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      奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法

      文檔序號:460644閱讀:308來源:國知局
      奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法
      【專利摘要】本發(fā)明涉及一種奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法,采用傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方法以及基于病原菌16S?rRNA基因采用序列分析方法和雙引物PCR-SSCP技術(shù)對中國荷斯坦奶牛乳房炎致病菌進(jìn)行分離和鑒定。雙引物PCR-SSCP技術(shù)和序列分析方法鑒定結(jié)果基本相同。雙引物PCR-SSCP技術(shù)的結(jié)果多態(tài)性較好,結(jié)果與序列分析結(jié)果類似,是一種高效,簡單和經(jīng)濟(jì)的鑒定病原菌的方法,為中國南方荷斯坦奶牛乳房炎致病菌的快速鑒定提供理論依據(jù),從而為奶牛乳房炎的診治提供了理論基礎(chǔ)。
      【專利說明】奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001]本發(fā)明涉及奶牛乳房炎防治領(lǐng)域,具體涉及用16S rRNA基因的雙引物PCR-SSCP作為高效,簡便和經(jīng)濟(jì)的方法來鑒定奶牛乳房炎的致病菌。
      【背景技術(shù)】
      [0002]奶牛乳房炎是全球范圍內(nèi)奶牛養(yǎng)殖業(yè)中最嚴(yán)重的疾病之一。乳房炎會造成牛奶產(chǎn)量和質(zhì)量的嚴(yán)重影響,該病大約消耗所有疾病經(jīng)濟(jì)的38%。在物理,化學(xué)等因素刺激下會使乳房組織產(chǎn)生炎癥,但主要是由一種或多種微生物感染乳腺所造成。據(jù)報道乳房炎主要是由于細(xì)菌的感染,也有少數(shù)情況是由于真菌的感染造成的。例如金黃色葡萄球菌經(jīng)常會引起乳牛壞疽性乳房炎。目前,奶牛乳房炎的防治方法有很多種,主要通過優(yōu)化管理方式,如正確的擠奶方式和減少奶牛外界接觸環(huán)境中的病原體,但是乳房炎在治療和預(yù)防方面依然很大程度上依賴于抗生素的使用??咕幬锉粡V泛用于控制金黃色葡萄球菌的感染,然而在臨床治療過程中,由于盲目的大量使用抗生素導(dǎo)致耐藥菌株的不斷產(chǎn)生使這些藥物的使用受到了嚴(yán)重的爭議。如果不能及時有效地控制金黃色葡萄球菌的感染,會造成慢性細(xì)菌性乳房炎疾病。在不能明確確定乳房炎病因的情況下,雖然可以通過優(yōu)化擠奶的方式,消毒和抗生素的治療等方法以減少奶牛乳房炎的發(fā)病率,但是這些方法有一定的盲目性。因此需要確定奶牛乳房炎主要致病菌的種類,并針對具體病原菌采取相應(yīng)的預(yù)防和治療措施,才能更有效的降低奶牛乳房炎發(fā)病率,及時治愈病牛。
      [0003]現(xiàn)階段確定奶牛乳房炎致病菌主要是通過傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng),根據(jù)菌落形態(tài)確定其種類,此過程周期長且不能及時準(zhǔn)確的確定致病菌種類以便于乳房炎疾病預(yù)防和治療,因此研發(fā)和完善一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的新型診斷方法迫在眉睫。
      [0004]16S rRNA存在于所有的微生物中,并且包括保守區(qū)和可變區(qū),所以16S rRNA基因的序列分析常用作微生物進(jìn)化關(guān)系分析的靶基因?;?6S rRNA基因序列的PCR技術(shù)的應(yīng)用是一種精確的鑒定方法。國內(nèi)外有些實驗室偏向于使用此技術(shù)來鑒定少量的致病菌,但是這種方法需要大量的時間和花費,不能廣泛應(yīng)用于奶牛乳房炎致病菌的鑒定中。
      [0005]目前,國內(nèi)外有些實驗室采用一對引物的PCR-SSCP技術(shù)對常見病原菌進(jìn)行鑒定。因為SSCP技術(shù)是一項簡單,快速,高效的鑒定微生物的技術(shù)。但是有些病原菌的SSCP圖譜多態(tài)性較差,難以與其他致病菌區(qū)別。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0006]本發(fā)明的目的在于提供一種奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法,用16S rRNA基因的雙引物PCR-SSCP作為高效,簡便和經(jīng)濟(jì)的方法來鑒定奶牛乳房炎的致病菌。
      [0007]具體技術(shù)方案如下:
      [0008]一種奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法,包括如下步驟:
      [0009](I)采集奶樣;
      [0010](2)分離致病菌;[0011](3)提取病原菌菌落DNA ;
      [0012](4)合成引物;
      [0013](5) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測;
