應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】一種定量檢測(cè)土壤中活體大豆疫霉菌游動(dòng)孢子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及了一種土壤中活體大豆疫霉菌iphytophthora sojae)游動(dòng)孢子的定量檢測(cè)方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]大豆疫霉菌sojaeKaufmann & Gerdemann)是引起大豆疫病的病原菌。大豆疫病是公認(rèn)的世界性大豆病害，由于其危害面積大、程度重，被列為大豆毀滅性
病害之一。
[0003]大豆疫霉菌以卵孢子在土壤中越冬(Schmitthenner, 1985)。越冬后的卵孢子在土壤潮濕、土溫適宜的環(huán)境中，便萌發(fā)產(chǎn)生孢子囊，釋放出游動(dòng)孢子，侵染大豆根系。土壤溫、濕度適宜條件下，病株的患病部位可重復(fù)產(chǎn)生游動(dòng)孢子，反復(fù)多次地進(jìn)行再侵染。顯然，大豆疫霉菌的游動(dòng)孢子是直接接種體，因此，檢測(cè)土壤中游動(dòng)孢子的數(shù)量可為預(yù)測(cè)該病提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
[0004]葉碟誘捕法是國(guó)際通用的分離土壤中大豆疫霉菌的主要手段(Canaday等，1982 ；朱振東等，2003 ;王子迎等，2005)，但目前的該方法只能從含有大豆疫霉菌的土壤中分離出大豆疫霉菌，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)土壤中游動(dòng)孢子數(shù)量的準(zhǔn)確定量，因而無(wú)法滿足大豆疫霉菌土壤生態(tài)學(xué)和病害流行學(xué)的定量研究目的。
[0005]目前許多基于DNA分子 的檢測(cè)技術(shù)使得快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)疫霉菌成為可能(Cookeet al.，2007)，但還存在很多問(wèn)題:很難將PCR產(chǎn)物與樣品中靶標(biāo)菌的游動(dòng)孢子數(shù)量聯(lián)系起來(lái)，因?yàn)榘袠?biāo)菌的所有菌態(tài)均會(huì)被檢測(cè)到，同時(shí)靶標(biāo)菌的死細(xì)胞也會(huì)被檢測(cè)出來(lái)。因此，目前的基于DNA分子的PCR檢測(cè)技術(shù)也無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)土壤中游動(dòng)孢子數(shù)量的準(zhǔn)確定量，因而無(wú)法滿足大豆疫霉菌土壤生態(tài)學(xué)和病害流行學(xué)的定量研究目的。
[0006]大豆疫霉菌的土壤生態(tài)學(xué)和流行學(xué)研究需要對(duì)不同土壤生態(tài)環(huán)境下的活體大豆疫霉菌游動(dòng)孢子數(shù)量進(jìn)行比較。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種定量檢測(cè)土壤中活體大豆疫霉菌游動(dòng)孢子的方法，供土壤中大豆疫霉菌生態(tài)學(xué)和流行學(xué)研究過(guò)程中游動(dòng)孢子定量檢測(cè)之用。
[0008]本發(fā)明提供的技術(shù)方案是:模擬田間大豆疫霉菌游動(dòng)孢子的自然存在狀態(tài)，將一定數(shù)量的游動(dòng)孢子(實(shí)際值)接種到一定量的土壤懸浮液中，然后測(cè)定在土壤干擾條件下游動(dòng)孢子的數(shù)量(測(cè)定值)。用5個(gè)游動(dòng)孢子濃度建立測(cè)定值與實(shí)際值之間的回歸方程，用另外5個(gè)游動(dòng)孢子濃度對(duì)方程進(jìn)行驗(yàn)證。
