一種耐高溫脂肪酶及其編碼產(chǎn)物的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種耐高溫脂肪酶，所述耐高溫脂肪酶核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述耐高溫脂肪酶的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。本發(fā)明還公開(kāi)了所述耐高溫脂肪酶的制備方法以及含有所述耐高溫脂肪酶基因的重組質(zhì)粒及耐高溫重組脂肪酶及其制備方法。本發(fā)明基因表達(dá)的產(chǎn)物具有較高的催化活性，具有良好的耐高溫及熱穩(wěn)定性特性，具有較大的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用潛力。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種耐高溫脂肪酶及其編碼產(chǎn)物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種利用宏基因組文庫(kù)篩選的方法從紅樹(shù)林土壤微生物中獲得一種耐高溫脂肪酶及其編碼產(chǎn)物。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)是一類(lèi)能催化長(zhǎng)鏈脂肪酸酯水解、合成和酯交換的酶類(lèi)，具有廣泛的底物特異性、高度的位置選擇性和異構(gòu)體選擇性等特點(diǎn)，應(yīng)用前景廣泛。在食品行業(yè)應(yīng)用于食用油脂的轉(zhuǎn)化、乳制品工業(yè)以及食品添加劑工業(yè)中；醫(yī)藥行業(yè)用于手性藥物的合成和旋光異構(gòu)體的拆分中；生物能源行業(yè)用其催化動(dòng)物油脂、植物油等與甲醇或乙醇進(jìn)行酯交換反應(yīng)，進(jìn)而得到脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯等生物燃料；洗滌業(yè)和紡織工業(yè)也廣泛使用脂肪酶。深入開(kāi)展脂肪酶的研究具有重要的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景。
[0003]上述各種工業(yè)應(yīng)用均要求脂肪酶在不同反應(yīng)條件下與不同的底物作用，如制漿需要脂肪酶在高鹽堿和高溫的環(huán)境下作用，然而目前所研究的脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)在應(yīng)用方面仍然存在缺陷，限制了脂肪酶的廣泛應(yīng)用。因此，如何從環(huán)境中獲得具有優(yōu)良特性的脂肪酶，并研究其 結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，是當(dāng)前在脂肪酶研究中面臨的一項(xiàng)重要任務(wù)。
[0004]自然界中存在的微生物99%是不可培養(yǎng)的，因此從用傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)分離到的微生物中篩選新的生物催化劑的方法是非常有局限性的。利用免陪養(yǎng)技術(shù)-宏基因組技術(shù)(Metagenomics),直接從環(huán)境中提取DNA,將其克隆到不同的載體中，構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，再?gòu)闹羞M(jìn)行篩選。該技術(shù)在挖掘和利用未培養(yǎng)微生物資源和篩選新穎生物活性物質(zhì)方面表現(xiàn)出巨大的潛力，已成為當(dāng)前國(guó)際上微生物學(xué)研究的前沿領(lǐng)域和熱點(diǎn)。至今國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)通過(guò)該技術(shù)克隆到如淀粉酶、木聚糖酶、纖維素酶、酯酶等新基因，這些酶具有新穎的酶學(xué)特性及工業(yè)應(yīng)用潛力。因此該方法為發(fā)現(xiàn)脂肪酶新基因提供了新思路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種耐高溫、高穩(wěn)定性的耐高溫脂肪酶。
[0006]本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供上述耐高溫脂肪酶的宏基因組學(xué)克隆方法。
[0007]本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種耐高溫重組脂肪酶基因的重組質(zhì)粒pET32a-lip906o
[0008]本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供一含有上述耐高溫脂肪酶DNA的表達(dá)載體。
[0009]發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供一種耐高溫重組脂肪酶及其制備方法。
[0010]本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:一種耐高溫脂肪酶基因，所述脂肪酶基因命名為lip906，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0011]本發(fā)明提供的上述新型脂肪酶，它的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0012]本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:一種耐高溫脂肪酶，其核苷酸全長(zhǎng)序列(命名為lip906)如下(SEQ ID N0.1)如下:
