一種尖孢鐮刀菌菌劑的制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種尖孢鐮刀菌菌劑的制備方法與應(yīng)用，該菌劑以尖孢鐮刀菌為母菌劑，并在固體培養(yǎng)基中接入尖孢鐮刀菌的發(fā)酵液進行固體發(fā)酵，發(fā)酵后的產(chǎn)物經(jīng)粉碎后與硅藻土、噻唑膦顆粒充分混合均勻，制成菌劑。本發(fā)明的有益效果為：尖孢鐮刀菌可以在植物體內(nèi)定殖，但對植物不致病，為內(nèi)生生防菌，在防治根結(jié)線蟲上具有獨特的優(yōu)勢，另外由于內(nèi)寄生特性使得菌株受到外界其他微生物競爭作用較小，有利于穩(wěn)定的發(fā)揮防效，可以直接利用尖孢鐮刀菌對根結(jié)線蟲的防治作用，并與噻唑膦進行配合使用，既能有效的控制蔬菜根結(jié)線蟲危害，同時可以顯著降低噻唑膦使用量，又可以促進作物生長，實現(xiàn)蔬菜的高產(chǎn)、安全、無公害生產(chǎn)。
【專利說明】—種尖孢鐮刀菌菌劑的制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體而言，涉及一種尖孢鐮刀菌菌劑的制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]目前我國黃瓜、番茄等作物普遍出現(xiàn)根結(jié)線蟲病，尤其在設(shè)施栽培中發(fā)病更為嚴重，每年對各種農(nóng)作物造成的損失達到幾十億美元。根結(jié)線蟲侵染后，在作物根部形成根結(jié)，根部吸收功能被破壞，造成作為的地上部矮小、黃化甚至葉片脫落。[0003]由于抗根結(jié)線蟲病的種質(zhì)資源稀少，所以相關(guān)技術(shù)中防治根結(jié)線蟲的重要措施是化學防治，如滅線磷、溴化鉀和百畝威等。這些藥劑雖然殺蟲快，但是會嚴重降低蔬菜質(zhì)量，污染環(huán)境，破壞生態(tài)平衡，因此生物防治措施日益受到人們的關(guān)注。國外已經(jīng)利用少孢節(jié)叢孢菌開發(fā)成商品菌劑，另外也出現(xiàn)了利用巴斯德桿菌防治南方根結(jié)線蟲的研究，這些捕食真菌和寄生性細菌在土壤中可以有效的防治線蟲，但是捕食性真菌對于線蟲的捕食是非選擇性，而巴斯德桿菌為專性寄生等特性都限制其高效發(fā)展，所以人們開始尋求內(nèi)寄生于植物的真菌來防治線蟲。
[0004]鐮刀菌和根結(jié)線蟲都是作物的重要病原物，這兩種病原物之間在寄主植物中存在著非常復(fù)雜的互作關(guān)系，植物寄生性線蟲通常能夠促進植物病原菌的侵染及擴展，從而引起嚴重的病害。然而，一些非致病性性的菌株被認為是內(nèi)寄生性的共生菌，它們能在許多植物的根組織中定植，但是并不引起病害，而且能夠增加植物對真菌病害及植物寄生線蟲的抗性，鐮刀菌即是其中之一。鐮刀菌普遍存在于土壤中，廣泛分布世界各地，是植物的致病菌，然而在土壤中，大量的菌株是非致病的，在土壤中起著未知作用。尖孢鐮刀菌是根結(jié)線蟲的拮抗菌，作為線蟲生防菌具有巨大潛力，有關(guān)研究表明，鐮刀菌可以產(chǎn)生某些代謝產(chǎn)物毒殺卵粒，再定植于卵，影響其發(fā)育，由于內(nèi)寄生特性使得菌株受到外界其他微生物競爭作用較小，所以有利于穩(wěn)定的發(fā)揮防效。但是目前這種防治黃瓜根結(jié)線蟲病的尖孢鐮刀菌菌劑的制備方法往往使用大量的噻唑膦來配合制成，使用大量的噻唑膦將帶來很高的經(jīng)濟成本，不適合大規(guī)模的生產(chǎn)，防治根結(jié)線蟲的效果差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種尖孢鐮刀菌菌劑的制備方法與應(yīng)用。
[0006]為達到上述目的，本發(fā)明實施例中提供了一種尖孢鐮刀菌菌劑的制備方法，該制備方法包括以下步驟:
(O菌種培養(yǎng):將黃瓜根系內(nèi)部的非致病尖孢鐮刀菌經(jīng)過純化后作為母菌劑，并在25-28°C的條件下，將此菌劑在121°C滅菌20-30分鐘后的平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)3_5天；