[0009]本發(fā)明的方法是:取5克待測(cè)土樣，研磨，過(guò)Imm篩，放入直徑6 cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，加10 ml無(wú)菌水充分混勻制成土壤懸浮液。靜置2 h后,將18片大豆感病品種‘Sloan’的葉碟(直徑10 mm)漂浮在液面上，25°C下誘捕2 h。于顯微鏡下計(jì)數(shù)所有18片葉碟邊緣誘捕到的游動(dòng)孢子數(shù)量X，代入公式y(tǒng)=1776.6e°-0099x中，即可計(jì)算出IOml 土壤懸浮液中實(shí)際存在的游動(dòng)孢子數(shù)量y。
[0010]應(yīng)用本發(fā)明可以定量檢測(cè)土壤中活體大豆疫霉菌游動(dòng)孢子的數(shù)量。本發(fā)明方法是一種檢測(cè)手段。
[0011]應(yīng)用本發(fā)明得出的公式以及所述的方法，可以定量檢測(cè)出大豆易發(fā)病季節(jié)新鮮土樣中的大豆疫霉菌游動(dòng)孢子數(shù)量。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1誘捕2h后葉碟邊緣誘捕到的大豆疫霉菌游動(dòng)孢子
圖2 18片葉碟誘捕到的游動(dòng)孢子數(shù)量與IOml 土壤懸浮液中實(shí)際存在的游動(dòng)孢子數(shù)量之間的關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面通過(guò)【具體實(shí)施方式】的詳細(xì)描述來(lái)進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但并不是對(duì)本發(fā)明的限制，僅僅做示例說(shuō)明。
[0014]實(shí)施例
病原菌:大豆疫霉菌菌株Eps597-3。
[0015]大豆品種:感病品種‘Sloan’，不含任何已知抗疫霉根腐病基因，種植后長(zhǎng)出的葉片用于制備葉碟。
[0016]游動(dòng)孢子懸浮液的制備方法:
將保存的Eps597-3轉(zhuǎn)移至CA (1000 ml無(wú)菌水中加200 g胡蘿卜汁，20 g瓊脂)平板上活化培養(yǎng)3-4 d。切取5-8塊菌餅(直徑8 mm)放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加滅菌蒸餾水直至剛好沒(méi)過(guò)菌餅表面。室溫下，每30min換一次水，換水4-5次后，放入4°C冰箱中，40min后取出，放在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上靜止3h后，即可產(chǎn)生大量的游動(dòng)孢子。移除菌餅，將游動(dòng)孢子懸液倒入錐形瓶中用力震蕩，迅速用微量進(jìn)樣器吸取10 μ 1，于4X 10倍視野下鏡檢游動(dòng)孢子數(shù)。觀察10次取平均值('X )，計(jì)算每毫升中的游動(dòng)孢子量(100 Χ'χ)。用此方法分別配制不同濃度的游動(dòng)孢子懸浮液。
[0017]將5g研磨并通過(guò)Imm篩網(wǎng)的滅菌干土均勻混入10 ml不同濃度(200,400,600,800，1000個(gè)游動(dòng)孢子/ml)的游動(dòng)孢子懸浮液中，靜置2h。將18片大豆感病品種‘Sloan’的葉碟(直徑10 mm)漂浮在液面上，25°C下誘捕2 h。顯微鏡下計(jì)數(shù)所有18片葉碟邊緣誘捕到的游動(dòng)孢子數(shù)量。每個(gè)處理3次重復(fù)，取平均值。用SPSS17.0數(shù)據(jù)處理軟件建立18片葉碟誘捕到的游動(dòng)孢子數(shù)量(測(cè)定值)與IOml 土壤懸浮液中的游動(dòng)孢子總量(實(shí)際值)之間的回歸方程。用含有3000、5000、7000、9000、12000個(gè)游動(dòng)孢子的懸浮液對(duì)回歸方程進(jìn)行驗(yàn)證。
[0018]結(jié)果表明:
