具有修飾的cdr的抗-涎免凝集素15抗體的制作方法
【專利摘要】提供靶向破骨細胞中強表達基因所編碼的蛋白的骨代謝異常治療和/或預防藥物組合物。提供包含特異性識別人涎免凝集素-15并顯示抑制破骨細胞形成作用的抗體的藥物組合物等。
FERM BP-10999
2008.08.28
【專利說明】具有修飾的CDR的抗-涎免凝集素15抗體

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及可用作骨代謝異常的治療和/或預防劑的物質(zhì)，以及用于治療和/或 預防骨代謝異常的方法。
[0002] 發(fā)明背景 已知骨骼為通過重復形成和吸收連續(xù)重塑以改變其自身形態(tài)學和維持血鈣水平的動 態(tài)器官。健康的骨骼維持成骨細胞骨形成與破骨細胞骨吸收之間的平衡，并且骨骼質(zhì)量維 持恒定。相反，當骨形成和骨吸收之間的平衡喪失，發(fā)生骨代謝異常例如骨質(zhì)疏松癥（參 見，例如，非專利文獻1和2)。
[0003] 作為調(diào)節(jié)骨代謝的因子，已經(jīng)報道了許多全身激素和局部細胞因子，這些因子相 互合作以形成和維持骨骼（參見，例如，非專利文獻1和3)。作為由于衰老引起的骨組織變 化，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生廣為人知，但其發(fā)生機制包括多種不同因素，例如性激素分泌減少和 激素受體異常、骨骼局部細胞因子表達變化、衰老基因表達和破骨細胞或成骨細胞分化失 敗或功能障礙，因此難以將其認為是一種簡單的年齡-相關(guān)生理學現(xiàn)象。原發(fā)性骨質(zhì)疏松 癥主要分為雌激素分泌減少引起的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和衰老引起的老年性骨質(zhì)疏松癥，但 對骨形成和骨吸收調(diào)節(jié)機制的基礎研究的進展是闡明其發(fā)生機制并開發(fā)用于其的治療劑 所必不可少的。
[0004] 破骨細胞為造血干細胞衍生的多核細胞，通過在破骨細胞粘附的骨骼表面釋放氯 離子和氫離子，破骨細胞酸化骨骼表面與破骨細胞之間的間隙并且還分泌酸性蛋白酶組織 蛋白酶K等（參見，例如，非專利文獻4)。這導致磷酸鈣降解、酸性蛋白酶活化和骨基質(zhì)蛋 白的降解，引起骨吸收。
[0005] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)破骨細胞前體細胞通過用骨骼表面存在的成骨細胞/間質(zhì)細胞的細胞 膜上表達的RANKL (NF- K B配體的受體激活劑）刺激分化為破骨細胞（參見，例如，非專利 文獻5和6)。已顯示：RANKL為成骨細胞/間質(zhì)細胞產(chǎn)生的膜蛋白，其表達受骨吸收因子調(diào) 節(jié)，RANKL誘導破骨細胞前體細胞分化為成熟多核破骨細胞，等（參見，例如，非專利文獻5 和7)。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RANKL缺乏的基因敲除小鼠患骨硬化病-樣疾病，因此，證明RANKL 為生理學破骨細胞分化-誘導因子（參見，例如，非專利文獻8)。
[0006] 作為用于治療骨代謝疾病或縮短治療持續(xù)時間的藥物，使用二膦酸鹽、活性維生 素 D3、降鈣素及其衍生物、激素例如雌二醇、SERM (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑）、依普黃酮、 維生素 K2 (四烯甲萘醌）、PTH、鈣制劑等。然而，在治療結(jié)果方面這些藥物不總是令人滿 意，已經(jīng)需要開發(fā)具有更有效治療作用的藥物。
