專利名稱：一種慢性粒細(xì)胞白血病干祖細(xì)胞發(fā)病相關(guān)分子發(fā)現(xiàn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種構(gòu)建慢性粒細(xì)胞白血病人原代干祖細(xì)胞模型，并由此建立分析慢性粒細(xì)胞白血病干祖細(xì)胞基因數(shù)據(jù)庫，從而發(fā)現(xiàn)慢粒發(fā)病干祖細(xì)胞中未知腫瘤相關(guān)分子。
目前，在人的慢性粒細(xì)胞白血病中，p210BCR/ABL是在BCR啟動子的調(diào)控下表達(dá)的，理想的模型應(yīng)采用BCR的啟動子，但BCR/ABL癌基因?qū)τ谂咛グl(fā)育中的嵌入小鼠及轉(zhuǎn)基因小鼠都是致死的，因此，此類的模型沒有成功的報道。而只有人干祖細(xì)胞癌基因誘導(dǎo)的信號傳遞才能真正代表慢粒的病理發(fā)生發(fā)展過程。本研究成功地了慢性粒細(xì)胞白血病原代干祖細(xì)胞模型和慢性粒細(xì)胞白血病干祖細(xì)胞基因數(shù)據(jù)庫，分析了慢性粒細(xì)胞白血病干祖細(xì)胞基因數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)了新的慢粒樣原代干祖細(xì)胞中腫瘤相關(guān)分子，并鑒定了其在慢粒發(fā)生中的分子功能及意義。并有效地再現(xiàn)人慢粒的異常細(xì)胞表型。而以抑制PCR為基礎(chǔ)的cDNA削減雜交方法和基因芯片技術(shù)的應(yīng)用為實現(xiàn)該基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫研究提供了良好的途徑。
本發(fā)明的目的是在國際上首次提出利用慢性粒細(xì)胞白血病人原代干祖細(xì)胞模型建立分析慢性粒細(xì)胞白血病干祖細(xì)胞基因數(shù)據(jù)庫，從而對白血病發(fā)病分子機(jī)制有進(jìn)一步的了解，發(fā)現(xiàn)未知腫瘤相關(guān)分子，以此設(shè)計藥物以阻斷腫瘤分子靶位點以達(dá)到治療白血病的目的。
本發(fā)明是通過下述方法實現(xiàn)的一、構(gòu)建載體并建立慢性粒細(xì)胞白血病原代干祖細(xì)胞模型(1)建立逆轉(zhuǎn)錄病毒載體及轉(zhuǎn)染系統(tǒng)從IRES上游克隆完整p210BCR/ABLcDNA，構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體MSCV-p210BCR/ABL-IRES-eGFP及不含p210的對照載體。用PCL-快速轉(zhuǎn)染系統(tǒng)獲得高滴度病毒上清，用于靶細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
(2)高效轉(zhuǎn)染BCR/ABL癌基因原代干祖細(xì)胞從臍帶血中分選CD34+Lin-細(xì)胞，在多種因子條件下培養(yǎng)，利用多病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)將p210重組載體及對照載體轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞。24小時后用FACS分選eGFP CD34+細(xì)胞。
(3)建立慢性粒細(xì)胞白血病原代干祖細(xì)胞模型采用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞p210癌基因mRNA水平的表達(dá)；Western免疫化學(xué)法檢測p210在eGFP陽性的實驗組及對照組細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
(4)慢性粒細(xì)胞白血病原代干祖細(xì)胞模型的鑒定再現(xiàn)p210對細(xì)胞粘附的作用；再現(xiàn)p210對細(xì)胞遷移的作用；再現(xiàn)p210對原有絲分裂原活性的作用；再現(xiàn)p210延緩凋亡的作用；再現(xiàn)p210對細(xì)胞分化的作用；再現(xiàn)p210對增殖抑制的作用；再現(xiàn)p210調(diào)節(jié)信號傳導(dǎo)及細(xì)胞周期分子。
二、構(gòu)建及分析人慢性粒細(xì)胞白血病原代干祖細(xì)胞cDNA基因數(shù)據(jù)庫1、構(gòu)建人慢性粒細(xì)胞白血病原代干祖細(xì)胞cDNA文庫。
2、制備特異性探針。
3、以同位素標(biāo)記特異性探針篩選文庫，得到實驗組細(xì)胞特異表達(dá)基因克隆，擴(kuò)增，測序得基因全長。
4、將目的基因裝入表達(dá)載體，選擇適當(dāng)宿主細(xì)胞表達(dá)。
5、研究表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)性質(zhì)。
6、以原代干祖細(xì)胞模型與無癌基因整合的相應(yīng)對照細(xì)胞為實驗對象，采用基因芯片技術(shù)，展示慢粒干祖細(xì)胞基因表達(dá)圖譜?；虬ㄞD(zhuǎn)錄因子與染色小體結(jié)合蛋白基因；細(xì)胞表面分子基因；分泌蛋白基因；信號分子基因等類別。
三、發(fā)現(xiàn)與探索新的慢粒樣原代干祖細(xì)胞中腫瘤相關(guān)分子，分析和鑒定其在慢粒發(fā)生中分子功能及意義1、發(fā)現(xiàn)與研究與Betal integrin家族同源新的信號分子，探討粘附減弱是由哪一個Betal integrin家族的剪接異構(gòu)體信號分子引起的。
