一種用于功能研究的miR-505高表達(dá)載體的構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于功能研究的miR-505高表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括：（1）采用PCR方法得到shRNA基因，并用限制性內(nèi)切酶EcoRI進(jìn)行酶切，得到經(jīng)EcoRI酶切后的miR-505片段；（2）將FUGW載體或Fsy載體用EcoRI進(jìn)行酶切，并CIAP處理使其5’端去磷酸化，然后將處理后的線性化FUGW載體或Fsy載體與經(jīng)EcoRI酶切后的miR-505片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和BamHI酶切檢測(cè)目的基因插入的方向和拷貝數(shù)，測(cè)序確認(rèn)后，得到表達(dá)載體。本發(fā)明的構(gòu)建方法操作簡(jiǎn)單，得到的載體可實(shí)現(xiàn)miR-505成熟體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高表達(dá)。
【專利說(shuō)明】一種用于功能研究的miR-505高表達(dá)載體的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于表達(dá)載體構(gòu)建領(lǐng)域,特別涉及一種用于功能研究的miR-505高表達(dá)載體的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]MicroRNA是長(zhǎng)度為21-25堿基單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成。自從1993年第一個(gè)miRNA被報(bào)道以來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)miRNAs幾乎參與了所有重要的生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控[1]，miRNAs的異常表達(dá)與人類多種疾病相關(guān)[2]。迄今為止，700多種已被鑒定出來(lái)的人源性miRNAs調(diào)控了人類1/3以上基因的表達(dá)。miR-505位于小鼠X染色體X: 57647578-57647667處，ATPllC基因的第一和第二外顯子之間的第一個(gè)內(nèi)含子中，對(duì)于其生物學(xué)功能的研究目前還處于起步階段。
[0003]2010年，Verduci L等發(fā)現(xiàn)miR-505能通過(guò)作用于其靶標(biāo)ASF/SF2 (可變剪接因子)發(fā)揮調(diào)控小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的增殖和衰老/凋亡的作用[3]，Karni R等發(fā)現(xiàn)在許多細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ASF/SF2可以激活mTOR部分信號(hào)通路[4]，但是ASF參與調(diào)控mTOR的具體方式還不清楚。Yamamoto Y等在研究腫瘤多藥抗性時(shí),發(fā)現(xiàn)miR-505是一個(gè)新的腫瘤抑制miRNA,與其呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的蛋白Akt3，與mTOR通路上的AKT屬于同一基因家族[5]。因此miR-505極有可能通過(guò)調(diào)控mTOR信號(hào)通路發(fā)揮其生物學(xué)功能，而mTOR通路是目前分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，它能整合細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的信號(hào)，起到調(diào)控細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)、增殖和存活等過(guò)程的中心調(diào)控者的作用，mTOR通路的改變與多種疾病相關(guān)[6]。
[0004]在細(xì)胞水平對(duì)小RNA進(jìn)行研究，可采用合成的雙鏈SiRNA或者構(gòu)建在表達(dá)載體上的shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行。由于有些類型細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的siRNA半衰期短，體外合成SiRNA對(duì)基因表達(dá)的抑制作用通常是短暫的，因而使其應(yīng)用受到較大的限制。采用事先在體外構(gòu)建能夠表達(dá)siRNA的載體，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA的策略，不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種類增加，而且對(duì)基因表達(dá)抑制效果也不遜色于體外合成siRNA，在長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞中，甚至可以發(fā)揮長(zhǎng)期阻斷基因表達(dá)的作用。慢病毒載體(Lentiviral vector, LVs)是在HIV-1病毒基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，它能高效的將目的基因?qū)雱?dòng)物和人的原代細(xì)胞或細(xì)胞系。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。目前慢病毒也被廣泛地應(yīng)用于表達(dá)micix)RNA的研究中[7]。
[0005]1.Bartel DP (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism，andfunction.Cellll6(2):281-297 ；