[0007] 免疫細胞的細胞膜被各種聚糖例如唾液酸化聚糖的致密覆蓋包覆，所述聚糖被 各種聚糖-結(jié)合蛋白識別。唾液酸-結(jié)合免疫球蛋白-樣凝集素（后文稱為"涎免凝集 素（Siglec) "）為識別唾液酸化聚糖并與其結(jié)合的I型膜蛋白家族。許多涎免凝集素在免 疫細胞的細胞膜上表達，識別同樣存在于免疫細胞的細胞膜上的唾液酸并調(diào)節(jié)細胞相互作 用或細胞功能，被認為參與免疫反應（參見，例如，非專利文獻9)。然而，還存在大量生理 學功能尚未闡明的涎免凝集素分子。涎免凝集素-15 (唾液酸結(jié)合免疫球蛋白-樣凝集 素15)為新近報道的屬于涎免凝集素的分子（參見，例如，非專利文獻10)，并且與被稱為 ⑶33L3 (⑶33分子-樣3)的分子相同。該分子從魚至人在進化上高度保守，并且發(fā)現(xiàn)在樹 突細胞和/或人脾和淋巴結(jié)巨噬細胞中強表達。此外，作為使用唾液酸探針的結(jié)合檢驗的 結(jié)果，還發(fā)現(xiàn)人涎免凝集素-15與Neu5Ac a 2_6GalNAc結(jié)合，小鼠涎免凝集素-15進一步與 Neu5Ac a 2_3Gal P l-4Glc結(jié)合，等（參見，非專利文獻10)。直到最近，涎免凝集素-15的 生理學作用尚未揭示，然而，已經(jīng)報道涎免凝集素-15的表達隨破骨細胞分化和成熟增加， RNA干涉引起的涎免凝集素-15表達降低抑制破骨細胞的分化（參見，例如，PTL 1)。此外， 抗-涎免凝集素-15抗體對破骨細胞分化的作用在PTL 2 (2009年4月16日公布）和PTL 3 (2010年10月14日公布）中第一次揭示。此外，同樣還在PTL 4中，公開了抑制破骨細 胞分化的抗體，然而，對具有更有效作用的抗體的研究一直在持續(xù)。
[0008] 現(xiàn)有技術(shù)文獻 專利文獻 專利文獻 I :W0 07/093042 專利文獻2 :W0 09/48072 專利文獻 3 :W0 10/117011 專利文獻 4 :W0 11/041894 非專利文獻 非專利文獻 I :Endocrinological Review, (1992) 13，66-80 頁 非專利文獻 2 !Principles of Bone Biology (骨豁生物學原理），Academic Press, New York, (1996) 87-102 頁 非專利文獻 3 !Endocrinological Review, (1996) 17，308-332 頁 非專利文獻 4 !American Journal of Physiology, (1991) 260，C1315-C1324 非專利文獻 5 !Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, (1998) 95， 3597-3602 頁 非專利文獻 6 :Cell, (1998) 93，165-176 頁 非專利文獻 7 :Journal of Bone and Mineral Research, (1998) 23，S222 非專利文獻 8 :Nature, (1999) 397，315-323 頁 非專利文獻 9 :Nature Reviews Immunology, (2007) 7，255-266 頁 非專利文獻 10 :Glycobiology，（2007) 17，838-846 頁 發(fā)明簡述 本發(fā)明的技術(shù)問題 本發(fā)明目標為提供在骨質(zhì)疏松癥、類風濕性關(guān)節(jié)炎、癌癥轉(zhuǎn)移至骨骼等中所見的各種 形式的骨代謝異常中特異性表達的基因；抑制破骨細胞的分化和成熟及其活性的物質(zhì)；和 用于骨代謝異常的治療和/或預防劑。