2、發(fā)現(xiàn)與研究與Fax，paxillin，Crkl和CBL等主要粘附分子同源新的信號分子，探討粘附減弱是由哪一個潛在的粘附分子家族同源信號分子引起的。
3、發(fā)現(xiàn)與研究與細(xì)胞骨架分子同源新的信號分子，研究細(xì)胞骨架家族信號分子是否是粘附減弱的原因。
4、設(shè)計并克隆新的信號分子，獲得信號分子的全序列。
5、用Northern blot分析其拷貝數(shù)和組織特異表達(dá)形勢。
6、構(gòu)建基因表達(dá)載體，在293細(xì)胞中該信號分子高效表達(dá)。
7、采用FN包被粘附實驗，測定此分子的粘附功能效應(yīng)的研究。
8、進(jìn)行此信號分子的細(xì)胞腫瘤轉(zhuǎn)化研究。
9、發(fā)現(xiàn)了一種p210BCR/ABL轉(zhuǎn)染的的慢粒樣原代干祖細(xì)胞模型中的腫瘤相關(guān)分子類凋亡抑制劑(apoptosis inhibitor)，是凋亡抑制劑的新的異構(gòu)體，是由RNA拼接所形成的新的凋亡抑制劑家族成員。本發(fā)明的優(yōu)點1、通過對慢性粒細(xì)胞白血病人原代干祖細(xì)胞模型的研究發(fā)現(xiàn)了p210轉(zhuǎn)導(dǎo)CD34+細(xì)胞后，上調(diào)了的活性，而BCR/ABL的誘導(dǎo)使轉(zhuǎn)位于細(xì)胞漿內(nèi)，因而造成胞核定位障礙不能抑制含的干細(xì)胞的細(xì)胞周期，從而使之通過G1期而進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)。
2、通過此模型的研究通過此模型，還發(fā)現(xiàn)了多種慢粒樣原代干祖細(xì)胞中腫瘤相關(guān)分子，并分析和研究了其在慢粒發(fā)生中的分子功能和機(jī)制。
3、本研究還成功地構(gòu)建了人慢性粒細(xì)胞白血病干祖細(xì)胞cDNA基因數(shù)據(jù)庫，從而為慢性粒細(xì)胞白血病的藥物治療提供了有效的靶基因。
4、本研究發(fā)現(xiàn)的多種與慢性粒細(xì)胞白血病相關(guān)基因和致白血病的癌基因特異性相關(guān)分子對于慢性粒細(xì)胞白血病發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制的研究和治療都有著重要的意義，必將對慢性粒細(xì)胞白血病的最終治愈有重大的貢獻(xiàn)。類凋亡抑制劑(apoptosis inhibitor)2341bpgaaaccatgg tcaggtggtc tcttacctgt taaaatcagg agctgacaaa gaaaagttggcgacatggtg gcacccgtgc tggagacttc tcacgtgttt tgctgcccaa accgggtgcggggagtcctg aactggagct ctgggcccag aggacttctg gcctttggca cgtcctgctccgtggtgctc tatgaccccc tgaaaagggt tgttgttacc aacttgaatg gtcacaccgcccgagtcaat tgcatacagt ggatttgtaa acaggatggc tccccttcta ctgaattagtttctggagga tctgataatc aagtgattca ctgggaaata gaggataatc agcttttaaaagcagtgcat cttcaaggcc atgaaggacc tgtttatgcg gtgcatgctg tttaccagaggaggacatca gatcctgcat tatgtacact gatcgtttct gcagctgcag attctgctgttcgactctgg tctaaaaagg gtccagaagt accaatatta gcatgtggca atgatgattgcagaattcac atatttgctc aacaaaatga tcagtttcag aaagtgcttt ctctctgtggacatgaggat tggattagag gagtggaatg ggcagccttt ggtagagatc ttttcctagcaagctgttca caagattgcc tgataagaat atggaagctg tatataaagt caacatctttagaaactcag gatgacgata acataagact gaaagaaaat acttttacca tagaaaatgaaagtgttaaa atagcatttg ctgttactct ggagacagtg ctagccggtc atgaaaactgggtaaatgca gttcactggc aacctgtgtt ttacaaagat ggtgtcctac agcagccagtgagattatta tctgcttcca tggataaaac catgattctc tgggctccag atgaagagtcaggagtttgg ctagaacagg agagtggact ccagagattg tcatttcaggacactttgatggtgtcc aagacctagt ctgggatcca gaaggagaat ttattatcac tgttggtactgatcagacaa ctagactttt tgctccatgg aagagaaaag accaatcaca ggtgacttggcatgaaattg caaggcctca gatacatggg tatgacctga aatgtttggc aatgattaatcggtttcagt ttgtatctgg agcagatgaa aaagttcttc gggttttttc tgcacctcggaattttgtgg aaaatttttg tgccattaca ggacaatcac tgaatcatgt gctctgtaatcaagatagtg atcttccaga aggagccact gtccctgcat