一種液氮技術(shù)制備發(fā)酵劑的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種液氮技術(shù)制備發(fā)酵劑的方法，其包括步驟：(1)分別對(duì)單個(gè)菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；(2)從步驟（1）中擴(kuò)大培養(yǎng)所得的菌體培養(yǎng)液中收集菌體；(3)將步驟（2）所得的菌體在菌體保護(hù)液中重新懸浮并混合均勻，得到單菌懸浮液；(4)將多種步驟（3）中所得的單菌懸浮液按照多種菌體混合的要求混合均勻，得到多菌懸浮液；(5)將步驟（4）所得的多菌懸浮液滴入液氮中，得到顆粒，所述的液氮的液層高度為50-200mm；(6)將步驟（5）所得的顆粒進(jìn)行篩選，即得發(fā)酵劑。本發(fā)明提供的方法具有批次間產(chǎn)品性能更穩(wěn)定，使用更方便，制備工藝較為簡(jiǎn)便，且獲得的發(fā)酵劑顆粒均勻、外形較佳等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種液氮技術(shù)制備發(fā)酵劑的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品工業(yè)領(lǐng)域，特別涉及一種液氮技術(shù)制備發(fā)酵劑的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]對(duì)于酸奶制作的研究，從最初的開始使用天然的混合菌株制備酸奶等乳制品，到篩選出性狀優(yōu)良的發(fā)酵菌種制備純菌種液體發(fā)酵劑，再發(fā)展到現(xiàn)在易于保藏和運(yùn)輸?shù)母咝龈芍蓖妒桨l(fā)酵劑的出現(xiàn)，標(biāo)志著酸奶發(fā)酵劑研究的三個(gè)時(shí)代的更替。歐美許多國(guó)家在20世紀(jì)初就已經(jīng)開始對(duì)發(fā)酵劑進(jìn)行研究，
[0003]至今在發(fā)酵劑的領(lǐng)域中已取得舉世矚目的成就，濃縮發(fā)酵劑已實(shí)現(xiàn)了專業(yè)化、商品化生產(chǎn)，并成功的應(yīng)用于發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)以及保健型乳酸菌制劑的研制，涌現(xiàn)出一批知名的實(shí)力強(qiáng)勁的發(fā)酵劑制造商，如丹麥的科漢森公司和法國(guó)的羅地亞公司等。最初研制成的是冷凍濃縮乳酸菌發(fā)酵劑，即將乳酸菌通過濃縮培養(yǎng)、離心收集等手段制成高濃度菌體的濃縮型菌懸液，添加抗凍保護(hù)劑后在低于_70°C的低溫條件下速凍，再置于低溫下深凍保藏而成。
[0004]伴隨真空冷凍干燥技術(shù)的日益成熟，在九十年代初，又相繼開發(fā)出了濃縮型的真空凍干發(fā)酵劑，即將凍結(jié)后的濃縮菌懸液通過添加凍干保護(hù)劑，在真空低溫的條件下將水分升華干燥，制成干燥粉末狀的固體發(fā)酵劑，也叫直投式發(fā)酵劑(DirectvatsetjVS)。這種發(fā)酵劑具有較多優(yōu)點(diǎn):菌種活力強(qiáng)，濃度高，菌數(shù)能高達(dá)IOltl~1012cfu/g、發(fā)酵性能穩(wěn)定、生產(chǎn)工藝易于控制，生長(zhǎng)周期較短、保藏方便、在4°C常壓保藏I年以上仍然具有很強(qiáng)的活力、體積較小，運(yùn)輸方便等等。因此隨著直投式發(fā)酵劑的出現(xiàn)，酸奶產(chǎn)業(yè)得到了進(jìn)一步的加速發(fā)展越來越多的發(fā)酵乳生產(chǎn)廠家開始使用濃縮型凍干發(fā)酵劑，其中也包括國(guó)內(nèi)大多數(shù)大規(guī)模的乳制品公司；而我國(guó)由于起步較晚，研究水平還與西方國(guó)家有一定的差距，但隨著國(guó)內(nèi)乳制品市場(chǎng)需求量逐年增長(zhǎng)，`許多科研部門和高校實(shí)驗(yàn)室都開始加緊對(duì)乳品發(fā)酵劑的研究和生產(chǎn)，并取得了一定的進(jìn)展。