[0009] 用于解決問題的方法 本發(fā)明人進行研究以闡明破骨細胞分化、成熟和活化的機制，以便發(fā)現(xiàn)對骨代謝異常 具有治療和/或預防作用的物質(zhì)。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)涎免凝集素-15基因的表達隨破骨細 胞的分化和成熟增加，還發(fā)現(xiàn)破骨細胞分化被與涎免凝集素-15特異性結(jié)合的抗體抑制。 此外，本發(fā)明人將已獲得的大鼠抗-小鼠涎免凝集素-15抗體人源化，并進一步修飾所述人 源化抗體的⑶R，因此完成了本發(fā)明。
[0010] 具體地，本發(fā)明包括下列發(fā)明。
[0011] (1)抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，特征在于： 重鏈序列包含具有⑶RHlXDRH2和⑶RH3的可變區(qū)，并且⑶RHl包含SEQ ID NO: 7所 表示的氨基酸序列，⑶RH2包含SEQ ID NO: 9所表示的氨基酸序列，和⑶RH3包含SEQ ID NO: 11所表示的氨基酸序列；和 輕鏈序列包含具有CDRLl、CDRL2和CDRL3的可變區(qū)，并且CDRLl包含SEQ ID NO: 12 所表不的氨基酸序列，⑶RL2包含SEQ ID NO: 13所表不的氨基酸序列，和⑶RL3包含SEQ IDN0: 14所表示的氨基酸序列。
[0012] (2) (1)的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，特征在于包含重鏈可變區(qū)序列和輕鏈 可變區(qū)序列，所述重鏈可變區(qū)序列包含SEQ ID NO: 6所表示氨基酸序列的氨基酸殘基 20-140,所述輕鏈可變區(qū)序列包含SEQ ID NO: 4所表示氨基酸序列的氨基酸殘基21-133。
[0013] (3) (1)的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，特征在于包含重鏈序列和輕鏈序列，所述 重鏈序列包含SEQ ID NO: 6所表示氨基酸序列的氨基酸殘基20-466,所述輕鏈序列包含 SEQ ID NO: 4所表示氨基酸序列的氨基酸殘基21-238。
[0014] (4) (1)的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，特征在于包含重鏈序列和輕鏈序列，所述 重鏈序列包含SEQ ID NO: 6所表示氨基酸序列的氨基酸殘基20-465,所述輕鏈序列包含 SEQ ID NO: 4所表示氨基酸序列的氨基酸殘基21-238。
[0015] (5) (1)或⑵的抗體的抗原結(jié)合片段，選自Fab、F (ab，）2、Fab'和Fv。
[0016] (6) (1)或⑵的抗體，特征在于為scFv。
[0017] (7) -種藥物組合物，特征在于包含（1)-(6)中的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段中 的至少一種。
[0018] (8) (7)的藥物組合物，特征在于為用于骨代謝異常的治療和/或預防劑。
[0019] (9)用于治療和/或預防骨代謝異常的藥物組合物，特征在于包含（1)-(6)中的 抗體或抗體的抗原結(jié)合片段中的至少一種和選自二膦酸鹽、活性維生素 D3、降鈣素及其衍 生物、激素例如雌二醇、SERM (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑）、依普黃酮、維生素1(2 (四烯甲萘 醌）、鈣制劑、PTH (甲狀旁腺素）、非留類抗炎劑、可溶性TNF受體、抗-TNF-a抗體或抗體 的抗原結(jié)合片段、抗-PTHrP (甲狀旁腺素-相關(guān)蛋白）抗體或抗體的抗原結(jié)合片段、IL-I 受體拮抗劑、抗-IL-6受體抗體或抗體的抗原結(jié)合片段、抗-RANKL抗體或抗體的抗原結(jié)合 片段和OCIF (破骨細胞形成抑制因子）的至少一種。