(2)發(fā)酵液制備:液體培養(yǎng)基經(jīng)過高壓濕熱滅菌后，接入步驟(1)中培養(yǎng)的尖孢鐮刀菌，然后在溫度范圍為25-28°C的條件下攪拌培養(yǎng)7-10天，培養(yǎng)后得到尖孢鐮刀菌液作為發(fā)酵液；
(3)發(fā)酵培養(yǎng):將固體培養(yǎng)基裝入發(fā)酵瓶中，并在溫度為121°C的條件下滅菌60-90分鐘，然后接入步驟(2)中生成的發(fā)酵液，充分混勻，在溫度范圍為25-28°C的條件下發(fā)酵培養(yǎng)7-10天；
(4)菌劑的制備:將發(fā)酵培養(yǎng)后的產(chǎn)物干燥后，粉碎成粉狀物，加入等質(zhì)量的硅藻土進行混合，然后加入質(zhì)量百分比為1%的噻唑膦顆粒作為增效劑，充分混合均勻后，形成尖孢鐮刀菌制劑。
[0007]進一步的，步驟(1)中所述的平板培養(yǎng)基包括馬鈴薯200g、葡萄糖20g以及瓊脂17g，并用蒸懼水配置，定容至1000 mL。
[0008]進一步的，步驟(2)中所述的液體培養(yǎng)基包括馬鈴薯200g和葡萄糖20g，并用蒸餾水配置，定容至1000 mL。[0009]優(yōu)選的，步驟(2)中，攪拌速度為170-220 r/min。
[0010]進一步的，步驟(3)中，所述固體培養(yǎng)基包括草炭1000克、磷酸二氫鉀20g、硫酸鎂20克；
先將磷酸二氫鉀和硫酸鎂溶于水中，再將其與草炭進行混合，制成固體培養(yǎng)基。
[0011]優(yōu)選的，步驟(3)中，所述固體培養(yǎng)基與接入的發(fā)酵液的重量比為10:1。
[0012]本發(fā)明還提供了尖孢鐮刀菌菌劑的應(yīng)用，該菌劑在制備毒殺蔬菜作物根結(jié)線蟲藥物中的應(yīng)用。
[0013]進一步的，將該菌劑在苗木移栽前均勻的溝施、穴施或撒施于土壤中，施量為10-20公斤/畝，用于防治根結(jié)線蟲。
[0014]本發(fā)明的有益效果為:(1)從健康的黃瓜根內(nèi)分離到的尖孢鐮刀菌，為內(nèi)生菌，對作物安全無害，菌株經(jīng)過發(fā)酵制成生防菌劑，制作方法簡單、實用，適合于不同規(guī)模的生產(chǎn)；
(2)尖孢鐮刀菌的固體發(fā)酵原料主要為草炭粉，來源豐富、價格低廉，在使用過程中既可以保障菌株的活性，并可以促進作物的生長，改良土壤的結(jié)構(gòu)；(3)本發(fā)明制備尖孢鐮刀菌生防制劑可以與殺線蟲劑噻唑膦復(fù)合使用，二者具有協(xié)同增效作用，混合使用，可以顯著降低噻唑膦的用量，同時又可以達到理想的防治效果。噻唑膦的使用可以快速降低土壤中根結(jié)線蟲的基數(shù)，而尖孢鐮刀菌的應(yīng)用又可以有效的持久抑制根結(jié)線蟲的發(fā)生，實現(xiàn)了無污染、安全、高效的防治措施，黃瓜、番茄等根結(jié)線蟲的防治效果可以達到75%以上。
【具體實施方式】
[0015]下面通過具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細描述。
[0016]本發(fā)明提供了一種尖孢鐮刀菌菌劑的制備方法，該制備方法包括以下步驟:
(O菌種培養(yǎng):將黃瓜根系內(nèi)部的非致病尖孢鐮刀菌經(jīng)過純化后作為母菌劑，并在25-28°C的條件下，將此菌劑在121°C滅菌20-30分鐘后的平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)3_5天；
(2)發(fā)酵液制備:液體培養(yǎng)基經(jīng)過高壓濕熱滅菌后，接入步驟(1)中培養(yǎng)的尖孢鐮刀菌，然后在溫度范圍為25-28°C的條件下攪拌培養(yǎng)7-10天，培養(yǎng)后得到尖孢鐮刀菌液作為發(fā)酵液；
(3)發(fā)酵培養(yǎng):將固體培養(yǎng)基裝入發(fā)酵瓶中，并在溫度為121°C的條件下滅菌60-90分鐘，然后接入步驟(2)中生成的發(fā)酵液，充分混勻，在溫度范圍為25-28°C的條件下發(fā)酵培養(yǎng)7-10天；