      [0014](6)雙引物的PCR-SSCP分析。
      [0015]進(jìn)一步地,步驟(1)進(jìn)一步為采集40頭乳房炎性奶牛的40個奶樣。
      [0016]進(jìn)一步地,步驟(2)進(jìn)一步包括如下步驟:
      [0017](2-1)將采集的奶樣分別接種于普通培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培
      養(yǎng)基;
      [0018](2-2) 37°C培養(yǎng)24_48h,根據(jù)菌落形態(tài)作純化培養(yǎng);
      [0019](2-3)按常規(guī)方法涂片、革蘭氏染色、鏡檢;
      [0020](2-4)初步鑒定致病菌種類。
      [0021]進(jìn)一步地,步驟(3)進(jìn)一步包括如下步驟:
      [0022](3-1)挑取適量 菌落于裝有1000ii I無菌水的離心管中,12000r/min離心5min,吸
      去水使細(xì)菌沉淀盡可能干燥;
      [0023](3-2)向裝有細(xì)菌沉淀的離心管中加入100 U I溶液I,混勻,室溫放置IOmin ;
      [0024](3-3)加入200 U I溶液II,蓋緊離心管,顛倒數(shù)次混勻,冰上放置5min ;
      [0025](3-4)加入150 U I溶液III,蓋緊離心管,顛倒數(shù)次混勻,冰上放置IOmin ;
      [0026](3-5) 12000r/min離心5min,取上清液于另一離心管中;
      [0027](3-6)向上清液中加入等體積的酚:氯仿:異戊醇,反復(fù)混勻,12000r/min離心5min,取上清液于另一離心管中;
      [0028](3-7)向上清液中加入2倍體積的無水乙醇,混勻,冰上放置lOmin,12000r/min離心5min; (3-8)倒去上清液,把離心管倒扣在吸水紙上,吸干液體;
      [0029](3-9)用lml70%乙醇洗滌DNA沉淀,混勻,12000r/min離心5min,倒去上清液,
      真空抽干或在空氣中干燥;
      [0030](3-10)加入30 ii ITE緩沖液(其中含有20 y g/ml胰RNA酶),使DNA完全溶解,_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0031]進(jìn)一步地,步驟(5)進(jìn)一步包括如下步驟:
      [0032](5-1)取5 ii LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入I U L溴酚藍(lán)上樣緩沖液混勻;
      [0033](5-2)在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳,恒壓80V,電泳30min ;
      [0034](5-3)將膠置于凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照;
      [0035](5-4)第一對引物的PCR產(chǎn)物取370bp處取條帶,進(jìn)行膠回收;
      [0036](5-5)測序,比對確定細(xì)菌種類。
      [0037]進(jìn)一步地,步驟(6)進(jìn)一步包括如下步驟:
      [0038](6-1) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 98°C變性 IOmin ;
      [0039](6-2)經(jīng)12%非變性聚丙烯酰胺凝膠150V電泳5~7h,銀染顯色;
      [0040](6-3)根據(jù)電泳圖譜,鑒定圖譜。
      [0041]進(jìn)一步地,步驟(3-2)中所述溶液I為50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris ? HCl(pH8.0),IOmmoI/L EDTA(pH8.0)。
      [0042]進(jìn)一步地,步驟(3-3)中所述溶液II為1%SDS,0.2%Na0H,用前等體積混合。[0043]進(jìn)一步地,步驟(3-4)中所述溶液III為5mol/L乙酸鉀60ml,冰乙酸11.5ml,水28.5m。
      [0044]進(jìn)一步地,鑒定方法基于16S rRNA基因的序列分析和雙引物PCR-SSCP方法。
      [0045]與目前現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明為了快速分離和鑒定中國南方荷斯坦奶牛乳房炎的病原菌,采用傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)方法以及基于病原菌16S rRNA基因采用序列分析方法和雙引物PCR-SSCP技術(shù)對中國荷斯坦奶牛乳房炎致病菌進(jìn)行分離和鑒定。結(jié)果:雙引物PCR-SSCP技術(shù)的結(jié)果多態(tài)性較好,結(jié)果與序列分析結(jié)果相同,是一種高效,簡單和經(jīng)濟(jì)的鑒定病原菌的方法,為中國南方荷斯坦奶牛乳房炎致病菌的快速鑒定提供理論依據(jù),從而為奶牛乳房炎的診治提供了理論基礎(chǔ)。
      [0046]具體來說:用16S rRNA可變區(qū)的兩對引物進(jìn)行PCR-SSCP分析,解決了以16S rRNA可變區(qū)的一對引物進(jìn)行PCR-SSCP分析時圖譜的多態(tài)性差不易區(qū)分的問題。