[0020] (10) (8)或（9)的藥物組合物，其中骨代謝異常選自骨質(zhì)疏松癥、伴隨類風濕性 關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)破壞、癌性高鈣血癥、伴隨多發(fā)性骨髓瘤或癌癥轉(zhuǎn)移至骨骼的骨質(zhì)破壞、巨細 胞瘤、骨質(zhì)減少、牙周炎引起的牙損失、假關(guān)節(jié)周圍的骨質(zhì)溶解、慢性骨髓炎中的骨質(zhì)破壞、 骨佩吉特氏病、腎性骨營養(yǎng)不良和成骨不全。
[0021] (11) (10)的藥物組合物，特征在于骨代謝異常為骨質(zhì)疏松癥、伴隨類風濕性關(guān)節(jié) 炎的骨質(zhì)破壞或伴隨癌癥轉(zhuǎn)移至骨骼的骨質(zhì)破壞。
[0022] (12) (11)的藥物組合物，特征在于骨代謝異常為骨質(zhì)疏松癥。
[0023] (13) (12)的藥物組合物，特征在于骨質(zhì)疏松癥為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、老年性骨質(zhì) 疏松癥、使用治療劑例如留類或免疫抑制劑引起的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥或伴隨類風濕性關(guān)節(jié) 炎的骨質(zhì)疏松癥。
[0024] (14)用于治療和/或預防骨代謝異常的方法，特征在于給予（1)-(6)的抗體或抗 體的抗原結(jié)合片段中的至少一種或（8)或（9)的藥物組合物。
[0025] (15)用于治療和/或預防骨代謝異常的方法，特征在于同時或依次給予（1)-(6) 的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段中的至少一種或（8)的藥物組合物和選自二膦酸鹽、活性維 生素 D3、降鈣素及其衍生物、激素例如雌二醇、SERM (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑）、依普黃 酮、維生素 K2 (四烯甲萘醌）、鈣制劑、PTH (甲狀旁腺素）、非留類抗炎劑、可溶性TNF受 體、抗-TNF-a抗體或抗體的抗原結(jié)合片段、抗-PTHrP (甲狀旁腺素-相關(guān)蛋白）抗體或抗 體的抗原結(jié)合片段、IL-I受體拮抗劑、抗-IL-6受體抗體或抗體的抗原結(jié)合片段、抗-RANKL 抗體或抗體的抗原結(jié)合片段和OCIF (破骨細胞形成抑制因子）的至少一種。
[0026] (16) (14)或（15)的治療和/或預防方法，特征在于骨代謝異常為骨質(zhì)疏松癥、伴 隨類風濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)破壞或伴隨癌癥轉(zhuǎn)移至骨骼的骨質(zhì)破壞。
[0027] (17) (16)的治療和/或預防方法，特征在于骨代謝異常為骨質(zhì)疏松癥。
[0028] (18) (17)的治療和/或預防方法，特征在于骨質(zhì)疏松癥為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、老 年性骨質(zhì)疏松癥、使用治療劑例如留類或免疫抑制劑引起的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥或伴隨類風 濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥。
[0029] (19)編碼（1)-(6)中任一項的抗體的多核苷酸。