[0005]發(fā)酵劑中的性狀優(yōu)異的乳酸菌菌種是制備高品質(zhì)酸奶的關(guān)鍵，保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)是發(fā)酵劑中的常用菌種。隨著對(duì)酸奶益生作用的越來越重視和對(duì)乳酸菌菌種研究的深入，嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)和雙歧桿菌(Bifidobacterium)也越來越多的應(yīng)用在酸奶發(fā)酵劑中。另有一些益生菌發(fā)酵乳制品已經(jīng)成功的推向市場(chǎng)。如芬蘭Valio公司開發(fā)的L.GG，法國(guó)達(dá)能公司開發(fā)的L.casei Immunitas,法國(guó)羅地亞公司開發(fā)的L.acidophilus NCFM,日本Yakult公司開發(fā)的L.casei Shirota,丹麥漢森公司的L.acidophilusLA-Ι和LA-2,光明乳業(yè)股份有限公司的具降高血壓功能的Lactobacillus casei LC2W (EP1642963B1 )、降血脂功能的Lactobacillus casei BD-1I (US Patent7270994),降血清膽固醇功能的 LactobacillusPlantarum ST-1II (ZL200410066891.7、ZL03116377.7)等。
[0006]全球益生菌市場(chǎng)年增長(zhǎng)率達(dá)9%，中國(guó)地區(qū)銷售額達(dá)到50億歐元，占全球市場(chǎng)份額的四分之一。但我國(guó)發(fā)酵乳制品行業(yè)直投式發(fā)酵劑市場(chǎng)長(zhǎng)期為國(guó)外發(fā)酵劑公司所壟斷，益生菌發(fā)酵劑市場(chǎng)更是為國(guó)外公司所完全占有。
[0007]另外，真空冷凍干燥發(fā)酵劑具有活菌含量高、易保存管理、更強(qiáng)的穩(wěn)定性和乳酸菌活力的特點(diǎn)，可直投式使用，是當(dāng)今發(fā)酵劑的主要產(chǎn)品形式。但是，由于在凍干過程對(duì)菌體產(chǎn)生損傷，且能耗較大等因素，凍干菌粉菌株存在復(fù)活時(shí)間較長(zhǎng)和成本較高的弊端，對(duì)于發(fā)酵劑制備需要尋求一種菌體受損傷較小的試驗(yàn)方法和工藝，來優(yōu)化完善直投式發(fā)酵劑的工業(yè)制備。使用液氮冷凍濃縮造粒，發(fā)酵劑制備工藝方面較冷凍干燥技術(shù)簡(jiǎn)單方便，且耗時(shí)較短，制備的發(fā)酵劑均復(fù)水性較佳，結(jié)構(gòu)較為均勻；在菌體存活率方面，使用保護(hù)液制備的液氮菌粒較凍干菌粉有顯著優(yōu)勢(shì)，能夠避免凍干過程中對(duì)菌體的損傷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供一種新的液氮技術(shù)制備多聯(lián)發(fā)酵劑的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。
[0009]本發(fā)明中，所述的制備方法優(yōu)化了液氮技術(shù)制備多聯(lián)發(fā)酵劑的方法，保證制備的發(fā)酵劑的乳酸菌有較高存活率，制備工藝較為簡(jiǎn)便，且獲得的發(fā)酵劑顆粒均勻、外形較佳，有利于改善國(guó)內(nèi)發(fā)酵劑市場(chǎng)同質(zhì)化現(xiàn)象。
[0010]本發(fā)明提供的技術(shù)方案是:一種如前所述的液氮技術(shù)制備多聯(lián)發(fā)酵劑的方法，所述的制備方法包括如下步驟:
[0011](I)分別對(duì)單個(gè)菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；
[0012](2)從步驟(1)中擴(kuò)大培養(yǎng)所得的菌體培養(yǎng)液中收集菌體；
[0013](3)將步驟(2)所得的菌體在菌體保護(hù)液中重新懸浮并混合均勻，得到單菌懸浮液；
[0014](4)將多種步驟(3)中所得的單菌懸浮液按照多種菌體混合的要求混合均勻，得到多菌懸浮液；
[0015](5)將步驟(4)所得的多菌懸浮液滴入液氮中，得到顆粒，所述的液氮的液層高度為 50-200mm ；
[0016](6)將步驟(5)所得的顆粒進(jìn)行篩選，即得發(fā)酵劑。