(4)菌劑的制備:將發(fā)酵培養(yǎng)后的產(chǎn)物干燥后，粉碎成粉狀物，加入等質(zhì)量的硅藻土進行混合，然后加入質(zhì)量百分比為1%的噻唑膦顆粒作為增效劑，充分混合均勻后，形成尖孢鐮刀菌制劑。
[0017]本發(fā)明利用尖孢鐮刀菌對根結(jié)線蟲的防治作用，并與噻唑膦進行配合使用，既能有效的控制蔬菜根結(jié)線蟲危害，同時可以顯著降低噻唑膦使用量，又可以促進作物生長，實現(xiàn)蔬菜的高產(chǎn)、安全、無公害生產(chǎn)。
[0018]進一步的，步驟(1)中所述的平板培養(yǎng)基包括馬鈴薯200g、葡萄糖20g以及瓊脂17g，并用蒸懼水配置，定容至1000 mL。
[0019]進一步的，步驟(2)中所述的液體培養(yǎng)基包括馬鈴薯200g和葡萄糖20g，并用蒸餾水配置，定容至1000 mL。
[0020]優(yōu)選的，步驟(2)中，攪拌速度為170-220 r/min。攪拌速度增大了發(fā)酵速度，使菌體與培養(yǎng)將充分接觸，縮短了發(fā)酵周期；攪拌過快將導(dǎo)致菌體與培養(yǎng)基的接觸時間短，菌體不能充分發(fā)酵；攪拌過慢將延長發(fā)酵的時間。
[0021]進一步的，步驟(3)中，所述固體培養(yǎng)基包括草炭1000克、磷酸二氫鉀20g、硫酸鎂20克；
先將磷酸二氫鉀和硫酸鎂溶于水中，再將其與草炭進行混合，制成固體培養(yǎng)基。采用草炭為培養(yǎng)基的主要成分，價格低廉，節(jié)省了制備成本，節(jié)約能源。
[0022]優(yōu)選的，步驟(3)中，所述固體培養(yǎng)基與接入的發(fā)酵液的重量比為10:1。對固體發(fā)酵做進一步的限定，在固體培養(yǎng)基中接入質(zhì)量為固體培養(yǎng)基10%的發(fā)酵液完全可以實現(xiàn)菌劑的發(fā)酵，過高則會使菌體的發(fā)酵液浪費，過低則會使菌劑中的母菌劑不足，從而達不到毒殺蔬菜作物中根結(jié)線蟲的效果。
[0023]上述實施例中所述的菌劑是由健康的黃瓜根內(nèi)分離得到的尖孢鐮刀菌為內(nèi)生菌，對作物安全無害，菌株經(jīng)過發(fā)酵制成生防菌劑，制作方法簡單、實用，適合于不同規(guī)模的生產(chǎn)；尖孢鐮刀菌的固體發(fā)酵原料主要為草炭，來源豐富、價格低廉，在使用過程中既可以保障菌株的活性，并可以促進作物的生長，改良土壤的結(jié)構(gòu)；本發(fā)明制備尖孢鐮刀菌生防制劑可以與殺線蟲劑噻唑膦復(fù)合使用，二者具有協(xié)同增效作用，混合使用，可以顯著降低噻唑膦的用量，同時又可以達到理想的防治效果。噻唑膦的使用可以快速降低土壤中根結(jié)線蟲的基數(shù)，而尖孢鐮刀菌的應(yīng)用又可以有效的持久抑制根結(jié)線蟲的發(fā)生，實現(xiàn)了無污染、安全、高效的防治措施，黃瓜、番茄等根結(jié)線蟲的防治效果可以達到75%以上。
[0024]本發(fā)明還提供了尖孢鐮刀菌菌劑的應(yīng)用，該菌劑在制備毒殺蔬菜作物根結(jié)線蟲藥物中的應(yīng)用。
[0025]進一步的，將該菌劑在苗木移栽前均勻的溝施、穴施或撒施于土壤中，施量為10-20公斤/畝，用于防治根結(jié)線蟲。
[0026]上述實施例中，尖孢鐮刀菌可以在植物體內(nèi)定殖，但對植物不致病，為內(nèi)生生防菌，在防治根結(jié)線蟲上具有獨特的優(yōu)勢，另外由于內(nèi)寄生特性使得菌株受到外界其他微生物競爭作用較小，有利于穩(wěn)定的發(fā)揮防效，所以可以直接利用尖孢鐮刀菌對根結(jié)線蟲的防治作用，并與噻唑膦進行配合使用，既能有效的控制蔬菜根結(jié)線蟲危害，同時可以顯著降低噻唑膦使用量，又可以促進作物生長，實現(xiàn)蔬菜的高產(chǎn)、安全、無公害生產(chǎn)。[0027]實施例1:將尖孢鐮刀菌菌株fus-Ι的菌絲體接種到平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包括馬鈴薯200g、葡萄糖20g以及瓊脂17g，并用蒸餾水配置，定容至1000 mL。將此培養(yǎng)基在121°C滅菌20分鐘后，接種鐮刀菌Fus_l，并在溫度為25°C的條件下培養(yǎng)3天，獲得活化菌種。