[0030] (20) (19)的多核苷酸，特征在于包括含有包含SEQ ID NO: 5所表示核苷酸序列 的核苷酸58-420的核苷酸序列的多核苷酸和含有包含SEQ ID NO: 3所表不核苷酸序列的 核苷酸61-399的核苷酸序列的多核苷酸。
[0031] (21) (19)的多核苷酸，特征在于包括含有包含SEQ ID NO: 5所表示核苷酸序列 的核苷酸58-1398的核苷酸序列的多核苷酸和含有包含SEQ ID NO: 3所表不核苷酸序列 的核苷酸61-174的核苷酸序列的多核苷酸。
[0032] (22) -種載體，包含（19)-(21)的多核苷酸中的任一種。
[0033] (23)轉(zhuǎn)化的宿主細胞，包含（19)-(21)的多核苷酸中的任一種。
[0034] (24)轉(zhuǎn)化的宿主細胞，包含（22)的載體。
[0035] (25)生產(chǎn)（1)-(6)中任一項的抗體的方法，包括培養(yǎng)（23)或（24)的宿主細胞和 從所得培養(yǎng)產(chǎn)物中純化抗體。
[0036] 本發(fā)明效果 根據(jù)本發(fā)明，可獲得用于骨代謝異常的治療和/或預防劑，其作用機制為抑制破骨細 胞的分化和成熟及其骨吸收活性。
[0037] 附圖簡述 圖1顯示K3-1115抗體重鏈的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[0038] 圖2顯示K3-1115抗體輕鏈的核苷酸序列及其氨基酸序列。
[0039] 圖3顯示K3-1115/T103E抗體重鏈的核苷酸序列及其氨基酸序列。順便提及， K3-1115/T103抗體的輕鏈和K3-1115抗體的輕鏈彼此相同。
[0040] 圖4顯示#32A1抗體和K3-1115/T103E抗體的各自⑶R的氨基酸序列。
[0041] 圖5顯示描繪通過加入K3-1115/T103E抗體抑制正常人破骨細胞的骨吸收活性的 圖表（N=6)。
[0042] 對實施方案的說明 如本文所使用的術(shù)語"基因"不僅包括DNA，還包括mRNA、cDNA和cRNA。
[0043] 如本文所使用的術(shù)語"多核苷酸"與"核酸"同種含義使用，同樣包括DNA、RNA、探 針、寡核苷酸和引物。
[0044] 如本文所使用的術(shù)語"多肽"和"蛋白"無差別使用。
[0045] 如本文所使用的術(shù)語"RNA級分"指包含RNA的級分。
[0046] 如本文所使用的術(shù)語"細胞"包括動物個體中的細胞和培養(yǎng)的細胞。
[0047] 如本文所使用的術(shù)語"涎免凝集素-15"與"涎免凝集素-15蛋白"相同含義使用。
[0048] 如本文所使用的術(shù)語"破骨細胞形成"與"破骨細胞分化"或"破骨細胞成熟"相同 含義使用。
[0049] 如本文所使用的術(shù)語"抗體的抗原結(jié)合片段"與"抗體的功能片段"相同含義使用， 指抗體具有結(jié)合抗原活性的部分片段，包括Fab、F (ab'）2、Fv、scFv、雙抗體、線性抗體、自 抗體片段形成的多特異性抗體等。該術(shù)語還包括Fab'，其為抗體可變區(qū)的單價片段，通過在 還原條件下處理F (ab'）2獲得。然而，該術(shù)語不限于這些分子，只要片段具有抗原結(jié)合親和 性即可。此外，這些抗原結(jié)合片段不僅包括用合適的酶處理抗體蛋白的全長分子獲得的片 段，還包括在適當宿主細胞中使用遺傳上修飾的抗體基因生產(chǎn)的蛋白。
[0050] 已經(jīng)知道抗體分子的每個重鏈和輕鏈具有三個互補決定區(qū)（⑶R)?；パa決定區(qū) 也被稱為高變結(jié)構(gòu)域，存在于抗體每個重鏈和輕鏈的可變區(qū)。其為在其一級結(jié)構(gòu)中具有特 別高度可變性的位點，并且在每個重和輕多肽鏈的一級結(jié)構(gòu)中存在三個獨立的CDR。在本 說明書中，關(guān)于抗體的互補決定區(qū)，重鏈的互補決定區(qū)從重鏈氨基酸序列的氨基-末端用 ⑶RHl、⑶RH2和⑶RH3表示，輕鏈的互補決定區(qū)從輕鏈氨基酸序列的氨基-末端用⑶RLl、 ⑶RL2和⑶RL3表示。這些位點在三級結(jié)構(gòu)中彼此接近，決定抗體所結(jié)合的抗原的特異性。