[0017]本發(fā)明中，步驟(1)為分別對(duì)單個(gè)菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。本發(fā)明中，所述的擴(kuò)大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。本發(fā)明中，步驟(1)所述的擴(kuò)大培養(yǎng)為本領(lǐng)域常規(guī)，較佳地，擴(kuò)大培養(yǎng)一到四次，最佳地，擴(kuò)大培養(yǎng)三次。較佳的，按本領(lǐng)域常規(guī)，菌種經(jīng)過復(fù)蘇后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。所述的復(fù)蘇是指通過菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)，將處于休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入無菌培養(yǎng)基活化后，最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種微生物。所述的復(fù)蘇的方式是本領(lǐng)域常規(guī)方法。本發(fā)明中所述的復(fù)蘇和擴(kuò)大培養(yǎng)中涉及到的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、pH、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間等均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)乳酸菌的試驗(yàn)參數(shù)。本發(fā)明中所述的菌種是指發(fā)酵過程中作為活細(xì)胞催化物的微生物。所述的菌種較佳的為本領(lǐng)域常規(guī)的乳酸菌菌種，更佳地包括保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)和一種或幾種益生菌,所述的益生菌為雙歧桿菌(Bifidobacterium)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) ST-1II。[0018]本發(fā)明中，步驟(2)是從步驟(1)中擴(kuò)大培養(yǎng)所得的菌體培養(yǎng)液中收集菌體。其中，所述的收集菌體的方法是常規(guī)的，將步驟(1)中擴(kuò)大培養(yǎng)所得的菌體培養(yǎng)液進(jìn)行固液分離即可，一般包括過濾，低溫離心等；較佳地，本發(fā)明中采用低溫離心方法并回收沉淀。較佳地，離心條件為2000g~12000g，最佳地，離心條件為5000g ;較佳的，離心時(shí)間為5~15min,最佳地,離心時(shí)間為lOmin。
[0019]本發(fā)明中，步驟(3)是將步驟(2)所得的菌體在菌體保護(hù)液中重新懸浮并混合均勻，得到單菌懸浮液。其中，所述的菌體保護(hù)液為本領(lǐng)域常規(guī)，是一種減少滲透壓、或者液體環(huán)境中其他不利于菌體存活因素的影響的保護(hù)液體。所述菌體保護(hù)液較佳地包括10%~15%脫脂乳、1.0%~2.0%蔗糖、1.0%~2.0%海藻糖、0.1%~0.5%甘油、0.05%~0.15%檸檬酸鈉和0.05%~0.15%單谷氨酸鈉，所述的百分比為質(zhì)量百分比。更佳的所述菌體保護(hù)液包括12%脫脂乳，1.5%蔗糖、1.5%海藻糖，0.2%甘油，0.1%檸檬酸鈉和0.1%單谷氨酸鈉，所述的百分比為質(zhì)量百分比。所述的菌體保護(hù)液與菌體(濕菌泥)混合比例I~20mL/g，更佳為 10-20mL/g,最佳為 10mL/g。
[0020]本發(fā)明中，步驟(4)是將多種步驟(3)中所得的單菌懸浮液按照多種菌體混合的要求混合均勻，得到多菌懸浮液。其中，所述的單菌懸浮液包括多種菌種，較佳的包括多種常規(guī)的乳酸菌菌種，更加的包括保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)和一種或幾種其他益生菌。較佳地，嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)和保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)數(shù)量混合比例為1:1~10:1，發(fā)酵乳中嗜熱鏈球菌總數(shù)與保加利亞乳桿菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌ST-1II總數(shù)的比例為1:1~1000:1，每株益生菌與保加利亞乳桿菌數(shù)量混合比例為1:1~10:1。