[0028]將活化的fus-Ι菌種接種到250 ml的三角瓶中，每瓶含有PDA液體培養(yǎng)基125ml，在25°C中以170 r/min的攪拌速度培養(yǎng)7天，得到大量的菌絲體和分生孢子。液體培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200g、葡萄糖20g,并用蒸懼水配置,定容至1000 mL。
[0029]將上述發(fā)酵液接入固體培養(yǎng)基中，充分混勻，在25 °C下發(fā)酵培養(yǎng)7天，固體培養(yǎng)基上布滿白色菌絲和孢子即可。所述固體培養(yǎng)基包括草炭1000克、磷酸二氫鉀20g、硫酸鎂20克；先將磷酸二氫鉀和硫酸鎂溶于水中，再將其與草炭進行充分的混合，制成固體培養(yǎng)基，固體發(fā)酵培養(yǎng)基裝入發(fā)酵瓶中，在121°C下滅菌90分鐘。
[0030]將發(fā)酵培養(yǎng)后的產(chǎn)物在常溫下干燥后，粉碎成粉狀物，加入等比例的硅藻土進行混合，然后加入質(zhì)量百分比為1%的噻唑膦顆粒作為增效劑，充分混合均勻后，形成尖孢鐮刀菌制劑。[0031]實施例2:將尖孢鐮刀菌菌株fus-Ι的菌絲體接種到平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為PDA培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包括馬鈴薯200g、葡萄糖20g以及瓊脂17g，并用蒸餾水配置，定容至1000 mL。將此培養(yǎng)基在121°C滅菌30分鐘后，接種鐮刀菌Fus-1，并在溫度為28°C的條件下培養(yǎng)5天，獲得活化菌種。
[0032]將活化的fus-Ι菌種接種到250 ml的三角瓶中，每瓶含有PDA液體培養(yǎng)基125ml，在28°C中以220 r/min的攪拌速度培養(yǎng)10天，得到大量的菌絲體和分生孢子。液體培養(yǎng)基配方為馬鈴薯200g、葡萄糖20g,并用蒸懼水配置,定容至1000 mL。
[0033]將液體擴繁的發(fā)酵液接入固體培養(yǎng)基中，充分混勻，在28°C下發(fā)酵培養(yǎng)10天，固體培養(yǎng)基上布滿白色菌絲和孢子即可。所述固體培養(yǎng)基包括草炭1000克、磷酸二氫鉀20g、硫酸鎂20克；先將磷酸二氫鉀和硫酸鎂溶于水中，再將其與草炭進行充分的混合，制成固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基裝入發(fā)酵瓶中，在121°C下滅菌90分鐘。
[0034]將發(fā)酵培養(yǎng)后的產(chǎn)物在常溫下干燥后，粉碎成粉狀物，加入等比例的硅藻土進行混合，然后加入質(zhì)量比為1%的噻唑膦顆粒作為增效劑，充分混合均勻后，形成尖孢鐮刀菌制劑。
[0035]實施例3:尖孢鐮刀菌的發(fā)酵液毒殺根結(jié)線蟲病的實驗
將尖孢鐮刀菌的發(fā)酵液及其稀釋5倍、10倍、20倍以及100倍的尖孢鐮刀菌的發(fā)酵液分別處理根結(jié)線蟲，測定尖孢鐮刀菌的發(fā)酵液對根結(jié)線蟲的殺死效果。具體實驗包括以下步驟:
(I)分別取部分上述三種發(fā)酵液，在轉(zhuǎn)速為1000 r/min的條件下離心10分鐘，取上清液進行殺線蟲藥效試驗。
[0036](2)制備試驗用線蟲，采自中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所溫室，將辣椒根系取出，用水輕輕沖洗，小心取下亂開，放在1%的次氯酸鈉中消毒3分鐘，再用無菌水沖洗3次，放在含有少量無菌水的培養(yǎng)皿中，在25°C恒溫箱中培養(yǎng),每隔24小時收集一次孵化的根結(jié)線蟲幼蟲。