      [0047]本發(fā)明在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上,設(shè)計特異引物擴(kuò)增目標(biāo)微生物的16S rRNA基因可變區(qū)的三對引物用于序列分析和PCR-SSCP分析。PCR-SSCP技術(shù)操作簡單,容易掌握,實驗步驟少,周期短且靈敏度高。不同的致病菌具有特異性目的條帶。鑒定過程簡單方便,成本低廉,速度快。
      【專利附圖】

      【附圖說明】
      [0048]圖1為PCR結(jié)果的瓊脂糖凝膠圖A:引物RW01,DG74 ;B:雙引物P11P,P13P和ER10,ERll
      [0049]圖2為細(xì)菌序列比對
      [0050]圖3為致病菌的進(jìn)化關(guān)系
      [0051]圖4為雙引物的SSCP圖譜
      【具體實施方式】
      [0052]下面根據(jù)附圖對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述,其為本發(fā)明多種實施方式中的一種優(yōu)選實施例。
      [0053](I)奶樣采集:40個奶樣采自安徽蕪湖衛(wèi)崗奶牛場40頭乳房炎性奶牛。
      [0054](2)分離致病菌:將采集的奶樣分別接種于普通培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。37°C培養(yǎng)24-48h,根據(jù)菌落形態(tài)作純化培養(yǎng)。按常規(guī)方法涂片、革蘭氏染色、鏡檢。初步鑒定致病菌種類。
      [0055](3)病原菌菌落DNA的提取:挑取適量菌落于裝有1000 無菌水的離心管中,12000r/min離心5min。吸去水使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。向裝有細(xì)菌沉淀的離心管中加入100 ill 溶液 I (50mmol/L 葡萄糖,25mmol/L Tris ? HCl (pH8.0),10mmol/L EDTA (pH8.0)),混勻,室溫放置lOmin。加入200 U I溶液II (1%SDS,0.2%Na0H,用前等體積混合),蓋緊離心管,顛倒數(shù)次混勻,冰上放置5min。加入150 y I溶液III(5mol/L乙酸鉀60ml,冰乙酸
      11.5ml,水28.5ml),蓋緊離心管,顛倒數(shù)次混勻,冰上放置IOmin0 12000r/min離心5min,取上清液于另一離心管中。向上清液中加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25: 24: 1),反復(fù)混勻,12000r/min離心5min,取上清液于另一離心管中。向上清液中加入2倍體積的無水乙醇,混勻,冰上放置lOmin,12000r/min離心5min。倒去上清液,把離心管倒扣在吸水紙上,吸干液體。用lml70%乙醇洗漆DNA沉淀,混勻,12000r/min離心5min,倒去上清液,真空抽干或在空氣中干燥。加入30 u ITE緩沖液(其中含有20 u g/ml胰RNA酶),使DNA完全溶解,_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0056](4)引物的合成:引物由上海生物公司合成,具體位置、序列、長度和退火溫度見附件中的表一。
      [0057](5)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測:取5 ii LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入I U L溴酚藍(lán)上樣緩沖液混勻,在
      0.8%瓊脂糖凝膠上電泳,恒壓80V,電泳30min,將膠置于凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照。第一對引物的PCR產(chǎn)物取370bp處取條帶,進(jìn)行膠回收。由上海生物工程有限公司測序,比對確定細(xì)菌種類,結(jié)果見附件圖2和表二。
      [0058](6)雙引物的PCR-SSCP分析:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物98°C變性IOmin后,經(jīng)12%非變性聚丙烯酰胺凝膠150V電泳5~7h,銀染顯色。根據(jù)電泳圖譜,鑒定圖譜。結(jié)果見附件圖4所示。
      [0059]本實驗確定了 7種常見的奶牛乳房炎致病菌的圖譜??筛咝?、準(zhǔn)確的確定奶牛乳房炎的致病菌,從而有針對性采用藥物治療,減少抗生素的濫用頻率。奶牛的耐藥性相對減弱,乳房炎奶牛相對減少,牛奶的質(zhì)量有所提高,保證了乳制品的質(zhì)量,具有很高的市場價值和潛力。
      [0060]表一:引物
      [0061]
      【權(quán)利要求】
      1.一種奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法,其特征在于,包括如下步驟: (1)采集奶樣; (2)分離致病菌; (3)提取病原菌菌落DNA; (4)合成引物; (5)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測; (6)雙引物的PCR-SSCP分析。