[0021]本發(fā)明中，步驟(5)是將步驟(4)所得的多菌懸浮液滴入液氮中，得到顆粒。步驟
(6)是將步驟(5)中的發(fā)酵劑顆粒進(jìn)行篩選，篩選出顆粒均勻、圓潤(rùn)、粒徑大小近似的發(fā)酵劑顆粒。其中，所述的發(fā)酵劑顆粒為一種用于酸奶、酸牛乳酒、奶油、干酪和其他發(fā)酵產(chǎn)品生產(chǎn)的細(xì)菌以及其他微生物培養(yǎng)物的固體顆粒。較佳的，步驟(5)和(6)中所述液氮的液層高度為50-200mm,最佳地,高度為100_150mm。以保證發(fā)酵劑在沉降過程中形成圓潤(rùn)、均勻顆粒，防止因液層過低造成發(fā)酵劑凝結(jié)成塊現(xiàn)象。較佳地，所述的菌體保護(hù)液滴入液氮的流速為500mL/min~1000mL/min,最佳地,流速為750mL/min。較佳的,所述的液氮槽的長(zhǎng)度為500~10000mm，寬度W為100~1000mm，高度H為100~400_。更佳的，長(zhǎng)度為500_，寬度W為100mm，高度H為180mm。較佳地，步驟(5)和步驟(6)在以下所述的液氮深冷造粒設(shè)備中完成:
[0022]所述液氮深冷造粒包括:
[0023]一密封腔體；
[0024]一液體噴淋設(shè)備，設(shè)置于所述密封腔體頂部；
[0025]一液氮槽，包括第一端部和第二端部，其中第一端部設(shè)置于所述液體噴淋設(shè)備下方，所述液氮槽的底板傾角Θ為1°~30° ;
[0026]一大孔徑篩網(wǎng)，設(shè)置在所述液氮槽下方，將液氮槽第二端部滑落下來的顆粒篩分；
[0027]一小孔徑篩網(wǎng)，設(shè)置在所述大孔徑篩網(wǎng)下方，將從大孔徑篩網(wǎng)漏下的顆粒再次篩分；
[0028]一小顆粒廢料收集器，設(shè)置在小孔徑篩網(wǎng)下方，收集從小孔徑篩網(wǎng)漏下的顆粒；和
[0029]一液氮緩存罐，設(shè)置在所述液氮槽下方，用于儲(chǔ)存未氣化的液氮。
[0030]較佳的，所述的設(shè)備還包括:一小顆粒廢料接收槽12，存放從小顆粒廢料收集器收集的顆粒；一發(fā)酵劑終產(chǎn)品接收槽11，收集保留在小孔徑篩網(wǎng)上的顆粒；一大顆粒廢料接收槽10，收集保留在大孔徑篩網(wǎng)上的顆粒。
[0031]較佳的，所述密封腔體設(shè)有真空保溫夾層，頂部還包括一出氣管路3。
[0032]較佳的，所述液氮緩存罐與一液氮泵連接，所述液氮泵通過管路將液氮輸送到所述液氮槽的第一端部。
[0033]其中，較佳的，液體噴淋設(shè)備的噴料口為矩形，設(shè)有多個(gè)出料口，最佳的共設(shè)有50個(gè)出料口。較佳的，出料口內(nèi)徑2-3mm，相鄰兩個(gè)出料口之間間距20mm。以保證發(fā)酵劑顆粒制備效率，且防止生產(chǎn)中不同出料口滴出的菌液相互干擾造成對(duì)發(fā)酵劑顆粒外形的影響。
[0034]其中，較佳的，所述的液體噴淋設(shè)備上部的液體流經(jīng)管道規(guī)格Φ30πιπι。
[0035]其中,較佳的,所述的大、小孔徑篩網(wǎng)的篩孔直徑為更佳為5-7mm。最佳地，大孔篩網(wǎng)和小孔篩網(wǎng)的篩孔直徑分別為:Φ7_、Φ4_。本發(fā)明設(shè)置兩種不同孔徑的篩網(wǎng)，將所得的發(fā)酵劑顆粒進(jìn)行篩選。通過篩網(wǎng)震蕩，對(duì)制備后的發(fā)酵劑顆粒進(jìn)行篩選。通過分級(jí)篩選，最終通過發(fā)酵劑終產(chǎn)品接收槽得到粒徑近似的發(fā)酵劑顆粒。
[0036]本發(fā)明所得的發(fā)酵劑顆粒進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，檢測(cè)發(fā)酵劑顆粒中所含活菌數(shù)。較佳地，發(fā)酵劑顆粒活菌數(shù)為1.0X 101°~9.9X 10ncfU/mL，并將符合產(chǎn)品需求的發(fā)酵劑顆粒置于超低溫冰箱或者液氮中進(jìn)行保存。
[0037]在不違背本領(lǐng)域常識(shí)的`基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。
[0038]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0039]本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于:
[0040]1、本發(fā)明提供的生產(chǎn)多聯(lián)乳酸菌發(fā)酵劑的方法與未經(jīng)優(yōu)化前的工藝相比，具有批次間產(chǎn)品性能更穩(wěn)定，使用更方便，制備工藝較為簡(jiǎn)便，且獲得的發(fā)酵劑顆粒均勻、外形較佳等優(yōu)點(diǎn)。
[0041]2、本發(fā)明中發(fā)酵乳多聯(lián)乳酸菌發(fā)酵劑的制備方法，采用發(fā)酵乳直投式發(fā)酵劑，除了含有保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)這兩種酸奶發(fā)酵所需的乳酸菌，并含有其他一株或幾株益生菌，有利于改善國(guó)內(nèi)發(fā)酵劑市場(chǎng)同質(zhì)化現(xiàn)象，應(yīng)用前景十分廣闊。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]以下結(jié)合【專利附圖】

【附圖說明】本發(fā)明的特征和有益效果。
[0043]圖1為液氮技術(shù)制備發(fā)酵劑顆粒優(yōu)化后設(shè)備示意圖。
[0044]1，液體噴淋設(shè)備；2，密封腔體；3，出氣管路；4，液氮槽；5，大孔徑篩網(wǎng)；6，小孔徑篩網(wǎng)；7，小顆粒廢料收集器；8，液氮泵；9，液氮緩存罐；10，大顆粒廢料接收槽；11，發(fā)酵劑終產(chǎn)品接收槽；12，小顆粒廢料接收槽。
[0045]圖2為液氮槽橫切圖。[0046]圖3為噴料口排列示意圖。圖3(A)為噴料口仰視圖。圖3(B)為噴料口側(cè)視圖。
[0047]圖4為液氮技術(shù)制備的發(fā)酵劑顆粒圖。圖A為設(shè)備優(yōu)化前發(fā)酵劑顆粒的圖片，圖B為設(shè)備優(yōu)化后發(fā)酵劑顆粒的圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0048]下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。
[0049]所用菌種的來源名稱規(guī)格為:
[0050]乳酸菌培養(yǎng)基:M17培養(yǎng)基，MRS培養(yǎng)基:德國(guó)Merck公司； [0051]保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)和雙歧桿菌(Bifidobacterium):丹麥科?漢森公司；
[0052]植物乳桿菌(Lactobacilluspi ant arum ST-1II, CGMCC N0.0847)均由光明乳業(yè)研究院發(fā)酵劑研究室篩選保藏。
[0053]其他原料和試劑均市售可得。
[0054]實(shí)施例1液氮技術(shù)制備發(fā)酵劑的設(shè)備
[0055]圖1是根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的結(jié)構(gòu)示意圖。在該實(shí)施例中，液氮深冷造粒設(shè)備包括:一密封腔體2 液體噴淋設(shè)備1，設(shè)置于所述密封腔體頂部；一液氮槽4，包括第一端部和第二端部，其中第一端部設(shè)置于所述液體噴淋設(shè)備下方，所述液氮槽的底板傾角Θ為1°~30° ;—大孔徑篩網(wǎng)5，設(shè)置在所述液氮槽下方，將液氮槽第二端部滑落下來的顆粒篩分；一小孔徑篩網(wǎng)6，設(shè)置在所述大孔徑篩網(wǎng)下方，將從大孔徑篩網(wǎng)漏下的顆粒再次篩分；一小顆粒廢料收集器7，設(shè)置在小孔徑篩網(wǎng)下方，收集從小孔徑篩網(wǎng)漏下的顆粒；一液氮緩存罐9，設(shè)置在所述液氮槽下方，用于儲(chǔ)存未氣化的液氮。
[0056]所述的液氮深冷造粒設(shè)備還可以包括:一小顆粒廢料接收槽12，存放從小顆粒廢料收集器收集的顆粒；一發(fā)酵劑終產(chǎn)品接收槽11，收集保留在小孔徑篩網(wǎng)上的顆粒；一大顆粒廢料接收槽10，收集保留在大孔徑篩網(wǎng)上的顆粒。所述密封腔體2可以設(shè)有真空保溫夾層，頂部可以包括一出氣管路3。所述液氮緩存罐可以與一液氮泵8連接，所述液氮泵通過管路將液氮輸送到所述液氮槽的第一端部。