tgggattatc aaataaagctgtctttcagg gagatatagc ttctcagcct tctgatgaag aggagctgtt aactagtactggttttgagt atcagcaggt ggcctttcag ccctccatac ttactgagcc tcccactgaggatcatcttc tgcagaatac tttgtggcct gaagttcaaa aactatatgg gcacggttatgaaatatttt gtgttacttg taacagttca aagactctgc ttgcctcagc ttgtaaggcagctaagaaag agcatgcagc tatcattctt tggaacacta catcttggaa acaggtgcagaatttagttt tccacagttt gacagtcacg cagatggcct tctcacctaa tgagaagttcttactagctg tttccagaga tcgaacctgg tcattgtgga aaaagcagga tacaatctcacctgagttcg agccagtttt tagtcttttt gccttcacca acaaaattac ttctgtgcacagtagaatta tttggtcttg tgattggagt cctgacagca agtatttctt cactgggagtcgagacaaaa aggtggttgt ctggggtgtg tgcgactcca ctgatgactg tattgagcacaacattggcc cctgctcctc agtcctggac gtgggtgggg ctgtgacagc tgtcagcgtctgcccagtgc tccacccttc tcaacgatac gtggttgcag taggattgga gtgtggaaagatttgcttat atacctggaa aaagactgat caagttccag aaataaatga ctggacccactgtgtagaaa caagtcaaag ccaaagtcat acactggcta tcagaaaatt atgctggaagaattgcagtg gaaaaactga acagaaggaa gcagaaggtg ctgagtggtt acactttgcaagctgtggtg aagatcacac tgtgaagata cacagagtca ataaatgtgc actgtaatggactt
權(quán)利要求
1.一種利用慢性粒細(xì)胞白血病人原代干祖細(xì)胞模型建立分析慢性粒細(xì)胞白血病干祖細(xì)胞基因數(shù)據(jù)庫的方法，其特征在于用基因嵌入法將p210癌基因整合到造血干祖細(xì)胞染色體構(gòu)建慢性粒細(xì)胞白血病原代干祖細(xì)胞模型，以此模型與無癌基因整合的相應(yīng)對照細(xì)胞為實驗?zāi)Ｐ停捎孟鳒p雜交方法并結(jié)合基因芯片技術(shù)，展示慢粒干祖細(xì)胞胞基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫，進(jìn)而探索基因特異性相關(guān)分子致白血病發(fā)病機(jī)制。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種p210BCR/ABL轉(zhuǎn)染的的慢粒樣原代干祖細(xì)胞模型中的腫瘤相關(guān)分子類凋亡抑制劑(apoptosis inhibitor)，一種凋亡抑制劑新的異構(gòu)體(isoform)。保擴(kuò)的內(nèi)容類凋亡抑制劑基因序列相應(yīng)的氨基酸序列，類凋亡抑制劑的基因產(chǎn)物及其衍生物，及含有部分或全部該基因片段的基因產(chǎn)物及其衍生物；保護(hù)參照該序列所設(shè)計的靶序列阻斷、封閉或加強(qiáng)作用的基因、蛋白質(zhì)以及細(xì)胞水平的物質(zhì)結(jié)構(gòu)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于成功地構(gòu)建了人慢性粒細(xì)胞白血病干祖細(xì)胞cDNA基因數(shù)據(jù)庫。通過與無癌基因整合的相應(yīng)對照細(xì)胞的比較，并結(jié)合cDNA削減雜交方法和基因芯片技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了多種與慢性粒細(xì)胞白血病相關(guān)的基因，從而為慢性粒細(xì)胞白血病的藥物治療提供了有效的靶基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了慢性粒細(xì)胞白血病人原代干祖細(xì)胞模型的構(gòu)建后,由此分析并建立慢性粒細(xì)胞白血病干祖細(xì)胞基因數(shù)據(jù)庫,從而發(fā)現(xiàn)了一種慢粒發(fā)病干祖細(xì)胞中未知腫瘤相關(guān)分子。本發(fā)明涉及了人慢性粒細(xì)胞白血病原代干祖細(xì)胞基因數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建及分析。發(fā)現(xiàn)的一種與慢性粒細(xì)胞白血病相關(guān)基因和致白血病的癌基因特異性相關(guān)分子對于慢性粒細(xì)胞白血病發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制的研究和治療都有著重要的意義。
文檔編號C12Q1/68GK1361244SQ00136049
公開日2002年7月31日 申請日期2000年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月26日
發(fā)明者趙春華 申請人:趙春華