      2.如權(quán)利要求1所述的奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法,其特征在于,步驟(1)進(jìn)一步為采集40頭乳房炎性奶牛的40個奶樣。
      3.如權(quán)利要求1或2所述的奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法,其特征在于,步驟(2)進(jìn)一步包括如下步驟: (2-1)將采集的奶樣分別接種于普通培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基; (2-2) 37°C培養(yǎng)24-48h,根據(jù)菌落形態(tài)作純化培養(yǎng); (2-3)按常規(guī)方法涂片、革蘭氏染色、鏡檢; (2-4)初步鑒定致病菌種類。
      4.如權(quán)利要求1-3中一項所述的奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法,其特征在于,步驟(3)進(jìn)一步包括如下步驟: (3-1)挑取適量菌落于裝有1000 u I無菌水的離心管中,12000r/min離心5min,吸去水使細(xì)菌沉淀盡可能干燥; (3-2)向裝有細(xì)菌沉淀的離心管中加入100 ill溶液I,混勻,室溫放置IOmin ; (3-3)加入200 u I溶液II,蓋緊離心管,顛倒數(shù)次混勻,冰上放置5min ; (3-4)加入150ii I溶液III,蓋緊離心管,顛倒數(shù)次混勻,冰上放置IOmin ; (3-5) 12000r/min離心5min,取上清液于另一離心管中; (3-6)向上清液中加入等體積的酹:氯仿:異戍醇,反復(fù)混勻,12000r/min離心5min,取上清液于另一離心管中; (3-7)向上清液中加入2倍體積的無水乙醇,混勻,冰上放置lOmin,12000r/min離心5min ; (3-8)倒去上清液,把離心管倒扣在吸水紙上,吸干液體; (3-9)用Iml70%乙醇洗滌DNA沉淀,混勻,12000r/min離心5min,倒去上清液,真空抽干或在空氣中干燥; (3-10)W;v30iaTE緩沖液(其中含有20 u g/ml胰RNA酶),使DNA完全溶解,-20 °C保存?zhèn)溆谩?br> 5.如權(quán)利要求1-4中一項所述的奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法,其特征在于,步驟(5)進(jìn)一步包括如下步驟: (5-1)取5 ii LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入I U L溴酚藍(lán)上樣緩沖液混勻; (5-2)在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳,恒壓80V,電泳30min ; (5-3)將膠置于凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照; (5-4)第一對引物的PCR產(chǎn)物取370bp處取條帶,進(jìn)行膠回收;(5-5)測序,比對確定細(xì)菌種類。
      6.如權(quán)利要求1-5中一項所述的奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法,其特征在于,步驟(6)進(jìn)一步包括如下步驟: (6-1) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物98°C變性IOmin ; (6-2)經(jīng)12%非變性聚丙烯酰胺凝膠150V電泳5~7h,銀染顯色; (6-3)根據(jù)電泳圖譜,鑒定圖譜。
      7.如權(quán)利要求4所述的奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法,其特征在于,步驟(3-2)中所述溶液 I 為 50mmol/L 葡萄糖,25mmol/L Tris ? HCl (pH8.0), 10mmol/L EDTA (pH8.0)。
      8.如權(quán)利要求4所述的奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法,其特征在于,步驟(3-3)中所述溶液II為1%SDS,0.2%NaOH,用前等體積混合。
      9.如權(quán)利要求4所述的奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法,其特征在于,步驟(3-4)中所述溶液III為5mol/L乙酸鉀60ml,冰乙酸11.5ml,水28.5m。
      10.如權(quán)利要求1-9中一項所述的奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定方法,其特征在于,鑒定方法基于16S rRNA基因的序列分 析和雙引物PCR-SSCP方法。
      【文檔編號】C12Q1/04GK103642925SQ201310676837
      【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
      【發(fā)明者】楊蘭英, 蔡亞非, 劉再群 申請人:安徽師范大學(xué)
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