[0057]其中，液氮槽橫切圖可見圖2。液氮槽4內(nèi)液氮層高度50_200mm，可以是100-150mm,以保證發(fā)酵劑在沉降過程中形成圓潤(rùn)、均勻顆粒，防止因液層過低造成發(fā)酵劑凝結(jié)成塊現(xiàn)象。所述的液氮槽的長(zhǎng)度可以為500~10000mm，寬度W可以為100~1000mm，高度H可以為100~400mm。長(zhǎng)度也可以為500mm，寬度W也可以為100mm，高度H也可以為180mmo
[0058]其中，所述的液體噴淋設(shè)備I可如圖3所示，其噴料口為矩形，設(shè)有多個(gè)出料口，可以共設(shè)有50個(gè)出料口 13。出料口內(nèi)徑可以是2-3mm，相鄰兩個(gè)出料口之間間距可以是20mm，以保證發(fā)酵劑顆粒制備效率，且防止生產(chǎn)中不同出料口滴出的菌液相互干擾造成對(duì)發(fā)酵劑顆粒外形的影響。
[0059]其中，所述的液體噴淋設(shè)備上部的液體流經(jīng)管道(送料管道，即噴料口前段管道)規(guī)格可以是Φ30_。
[0060]其中，所述的大、小孔徑篩網(wǎng)的直徑為可以為5_7mm。大、小孔徑篩網(wǎng)直徑可與分別為:Φ7πιπι、Φ4πιπι。本發(fā)明設(shè)置兩種不同孔徑的篩網(wǎng)，將所得的發(fā)酵劑顆粒進(jìn)行篩選。通過篩網(wǎng)震蕩，對(duì)制備后的發(fā)酵劑顆粒進(jìn)行篩選。通過分級(jí)篩選，最終通過發(fā)酵劑終產(chǎn)品接收槽11得到粒徑近似的發(fā)酵劑顆粒。
[0061]本發(fā)明中，將含有保護(hù)劑的重懸菌液通過液氮深冷造粒設(shè)備加入液氮中制備發(fā)酵劑顆粒。其中本發(fā)明對(duì)原有液氮技術(shù)制備發(fā)酵劑設(shè)備(專利號(hào):201210015940.9)進(jìn)行優(yōu)化，規(guī)定了液氮槽內(nèi)液氮層高、濃縮發(fā)酵液流速、噴料口形狀，并改進(jìn)物料傳送帶及其傳送方式。將原有物料傳送帶改裝兩個(gè)不同孔徑震蕩篩板，以上部件封閉在一個(gè)腔體內(nèi)。震蕩篩板下加裝三個(gè)物料接收槽，其中兩個(gè)為廢料接收槽，另一個(gè)為發(fā)酵劑終產(chǎn)品接收槽。其他部件及制備流程參考專利CN201210015940.9原有設(shè)備規(guī)定參數(shù)保持不變。 [0062]液氮深冷造粒設(shè)備可實(shí)現(xiàn)乳酸菌在高密度培養(yǎng)、菌體濃縮、凍干保護(hù)劑添加等發(fā)酵劑制備常規(guī)工序后，將重懸得到的濃縮菌體通過液體噴淋設(shè)備I迅速以液滴的形式噴至裝有一定傾角的液氮槽4中，瞬間實(shí)現(xiàn)乳酸菌的液氮深冷造粒；乳酸菌深冷發(fā)酵劑顆粒在液氮流沖擊和重力勢(shì)能作用下，順著液氮槽4滑落至大孔篩網(wǎng)5上，在篩網(wǎng)震蕩下，過篩落入小孔篩網(wǎng)6上，保留在小孔篩網(wǎng)上的顆粒即為發(fā)酵劑顆粒終產(chǎn)品，放入發(fā)酵劑顆粒終產(chǎn)品接收槽，接著進(jìn)行定量分裝；分裝好的乳酸菌發(fā)酵劑顆粒，迅速放置于-40~-80°C的冷柜中儲(chǔ)存。氣化液氮通過密封腔體頂部的出氣管路3直接排入室外，避免因室內(nèi)氮?dú)鉂舛冗^高所造成的人身傷害。
[0063]實(shí)施例2雙聯(lián)乳酸菌發(fā)酵劑
[0064]菌種組成及培養(yǎng)條件:
[0065]
―菌種I培養(yǎng)基_
嗜熱鏈球菌M17/脫脂乳
保加利亞乳桿菌 Imrs/脫脂乳
[0066]
[0067]制備方法包括下列步驟:
[0068]1、單個(gè)菌種擴(kuò)大培養(yǎng)
[0069](I)嗜熱鏈球菌
[0070]I)將斜面保存的嗜熱鏈球菌接種至IOmL的M17培養(yǎng)基中，42°C厭氧培養(yǎng)12h后得到的含有嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)菌株的M17培養(yǎng)基按2% (v/v)的接種量接種于500mL含有12% (wt)滅菌脫脂乳粉的水溶液中，進(jìn)行第1次擴(kuò)培，培養(yǎng)溫度42°C，培養(yǎng)時(shí)間10h。培養(yǎng)過程中，發(fā)酵罐均充入氮?dú)?，維持厭氧發(fā)酵，pH恒定在6.2 ；
[0071]2)將步驟I)得到的液體按2% (v/v)的接種于20L含有12% (wt)滅菌脫脂乳粉的水溶液中，進(jìn)行第2次擴(kuò)培，培養(yǎng)溫度42°C，培養(yǎng)時(shí)間8h。培養(yǎng)過程中，發(fā)酵罐均充入氮?dú)猓S持厭氧發(fā)酵，pH恒定在6.3 ；
