同時(shí)檢測尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)與4號(hào)小種的lamp方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種同時(shí)檢測尖孢鐮刀菌古巴專化型1號(hào)與4號(hào)小種的LAMP方法。所述檢測方法包括LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成、模板DNA的提取、LAMP擴(kuò)增體系建立，LAMP擴(kuò)增方法，所述的LAMP擴(kuò)增方法反應(yīng)溫度為63℃左右、反應(yīng)在90min內(nèi)完成擴(kuò)增，引物包括外引物、內(nèi)引物。所述方法操作簡便，成本低廉、高靈敏度、檢測特異性大于99%、高特異性、不易污染。
【專利說明】同時(shí)檢測尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)與4號(hào)小種的LAMP方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種基于LAMP技術(shù)同時(shí)檢測尖孢鐮刀菌古巴?；虸號(hào)生理小種與4號(hào)生理小種的LAMP方法。
【背景技術(shù)】
[0003]香蕉枯萎病，又稱香蕉巴拿馬病、香蕉黃葉病，是一種重要的、最具毀滅性的香蕉病害之一，給香蕉種植業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失。該病屬維管束型土傳真菌病害，可通過種苗、土壤、流水和人為因素傳播，故對枯萎病的預(yù)防和控制是一個(gè)世界性難題。香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)是植物病害中系統(tǒng)浸染、土壤傳播、抗逆性強(qiáng)、致病性變異較大的病原菌之一，極難防治。因此，我國2007年將其列入《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》。準(zhǔn)確、快速地鑒定香蕉病菌，對于做好我國香蕉檢疫和防治工作具有重要意義。
[0004]目前國內(nèi)通用的GB、SN等標(biāo)準(zhǔn)采用培養(yǎng)接種等生物學(xué)檢測方法和PCR、基因芯片和測序比對等分子生物學(xué)檢測方法輔助相結(jié)合的方法，檢驗(yàn)周期需要2-7天，且操作復(fù)雜，成本較高，難以適應(yīng)當(dāng)代貿(mào)易中快速檢驗(yàn)的客觀需求。尤其是在田間地頭和碼頭海港等野外工作條件下，不具備PCR往往無法開展快速檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于 提供一種同時(shí)檢測尖孢鐮刀菌古巴?；虸號(hào)生理小種與4號(hào)生理小種的LAMP方法，以滿足對出入境檢驗(yàn)檢疫中尖孢鐮刀菌古巴?；虸號(hào)生理小種與4號(hào)生理小種的鑒定。
[0006]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案為:
同時(shí)檢測尖孢鐮刀菌古巴?；虸號(hào)與4號(hào)小種的LAMP方法，所述檢測方法包括LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成、模板DNA的提取、LAMP擴(kuò)增體系建立，LAMP擴(kuò)增方法，所述的LAMP擴(kuò)增方法反應(yīng)溫度為63°C左右、反應(yīng)在90min內(nèi)完成擴(kuò)增，引物包括外引物、內(nèi)引物；
所述的外引物是F3和B3 ；
所述的內(nèi)引物是FIP和BIP ；
所述引物序列自5’端到3’端如下:
F3:TTGCACCAGAAACGGTAT
B3:TTGCACCAGAAACGGTAT
FIP:TATCAGCTTGCTCCCCTGC-CGATGACCTCAATAACAAAACC
BIP:AGAGGCATAATTGGTTGTAGTGC-TTTTTTGGTGGCCCATGT
其中，所述模板DNA提取指植物或菌體組織DNA的提取，離心提取其核酸，具體步驟
為:稱取80mg樣品，加入到2ml的離心管中；加入600 μ L裂解液充分混勻。65°C溫浴至少30分鐘。然后加入30(^1^蛋白沉淀液，13000印111離心41^11。將上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈的1.5ml離心管中；若上清很混濁可以再加等體積的氯仿/異戊醇(24:1)顛倒混勻，13000rpm離心4min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一干凈的離心管中；加入0.8倍體積異丙醇，_20°C沉淀30min。13000rpm離心4min,棄上清，加入600 μ L 70%乙醇，13000rpm離心4min,棄上清，晾干，加TE溶液30 μ L溶解。
[0007]所述LAMP擴(kuò)增體系建立是采用水溶液配置，體系總體積25 μ L，其中包括:
【權(quán)利要求】
1.一種同時(shí)檢測尖孢鐮刀菌古巴?；虸號(hào)與4號(hào)小種的LAMP方法，其特征在于:所述檢測方法包括LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成、模板DNA的提取、LAMP擴(kuò)增體系建立，LAMP擴(kuò)增方法，所述的LAMP擴(kuò)增方法反應(yīng)溫度為63°C左右、反應(yīng)在90min內(nèi)完成擴(kuò)增，引物包括外引物、內(nèi)引物； 所述的外引物是F3和B3 ； 所述的內(nèi)引物是FIP和BIP ； 所述引物序列自5’端到3’端如下:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于:所述模板DNA提取指植物或菌體組織DNA的提取。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于:所述LAMP擴(kuò)增體系建立是采用水溶液配置，體系總體積25 μ L,其中包括:
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于:所述LAMP擴(kuò)增方法采用實(shí)時(shí)熒光PCR儀，將按照LAMP擴(kuò)增體系配制好的試劑加入反應(yīng)器中，63°C左右反應(yīng)I小時(shí)，共分為40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)I分鐘30秒，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)收集熒光。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于:所述LAMP擴(kuò)增方法采用普通水浴鍋或金屬浴完成，將按照LAMP擴(kuò)增體系配制好的試劑加入PE管中，放入63°C左右水浴鍋中保溫90min，然后取出放入另一 80°C水浴鍋中保溫10 min后，取出。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103773854SQ201310737490
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】楊雷亮, 孫麗霞, 陳定虎, 邱德義, 王章根, 管維 申請人:中華人民共和國中山出入境檢驗(yàn)檢疫局