[0051] 如本文所使用的短語"雜交在嚴格條件下進行"指雜交在這樣的條件下或在與其 相當?shù)臈l件下進行：在此條件下通過使用具有DNA固定在其上的濾膜，在可市售獲得的雜 交溶液ExpressHyb雜交溶液（Clontech Laboratories, Inc?制造）中于68°C進行雜交或 在0.7-1. 0 M NaCl存在下于68°C進行雜交，然后使用0. 1-2 X SSC溶液（I X SSC溶液由 150 mM NaCl和15 mM檸檬酸鈉組成）于68°C進行洗滌可完成鑒定。
[0052] 1?涎免凝集素-15 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)涎免凝集素-15基因在巨細胞瘤中特異性表達，并且還發(fā)現(xiàn)當單核細 胞-衍生的細胞系分化為破骨細胞時涎免凝集素-15基因的表達水平增加。
[0053] 本發(fā)明使用的涎免凝集素-15直接從人、非-人類哺乳動物（例如豚鼠、大鼠、小 鼠、兔、豬、綿羊、?；蚝镒樱┗螂u的單核細胞或骨髓細胞純化，然后可使用；或從上述細胞 的細胞膜級分制備，然后可使用。此外，涎免凝集素-15可通過體外合成或在宿主細胞中通 過基因工程生產(chǎn)而獲得。特別地，在這樣的基因工程生產(chǎn)中，將涎免凝集素-15 cDNA整合 入能夠表達涎免凝集素-15 cDNA的載體中，在包含轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的酶、底物和能量物質(zhì) 的溶液中合成涎免凝集素-15,或轉(zhuǎn)化另一種原核或真核宿主細胞以表達涎免凝集素-15， 從而可獲得該蛋白質(zhì)。
[0054] 人涎免凝集素-15 cDNA的核苷酸序列已在GenBank中以登記號NM_213602登記。 小鼠涎免凝集素-15 cDNA的核苷酸序列已在GenBank中以登記號XM_884636登記。順便提 及，涎免凝集素-15有時被稱為⑶33抗原-樣3、⑶33分子-樣3、⑶33-樣3或⑶33L3， 所有這些均代表同一分子。
[0055] 涎免凝集素-15 cDNA可通過，例如，所謂的PCR方法獲得，其中使用表達涎免凝集 素-15 cDNA的cDNA文庫作為模板和特異性擴增涎免凝集素-15 cDNA的引物進行聚合酶 鏈反應（后文稱為 "PCR"）（Saiki, R. K?等，Science, (1988) 239，487-49)。
[0056] 順便提及，與包含與編碼人或小鼠涎免凝集素-15的核苷酸序列互補的核苷酸序 列的多核苷酸在嚴格條件下雜交并編碼具有與涎免凝集素-15類似的生物學活性的蛋白 的多核苷酸也被認為是涎免凝集素-15 cDNA。此外，為自人或小鼠涎免凝集素-15基因 座轉(zhuǎn)錄的剪接變體的多核苷酸或與其互補序列在嚴格條件下雜交并編碼具有與涎免凝集 素-15類似的生物學活性的蛋白的多核苷酸也被認為是涎免凝集素-15 cDNA。
[0057] 此外，以下蛋白質(zhì)也被認為是涎免凝集素-15 :包含在人或小鼠涎免凝集素-15的 氨基酸序列或通過除去該序列的信號序列獲得的氨基酸序列中包含一個或多個氨基酸置 換、缺失或添加的氨基酸序列，并且具有與涎免凝集素-15類似的生物學活性。此外，以下 蛋白質(zhì)也被認為是涎免凝集素-15 :包含自人或小鼠涎免凝集素-15基因座轉(zhuǎn)錄的剪接變 體所編碼氨基酸序列或其中包含一個或多個氨基酸置換、缺失或添加的氨基酸序列，并具 有與涎免凝集素-15類似的生物學活性。