葉碟誘捕2h后游動(dòng)孢子便可在葉碟邊緣休止、萌發(fā)產(chǎn)生芽管并侵染葉碟。正在侵染葉碟的游動(dòng)孢子在顯微鏡下清晰可見(jiàn)并可計(jì)數(shù)(圖1)。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著土壤懸浮液中游動(dòng)孢子濃度的增加，葉碟誘捕到的游動(dòng)孢子數(shù)量也逐漸增加(表1)。18片葉碟誘捕到的游動(dòng)孢子數(shù)量與IOml 土壤懸浮液中實(shí)際存在的游動(dòng)孢子數(shù)量之間的關(guān)系符合指數(shù)回歸方程y=1776.6e°_°°99x，R2~0.99 (圖2)。其中x為18片葉碟誘捕到的游動(dòng)孢子數(shù)量，y為IOml 土壤懸浮液中實(shí)際存在的游動(dòng)孢子數(shù)量。
[0019]為了驗(yàn)證該回歸方程，對(duì)含有3000，5000, 7000, 9000和12000個(gè)游動(dòng)孢子的IOml懸浮液分別進(jìn)行了測(cè)定和方程式計(jì)算。測(cè)定值依次為58.33,105.33,141.67,164.67和194.33個(gè)游動(dòng)孢子，而通過(guò)回歸方程計(jì)算得出的值依次為3165.05,5040.31,7222.74、9069.66和12165.07個(gè)游動(dòng)孢子，計(jì)算值與實(shí)際值之間的偏差在0.77%_3.18%范圍內(nèi)，證明該指數(shù)回歸方程可用。
[0020]表1 18片葉碟誘捕到的游動(dòng)孢子數(shù)量與IOml 土壤懸浮液中實(shí)際存在的游動(dòng)孢子
數(shù)量之間的關(guān)系_
【權(quán)利要求】
1.一種定量檢測(cè)土壤中活體大豆疫霉菌游動(dòng)孢子的方法，是將土壤制成懸浮液，將不含任何已知抗病基因的感病大豆品種‘Sloan’的葉碟漂浮在液面上，誘捕其中的大豆疫霉菌游動(dòng)孢子，依據(jù)葉碟邊緣誘捕到的大豆疫霉菌游動(dòng)孢子數(shù)量，代入公式y(tǒng)=1776.6e°-0099x中進(jìn)行計(jì)算。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:公式y(tǒng)=1776.Bea 0099x是用于定量檢測(cè)大豆易發(fā)病季節(jié)新鮮土壤中的活體大豆疫霉菌游動(dòng)孢子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述公式y(tǒng)=1776.Bea 0099x中的x為18片葉碟邊緣誘捕到的游動(dòng)孢子數(shù)量，y為IOml 土壤懸浮液中實(shí)際存在的游動(dòng)孢子數(shù)量。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3所述的任一方法，其特征在于:使用公式y(tǒng)=1776.Bea 0099x的具體做法是:取5克大豆易發(fā)病季節(jié)的新鮮待測(cè)土樣，研磨，過(guò)Imm篩，放入直徑6 cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，加10 ml無(wú)囷水充分混勾制成土壤懸浮液；靜直2 h后,將18片大?感病品種‘Sloan’的葉碟(直徑10 mm)漂浮在液面上，25°C下誘捕2 h ;于顯微鏡下計(jì)數(shù)所有18片葉碟邊緣誘捕到的游動(dòng)孢子數(shù)量X，代入公式y(tǒng)=1776.6e°-0099x中，即可計(jì)算出IOml 土壤懸浮液中實(shí)際存在的游動(dòng)孢子數(shù)量I。
5.權(quán)利要求1-4任一所述方法在定量檢測(cè)大豆易發(fā)病季節(jié)新鮮土壤中活體大豆疫霉菌游動(dòng)孢子中的應(yīng)用 。
【文檔編號(hào)】C12Q1/06GK103820523SQ201310667917
【公開日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】文景芝, 田苗, 李永剛, 肖彩霞, 所冰 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)