[0072]3)將步驟2)得到的液體按5% (v/v)的接種量接入200L含有12% (wt)脫脂乳粉的滅菌水溶液中，進(jìn)行第3次擴(kuò)培，培養(yǎng)溫度42°C，培養(yǎng)時(shí)間6h。
[0073]培養(yǎng)過程中，發(fā)酵罐均充入氮?dú)猓S持厭氧發(fā)酵，pH恒定在6.5 ;
[0074](2)德氏乳桿菌保加利亞亞種[0075]4)將斜面保存的德氏乳桿菌保加利亞亞種接種至IOmL的MRS培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)12h后得到的含有德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株的MRS培養(yǎng)基按2% (v/v)的接種量接種于500mL含有12% (wt)滅菌脫脂乳粉的水溶液中，進(jìn)行第1次擴(kuò)培，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時(shí)間10h。培養(yǎng)過程中，發(fā)酵罐均充入氮?dú)?維持厭氧發(fā)酵，pH恒定在6.8 ；
[0076]5)將步驟4)得到的液體按2% (v/v)的接種量接種于20L含有12% (wt)滅菌脫脂乳粉的水溶液中，進(jìn)行第2次擴(kuò)培，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)時(shí)間8h。培養(yǎng)過程中，發(fā)酵罐均充入氮?dú)?，維持厭氧發(fā)酵，pH恒定在6.8 ；
[0077]2、菌體的收集
[0078]6)所使用菌體保護(hù)液由脫脂乳10%、蔗糖1.0%、海藻糖1.0%、甘油0.1%、檸檬酸鈉
0.05%、單谷氨酸鈉0.05%組成，所述的百分比為質(zhì)量百分比，使用無菌水溶解；
[0079]7)將步驟3)得到的液體采用低溫離心機(jī)，進(jìn)行2000g，15min的離心，收集菌泥，用菌種保護(hù)液按10mL/g進(jìn)行重懸，并攪拌均勻；
[0080]8)將步驟5)得到的液體采用低溫離心機(jī)，進(jìn)行2000g，15min的離心，收集菌泥，用菌種保護(hù)液按10mL/g進(jìn)行重懸，并攪拌均勻；
[0081]3、多種單一菌體重懸液混合
[0082]9)將步驟7)和步驟8)得到的菌懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)；
[0083]10)將步驟7)和步驟8)得到的菌懸液按照嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus):德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)數(shù)量比例為10:1,進(jìn)行混合,得到多菌懸浮液；
[0084]4、利用液氮制備發(fā)酵劑顆粒
[0085]11)將步驟10)得到的多菌懸浮液在液氮制備發(fā)酵劑設(shè)備(實(shí)施例1所示)上，通過送料管道(內(nèi)徑尺寸Φ30πιπι)以500mL/min流速，通過出料口 I (噴料口為矩形，設(shè)有50個(gè)出料口 ；出料口內(nèi)徑2mm，相鄰兩個(gè)出料口之間間距20mm)滴出；
[0086]12)多菌懸浮液通過出料口 I滴入液氮槽內(nèi)4，其中液氮液層高50mm ;液氮槽長(zhǎng)度為500mm,寬度W為100mm,高度H為180mm ；
[0087]13)在液氮瞬間造粒成型的發(fā)酵劑顆粒滑落到震蕩篩網(wǎng)上，通過上下兩層的兩種不同孔徑的篩網(wǎng)(7mm、4mm)進(jìn)行分級(jí)篩選；
[0088]14)最終收集制得粒徑約為4~7mm的發(fā)酵乳雙聯(lián)乳酸菌發(fā)酵劑；
[0089]5、保存和檢測(cè)
[0090]15)采用平板計(jì)數(shù)法，對(duì)制得的發(fā)酵劑顆粒進(jìn)行計(jì)數(shù)，進(jìn)行記錄，并將發(fā)酵劑置于液氮或者超低溫冰箱中進(jìn)行保存。
[0091]16)制得發(fā)酵乳雙聯(lián)乳酸菌發(fā)酵劑。檢測(cè)所得發(fā)酵劑中乳酸菌存活量、存活率、顆粒的大小、圓潤(rùn)度。