[0013]
【權(quán)利要求】
1.一種耐高溫脂肪酶，其特征在于:其核苷酸序列如下:
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述耐高溫脂肪酶的宏基因組學(xué)克隆方法，其特征在于:其步驟包括:提取紅樹(shù)林植物根泥土壤樣品的總DNA，并將得到的總DNA純化；將純化后的總DNA經(jīng)Bam HI內(nèi)切酶酶切，連接至載體pUCl 18/Bam HI，電擊轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α超級(jí)感受態(tài)建立宏基因組文庫(kù)，通過(guò)點(diǎn)在以三丁酸甘油酯為篩選底物的LB固體平板，篩選有水解圈的單菌落得到陽(yáng)性克隆子。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述耐高溫脂肪酶DNA的重組質(zhì)粒，其特征在于:是根據(jù)脂肪酶基因lip906的序列設(shè)計(jì)引物，以提取的質(zhì)粒pUC118-lip906為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳并回第一收產(chǎn)物，凝膠回收的第一產(chǎn)物經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶EcoR1、HindIII雙酶切并第二回收產(chǎn)物，質(zhì)粒pET32a經(jīng)EcoR1、HindIII雙酶切后與第二回收產(chǎn)物連接，獲得連接產(chǎn)物，為重組質(zhì)粒pET32a-lip906 ;其中，所述序列設(shè)計(jì)引物序列如下: Iip906~F:5 ? CCGGAATTC ATGACAACAC CAGCAGCTAC CATCGAA GG3’；Iip906-R:5’ CCCAAGCTT TCAGGGGCAAACACCGGTGGG3’。
4.一種含有權(quán)利要求1所述耐高溫脂肪酶DNA的表達(dá)載體，其特征在于:構(gòu)建方法包括:采用電轉(zhuǎn)法，將上述耐高溫脂肪酶基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，將細(xì)菌懸浮液恢復(fù)培養(yǎng)并稀釋涂布于氨芐青霉素抗性培養(yǎng)板上培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。
5.一種重組脂肪酶，其特征在于:是用權(quán)利要求4所述含有耐高溫脂肪酶DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中獲得的。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種重組脂肪酶，其特征在于:所述宿主菌是大腸桿菌BL21。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或者6所述一種重組脂肪酶的制備方法，其特征在于:其包括的步驟如下:用所述耐高溫脂肪酶DNA的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌涂布于含氨芐青霉素抗性的平板上，培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單克隆接種于LB液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，轉(zhuǎn)接至新鮮的含氨芐青霉素抗性L(fǎng)B培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD6tltl=0.8，加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)；培養(yǎng)后經(jīng)鎳柱親和層析純化。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種重組脂肪酶的制備方法，其特征在于:其包括的步驟如下:用所述耐高溫脂肪酶DNA的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌涂布于含氨芐青霉素抗性的平板上，37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單克隆接種于LB液體培養(yǎng)基，37°C、以轉(zhuǎn)速為180rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，按體積比1:100的比例轉(zhuǎn)接至新鮮的含氨芐青霉素抗性L(fǎng)B培養(yǎng)基，于37°C、轉(zhuǎn)速為180rpm培養(yǎng)至0D_=0.8，加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)培養(yǎng)后經(jīng)鎳柱親和層析純化。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述一種重組脂肪酶的制備方法，其特征在于:所述IPTG終濃度為ImM，誘導(dǎo)溫度為30°C。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述一種重組脂肪酶的制備方法，其特征在于:所述IPTG終濃度為0.08~0.1mM,誘導(dǎo)溫度為25~37°C。
【文檔編號(hào)】C12N15/55GK103834626SQ201310753995
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】李荷, 劉悅 申請(qǐng)人:廣東藥學(xué)院