[0037](3)具體實驗方法:在無菌的細胞培養(yǎng)板上，分別向孔內(nèi)加入不同濃度的發(fā)酵液ImL，并以無菌水作為空白對照，然后分別向發(fā)酵液和無菌水中加入ΙΟΟμ I的根結(jié)線蟲懸浮液(含有100條根結(jié)線蟲)，放在室溫下24小時，觀察根結(jié)線蟲的死亡情況，計算死亡率，即為殺線蟲效果。試驗結(jié)果，測定不同濃度的發(fā)酵液對根結(jié)線蟲的毒力效果，如表1所示:表1不同濃度發(fā)酵液對根結(jié)線蟲的殺死效果
【權(quán)利要求】
1.一種尖孢鐮刀菌菌劑的制備方法，其特征在于:該制備方法包括以下步驟: (1)菌種培養(yǎng):將黃瓜根系內(nèi)部的非致病尖孢鐮刀菌經(jīng)過純化后作為母菌劑，并在25-28°C的條件下，將此菌劑在121°C滅菌20-30分鐘后的平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)3_5天； (2)發(fā)酵液制備:液體培養(yǎng)基經(jīng)過高壓濕熱滅菌后，接入步驟(1)中培養(yǎng)的尖孢鐮刀菌，然后在溫度范圍為25-28°C的條件下攪拌培養(yǎng)7-10天，培養(yǎng)后得到尖孢鐮刀菌液作為發(fā)酵液； (3)發(fā)酵培養(yǎng):將固體培養(yǎng)基裝入發(fā)酵瓶中，并在溫度為121°C的條件下滅菌60-90分鐘，然后接入步驟(2)中生成的發(fā)酵液，充分混勻，在溫度范圍為25-28°C的條件下發(fā)酵培養(yǎng)7-10天; (4)菌劑的制備:將發(fā)酵培養(yǎng)后的產(chǎn)物干燥后，粉碎成粉狀物，加入等質(zhì)量的硅藻土進行混合，然后加入質(zhì)量百分比為1%的噻唑膦顆粒作為增效劑，充分混合均勻后，形成尖孢鐮刀菌制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尖孢鐮刀菌菌劑，其特征在于:步驟(1)中所述的平板培養(yǎng)基包括馬鈴薯200g、葡萄糖20g以及瓊脂17g，并用蒸餾水配置，定容至1000 mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尖孢鐮刀菌菌劑，其特征在于:步驟(2)中所述的液體培養(yǎng)基包括馬鈴薯200g和葡萄糖20g，并用蒸餾水配置，定容至1000 mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尖孢鐮刀菌菌劑，其特征在于:步驟(2)中，攪拌速度為170-220r/min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的尖孢鐮刀菌菌劑，其特征在于:步驟(3)中，所述固體培養(yǎng)基包括草炭1000克、磷酸二氫鉀20g、硫酸鎂20克； 先將磷酸二氫鉀和硫酸鎂溶于水中，再將其與草炭進行混合，制成固體培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的尖孢鐮刀菌菌劑，其特征在于:步驟(3)中，所述固體培養(yǎng)基與接入的發(fā)酵液的重量比為10:1。
7.權(quán)利要求1所述的尖孢鐮刀菌菌劑的應(yīng)用，其特征在于:該菌劑在制備毒殺蔬菜作物根結(jié)線蟲藥物中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的尖孢鐮刀菌菌劑的應(yīng)用，其特征在于:將該菌劑在苗木移栽前均勻的溝施、穴施或撒施于土壤中，施量為10-20公斤/畝，用于防治根結(jié)線蟲。
【文檔編號】A01N57/32GK103503924SQ201310383908
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月29日
【發(fā)明者】茆振川, 朱萍萍, 凌鍵, 陳國華, 楊宇紅, 謝丙炎 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所