[0092]實(shí)施例3三聯(lián)乳酸菌發(fā)酵劑
[0093]菌種組成及培養(yǎng)條件:
[0094]
【權(quán)利要求】
1.一種液氮技術(shù)制備多聯(lián)發(fā)酵劑的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟: (1)分別對(duì)單個(gè)菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)； (2)從步驟(1)中擴(kuò)大培養(yǎng)所得的菌體培養(yǎng)液中收集菌體； (3)將步驟(2)所得的菌體在菌體保護(hù)液中重新懸浮并混合均勻，得到單菌懸浮液； (4)將多種步驟(3)中所得的單菌懸浮液按照多種菌體混合的要求混合均勻，得到多菌懸浮液； (5)將步驟(4)所得的多菌懸浮液滴入液氮中，得到顆粒，所述的液氮的液層高度為50-200mm ； (6)將步驟(5)所得的顆粒進(jìn)行篩選，即得發(fā)酵劑。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述的菌體保護(hù)液包括10%~15%脫脂乳、1.0%~2.0%蔗糖、1.0%~2.0%海藻糖、0.1%~0.5%甘油、0.05%~0.15%檸檬酸鈉和0.05%~0.15%單谷氨酸鈉，更佳的包括12%脫脂乳，1.5%蔗糖、1.5%海藻糖，0.2%甘油，0.1%檸檬酸鈉和0.1%單谷氨酸鈉，所述的百分比為質(zhì)量百分比。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述的菌體保護(hù)液與菌體的混合比例為I~20mL/g，更佳為10-20mL/g。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)中所述的液氮的液層高度為100_150mm。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)中所述的多菌懸浮液滴入液氮的流速為 SOOmT ,/mi η ~10OOmT ,/mi η。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)和步驟(6)在以下所述的液氮深冷造粒設(shè)備中完成，所述液氣深冷造粒包括: 一密封腔體； 一液體噴淋設(shè)備，設(shè)置于所述密封腔體頂部； 一液氮槽，包括第一端部和第二端部，其中第一端部設(shè)置于所述液體噴淋設(shè)備下方，所述液氮槽的底板傾角Θ為1°~30° ; 一大孔徑篩網(wǎng)，設(shè)置在所述液氮槽下方，將液氮槽第二端部滑落下來的顆粒篩分； 一小孔徑篩網(wǎng)，設(shè)置在所述大孔徑篩網(wǎng)下方，將從大孔徑篩網(wǎng)漏下的顆粒再次篩分； 一小顆粒廢料收集器，設(shè)置在小孔徑篩網(wǎng)下方，收集從小孔徑篩網(wǎng)漏下的顆粒；和 一液氮緩存罐，設(shè)置在所述液氮槽下方，用于儲(chǔ)存未氣化的液氮。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述的液氮深冷造粒設(shè)備的噴料口為矩形，設(shè)有多個(gè)出料口。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述出料口的內(nèi)徑為2-3mm，相鄰兩個(gè)出料口之間間距20mm。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的液氮深冷造粒設(shè)備設(shè)置一大孔篩網(wǎng)和一小孔篩網(wǎng)，較佳地，直徑為3_-10_，更佳的，大孔篩網(wǎng)和小孔篩網(wǎng)的篩孔直徑分別為:Φ7πιπι.C>4mm。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的液氮深冷造粒設(shè)備的液體噴淋設(shè)備上部的液體流經(jīng)管道的規(guī)格是Φ30πιπι。
【文檔編號(hào)】C12R1/46GK103695339SQ201310676442
【公開日】2014年4月2日 申請(qǐng)日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】王欽博, 杭鋒, 吳正鈞, 韓瑨, 劉振民, 郭本恒, 穆海菠, 宋馨, 朱軍偉 申請(qǐng)人:光明乳業(yè)股份有限公司