[0058] 2?骨代謝異常的檢測 對來自各種人骨組織的一組檢驗樣品中涎免凝集素-15基因表達水平的分析顯示該 基因的表達水平在巨細胞瘤（GCT)中顯著增加，巨細胞瘤為出現(xiàn)大量破骨細胞-樣多核巨 細胞的骨腫瘤，特征在于臨床發(fā)現(xiàn)溶骨性骨質(zhì)破壞（Bullough等，Atlas of Orthopedic Pathology第二版，17.6-17.8頁，Lippincott Williams & Wilkins 出版商（1992))。
[0059] 還發(fā)現(xiàn)當單核細胞-衍生的細胞系分化為破骨細胞時涎免凝集素-15基因的表達 水平增加。
[0060] 因此，認為涎免凝集素-15與其中骨吸收增加的人病理學例如GCT有關(guān)。換言之， 測量涎免凝集素-15基因和/或涎免凝集素-15在各細胞和/或各組織中的表達水平使得 能夠確定涎免凝集素-15過量表達伴隨的骨代謝異常的狀態(tài)。如本文所使用的術(shù)語"骨代 謝異常"指以凈骨質(zhì)流失為特征的病癥，其具體實例包括，但不限于，骨質(zhì)疏松癥（絕經(jīng)后 骨質(zhì)疏松癥、老年性骨質(zhì)疏松癥、使用治療劑例如留類或免疫抑制劑引起的繼發(fā)性骨質(zhì)疏 松癥或伴隨類風濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥）、伴隨類風濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)破壞、癌性高鈣血 癥、伴隨多發(fā)性骨髓瘤或癌癥轉(zhuǎn)移至骨骼的骨質(zhì)破壞、巨細胞瘤、骨質(zhì)減少、牙周炎引起的 牙損失、假關(guān)節(jié)周圍的骨質(zhì)溶解、慢性骨髓炎中的骨質(zhì)破壞、骨佩吉特氏病、腎性骨營養(yǎng)不 良和成骨不全。
[0061] 在本發(fā)明中，用于檢查涎免凝集素-15基因和/或涎免凝集素-15表達水平的"檢 驗樣品"指來自骨髓、骨骼、前列腺、睪丸、陰莖、膀胱、腎、口腔、咽、唇、舌、牙銀、鼻咽、食管、 胃、小腸、大腸、結(jié)腸、肝、膽囊、胰臟、鼻、肺、軟組織、皮膚、乳房、子宮、卵巢、腦、甲狀腺、淋 巴結(jié)、肌肉、脂肪組織等的組織樣品，或獲自檢驗受試者或臨床樣品等的血液、體液、排泄物 等，然而，在本發(fā)明中，更優(yōu)選血液或骨髓。
[0062] 關(guān)于RANKL (已知其與破骨細胞分化有關(guān)），生產(chǎn)了基因敲除小鼠，并分析當了 RANKL功能喪失時的表型（Young-Yun Kong,等，Nature (1999) 397，315-323 頁）。通 過以上述相同方式生產(chǎn)缺失涎免凝集素-15的基因敲除小鼠，可分析當涎免凝集素-15功 能喪失時的表型。
[0063] 3?抗-涎免凝集素-15抗體的生產(chǎn) 本發(fā)明的抗涎免凝集素-15的抗體可通過用涎免凝集素-15或選自涎免凝集素-15氨 基酸序列的任意多肽免疫動物，并按照一般程序收集和純化體內(nèi)所產(chǎn)生抗體獲得。用作抗 原的涎免凝集素-15的生物物種不限于人，可用除人外的動物例如小鼠或大鼠衍生的涎免 凝集素-15免疫動物。在這種情況下，通過檢查結(jié)合所獲異源性涎免凝集素-15的抗體與 人涎免凝集素-15之間的交叉-反應性，可選擇適用于人類疾病的抗體。
[0064] 此外，根據(jù)已知方法（例如，Kohler 和 Milstein, Nature, (1975) 256，495-497 頁；Kennet, R?主編，Monoclonal Antibodies, 365-367 頁，Plenum Press, N. Y. (1980))，可通過融合生產(chǎn)抗涎免凝集素-15抗體的抗體-生產(chǎn)細胞與骨髓瘤細胞以建立雜 交瘤，獲得單克隆抗體。此種方法的一個具體實例在WO 09/48072 (2009年4月16日公 布）和TO 10/117011 (2010年10月14日公布）中描述。