[0006]2.Ambros V，朱萬(wàn)渠(2010):MicroRNAs 與疾病和發(fā)育生命科學(xué) 3:27-29 ;
[0007]3.Verducij Lj Simili Mj Rizzo Mj Mercatanti A, Evangelista M et al.(2010)MicroRNA(miRNA)-mediated Interaction between Leukemia/Lymphoma-relatedFactor (LRF) and Alternative splicing factor/splicing factor2(ASF/SF2)affects mouse embryonic fibroblast senescence and apoptosis.J BiolChem, 285:39551-39563 ；
[0008]4.Karni R, Hippo Y, Lowe SW, Krainer AR (2008) The spl icing-factoroncoprotein S F 2/A S F activates mTORCl.Proc Natl Acad SciUSA105(40):15323-15327 ；
[0009]5.Yamamoto Y, Yoshioka Y, Minoura K, Takahashi R, Takeshita F etal., (201I)An integrative genomic analysis revealed the relevance of microRNAand gene expression for drug-resistance in human breast cancer cells.MolCancer, 10:13539551-39563 ；
[0010]6.Mathieu Laplante and David M.Sabatini, mTOR signaling at a glance(2009)J Cell Scil22, 3589-3594 ；
[0011]7.Dittgen T, Nimmerjahn A, Komai S, Licznerski P, Waters J, MargrieTW,Helmchen F,Denk W,Brecht M, and Osten P (2004)Lentivirus-based geneticmanipulations of cortical neurons and their optical and electrophysiologicalmonitoring inviv0.Proc.Natl ac sci USA.101:18206-18211。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種用于功能研究的miR-505高表達(dá)載體的構(gòu)建方法，該方法操作簡(jiǎn)單，得到的載體可實(shí)現(xiàn)miR-505成熟體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高表達(dá)。
[0013]本發(fā)明的一種用于功能研究的miR-505高表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括:
[0014](1) miR-505 的 shRNA 基因的獲得
[0015]采用PCR 方法將 microRNA-505 的 shRNA 基因從 pcDNA?6.2-Gff/EmGFP-miR-505擴(kuò)增得到包含miR-505-3p、miR-505_5p及miR-505-nc的shRNA基因，并用限制性內(nèi)切酶EcoRI進(jìn)行酶切，得到經(jīng)EcoRI酶切后的miR-505片段；
[0016](2) FUGff-miR-505 及 Fsy-miR-505 載體的構(gòu)建
[0017]將FUGW載體或Fsy載體用EcoRI進(jìn)行酶切，并CIAP處理使其5’端去磷酸化，然后將處理后的線性化FUGW載體或Fsy載體與步驟(1)得到的經(jīng)EcoRI酶切后的miR-505片段進(jìn)行連接，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，并涂布到1%氨芐抗性的瓊脂糖平板至長(zhǎng)出菌落，對(duì)單菌落進(jìn)行PCR鑒定，初步確定陽(yáng)性克隆并根據(jù)PCR產(chǎn)物大小推測(cè)插入片段的拷貝數(shù)；將陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒后，進(jìn)行BamHI的酶切，根據(jù)產(chǎn)物大小確認(rèn)外源片段插入的方向，將正確插入的片段進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)，得到表達(dá)載體。
[0018]步驟(1)中所述的PCR方法中所用的一對(duì)引物如下:
[0019]PcDNA-1eft:5’ CCGGAATTCAGTGGATCCTGGAGGCTTG ；
[0020]PcDNA-right:5， CCGGAATTCCAGATCTGGGCCATTTGTTC。
[0021]步驟(1)中所述的miR-505-3p、miR-505_5p及miR-505-nc的序列長(zhǎng)度分別為173bp、175bp、171bp。
[0022]步驟(2)中所述的連接的具體操作為4°C下過(guò)夜連接。
[0023]步驟(2)中所述的PCR鑒定中的引物為:
[0024]FUGff - EcoRlUpper:5，CATGGACGAGCTGTACAAGT ；[0025]FUGff - EcoRlLower:5’ CCGGAATTCCAGATCTGGGCCATTTGTTC。
[0026]本發(fā)明構(gòu)建了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)miR-505的慢病毒載體，通過(guò)啟動(dòng)子的選擇和多拷貝shRNA插入的篩選獲得成熟體的高表達(dá)；通過(guò)具有組織特異性表達(dá)啟動(dòng)子的選擇和多拷貝shRNA插入的篩選獲得在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的高表達(dá)。
[0027]本發(fā)明技術(shù)方案包括用PCR方法獲得目的基因，在PCR引物兩端設(shè)計(jì)相同的酶切位點(diǎn)EcoRI，同時(shí)還保留了原載體上目的基因兩側(cè)的分別位于上下游的BamHI和BglII位點(diǎn)，將PCR產(chǎn)物用EcoRI酶切后，與經(jīng)相同酶切的FUGW和Fsy載體分別連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞。根據(jù)上述兩個(gè)載體上位于EcoRI位點(diǎn)兩側(cè)的序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)菌落進(jìn)行PCR篩選，初步確定陽(yáng)性克隆并根據(jù)PCR產(chǎn)物大小推測(cè)插入片段的拷貝數(shù)。將陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒后，進(jìn)行BamHI的酶切，根據(jù)產(chǎn)物大小確認(rèn)外源片段插入的方向，將正確插入的片段進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。[0028]將構(gòu)建好的miR-505慢病毒載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，48小時(shí)后，提取細(xì)胞RNA，用特異引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后用熒光定量PCR反應(yīng)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)成熟體miR-505的定量以檢測(cè)轉(zhuǎn)染及表達(dá)情況。
[0029]本發(fā)明構(gòu)建能高效表達(dá)microRNA-505的慢病毒載體，選用UBC作為啟動(dòng)子的FUGW載體。泛素啟動(dòng)子UBC為人和小鼠細(xì)胞的組成型啟動(dòng)子，包含多種轉(zhuǎn)錄因子，且具有泛素系統(tǒng)本身的特性，與常用的病毒啟動(dòng)子相比，其細(xì)胞來(lái)源的特性以及組成型表達(dá)的特點(diǎn)可能使它們更加適合驅(qū)動(dòng)外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高效表達(dá)。另外，為了提高miR-505在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的特異性，選用大鼠SynaptinI (突觸蛋白I)啟動(dòng)子(FsyI)的Fsy載體。FsyI是在神經(jīng)元中特異表達(dá)的啟動(dòng)子,細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果都證明，F(xiàn)syI啟動(dòng)子能指導(dǎo)其所調(diào)控的基因在神經(jīng)元細(xì)胞中特異性高效表達(dá)。在構(gòu)建上述兩種載體時(shí)，都保留了載體上的EGFP位點(diǎn)，以方便通過(guò)熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。
[0030]本發(fā)明的工藝過(guò)程，首先采用PCR方法和帶有兩端帶有EcoRI酶切位點(diǎn)的引物將 microRNA505 的 shRNA 基因從 pcDNA?6.2-Gff/EmGFP-miR-505 擴(kuò)增，得到 miR-505_3p 和miR-505-5p的shRNA基因，EcoRI酶切PCR產(chǎn)物，同時(shí)FUGW和Fsy空載體經(jīng)EcoRI酶切，并CIAP處理使其5’端去磷酸化；處理后的線性化載體FUGW和Fsy分別與shRNA片段4°C過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 α，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和BamHI酶切檢測(cè)目的基因插入的方向和拷貝數(shù)，測(cè)序確認(rèn)后，得到表達(dá)載體。表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，經(jīng)熒光定量PCR確認(rèn)miR-505的表達(dá)量。
[0031]以FUGW-miR505_3p為例，載體構(gòu)建過(guò)程如圖7所示。
[0032]有益效果
[0033]本發(fā)明構(gòu)建了能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)外源miR-505的慢病毒載體，選擇在人和小鼠細(xì)胞中組成型表達(dá)的UBC啟動(dòng)子和在神經(jīng)元中特異表達(dá)的Syn啟動(dòng)子,前者是為了提高外源基因表達(dá)的效率和持續(xù)性，后者可用于研究miR-505在神經(jīng)元中的生物學(xué)功能，并且保留載體上的EGFP蛋白編碼基因以方便地指示轉(zhuǎn)染效率。
[0034]本發(fā)明在載體上的單酶切位點(diǎn)插入外源片段，盡管陽(yáng)性克隆中大約有一半會(huì)以反向插入，但是，在連接過(guò)程中，也可將目的片段進(jìn)行串聯(lián)形成多拷貝，在插入的目的基因上游保留了 BamHI位點(diǎn)，PCR引物設(shè)計(jì)上保留了一個(gè)采用單酶切位點(diǎn)的方式將外源基因連接到載體上，以在設(shè)計(jì)了位于表達(dá)載體EcoRI位點(diǎn)兩側(cè)的PCR引物以方便用菌落PCR方法篩選陽(yáng)性克隆。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0035]圖1 miR505目的片段的PCR電泳圖；其中泳道l-miR505_3P，泳道2-miR505_5P，泳道 3-miR505_nc,泳道 4-marker ；
[0036]圖2菌落PCR電泳圖；其中泳道I~9-FUGW-miR505-3p，泳道10-陰性，泳道11-Marker, a箭頭指示單拷貝，b箭頭指示兩拷貝，c箭頭指示三拷貝；
[0037]圖3 FUGff-miR505-3p BamHI酶切產(chǎn)物電泳圖；泳道liarker，泳道2~
3-FUGff-miR505-3p單拷貝正向插入酶切產(chǎn)物，泳道4-FUGW-miR505_3p單拷貝反向插入酶切產(chǎn)物，泳道5-FUGW-miR505-3p兩拷貝正向插入酶切產(chǎn)物，泳道6-FUGW-miR505_3p兩拷貝-正向-反向插入酶切產(chǎn)物；
[0038]圖4 FUGff-miR505-3p 載體圖譜；
[0039]圖5 HEK293T 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后 EGFP 表達(dá)，其中 A:pcDNA?6.2-Gff/EmGFP-miR-505-3p,B:pcDNA?6.2-Gff/EmGFP-miR-505-nc, C:FUGff-miR505-3p, D:FUGff-miR505-nc, E:L26Fsy(l.1)Gff-miR505-3p, F:L26Fsy(l.1)Gff-miR505-nc, G:FUGff-miR505-3p 單拷貝，H:FUGff-miR505-3p 兩拷貝，I:FUGff-miR505-3p 三拷貝；
[0040]圖6 miR505-3p不同拷貝數(shù)質(zhì)粒在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)；
[0041]圖7 FUGW-miR505_3p為例，載體構(gòu)建過(guò)程示意圖。`【具體實(shí)施方式】
[0042]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
[0043]實(shí)施例1
[0044]I).miR-505 的 shRNA 基因的獲得
[0045]根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)并合成2對(duì)miR-505寡聚單鏈DNA，分別為miR-505_5p，miR-505_3p序列見(jiàn)表一:
[0046]表1.miRNA寡聚單鏈DNA序列(附陰性對(duì)照序列)
[0047]
【權(quán)利要求】
1.一種用于功能研究的miR-505高表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括: (1)采用PCR方法將microRNA-505 的 shRNA基因從pcDNA?6.2-GW/EmGFP_miR-505擴(kuò)增得到包含miR-505-3p、miR-505-5p及miR-505-nc的shRNA基因，并用限制性內(nèi)切酶EcoRI進(jìn)行酶切，得到經(jīng)EcoRI酶切后的miR-505片段； (2)將FUGW載體或Fsy載體用EcoRI進(jìn)行酶切，并CIAP處理使其5’端去磷酸化，然后將處理后的線性化FUGW載體或Fsy載體與步驟(1)得到的經(jīng)EcoRI酶切后的miR-505片段進(jìn)行連接，再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5ci，并涂布到1%氨芐抗性的瓊脂糖平板至長(zhǎng)出菌落，對(duì)單菌落進(jìn)行PCR鑒定，初步確定陽(yáng)性克隆并根據(jù)PCR產(chǎn)物大小推測(cè)插入片段的拷貝數(shù)；將陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒后，進(jìn)行BamHI的酶切，根據(jù)產(chǎn)物大小確認(rèn)外源片段插入的方向，將正確插入的片段進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)，得到表達(dá)載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于功能研究的miR-505高表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(1)中所述的PCR方法中所用的一對(duì)引物如下:
PcDNA-1eft:5’ CCGGAATTCAGTGGATCCTGGAGGCTTG ；
PcDNA-right:5’ CCGGAATTCCAGATCTGGGCCATTTGTTC。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于功能研究的miR-505高表達(dá)載體的構(gòu)建方法,其特征在于:步驟(1)中所述的miR-505-3p、miR-505_5p及miR-505-nc的序列長(zhǎng)度分別為173bp、175bp、171bp。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于功能研究的miR-505高表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(2)中所述的連接的具體操作為4°C下過(guò)夜連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于功能研究的miR-505高表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(2)中所述的PCR鑒定中的引物為:`
FUGff - EcoRlUpper:5’ CATGGACGAGCTGTACAAGT ；
FUGff - EcoRlLower:5’ CCGGAATTCCAGATCTGGGCCATTTGTTC。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK103710372SQ201310754411
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】周宇荀, 馬驍驍, 肖君華, 李凱 申請(qǐng)人:東華大學(xué)