[0065] 順便提及，用作抗原的涎免凝集素-15可通過使宿主細胞生產(chǎn)涎免凝集素-15基 因的基因工程獲得。特別地，產(chǎn)生了能夠表達涎免凝集素-15基因的載體，并將所得載體轉(zhuǎn) 化入宿主細胞以表達該基因，然后純化表達的涎免凝集素-15。
[0066] 因此建立的雜交瘤株的實例包括WO 09/48072中所述的雜交瘤#32A1。雜交瘤 #32A1在2008年8月28日保藏于國家先進工業(yè)科學和技術(shù)研究所的國際專利生物保藏中 心（the International Patent Organism Depositary of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)(位于 Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan),被給予登記號 FERM BP-10999,名稱為 抗-涎免凝集素-15雜交瘤#32A1。順便提及，在本說明書中，雜交瘤#32A1生產(chǎn)的抗體被 稱為"#32A1抗體"或簡稱為"#32A1"。WO 2010/117011中描述了包含#32A1抗體的重鏈可 變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的部分片段。
[0067] 為減少對人等的異種抗原性，通過人工修飾上述抗涎免凝集素-15單克隆抗體的 序列，可產(chǎn)生人源化抗體，其為重組抗體。本發(fā)明的抗體包括其中上述人源化抗體的CDR被 修飾的抗體。這些抗體可使用已知方法生產(chǎn)。
[0068] 作為人源化抗體，可舉例出通過僅將互補決定區(qū)（⑶R)整合入人-衍生的抗體獲 得的抗體（參見Nature (1986) 321，522-525頁）和通過CDR-移植方法將框架的部分氨 基酸殘基以及CDR序列移植入人抗體獲得的抗體（W0 90/07861)。作為大鼠抗體#32A1的 人源化抗體的實例，可舉例出含有以下重鏈可變區(qū)的重鏈和含有以下輕鏈可變區(qū)的輕鏈的 組合：所述重鏈可變區(qū)含有包含SEQ ID NO: 2的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列，所述輕 鏈可變區(qū)含有包含SEQ ID NO: 4的氨基酸殘基21-133的氨基酸序列。
[0069] 此外，作為優(yōu)選的抗體，可舉例出包含以下重鏈和以下輕鏈的抗體：所述重鏈具有 包含SEQ ID NO: 2的氨基酸殘基20-466的氨基酸序列，所述輕鏈具有包含SEQ ID NO: 4的氨基酸殘基21-238的氨基酸序列。在本說明書中，上述抗體被稱為"K3-1115"或 "K3-1115 抗體"。
[0070] 然而，#32A1抗體衍生的人源化抗體不限于上述人源化抗體，只要該人源化抗體 具有#32A1的所有6種類型的CDR序列并且具有抑制破骨細胞形成的活性即可。順便提 及，#32A1抗體的重鏈可變區(qū)具有包含SEQ ID NO: 7所表示氨基酸序列的⑶RHl (DYFMN)、 包含 SEQ ID NO: 8 所表示氨基酸序列的 CDRH2 (QIRNKIYTYATFYAESLEG)和 SEQ ID NO: 9所表示的⑶RH2 (QIRNKIYTYATFYA)中的任一個和包含SEQ ID NO: 10所表示氨基酸序 列的 CDRH3 (SLTGGDYFDY)。SEQ ID NO: 8 所表示的 CDRH2 與 Kabat 定義（SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST 卷 I，第五版（1991)) 一致。SEQ ID NO: 9 所表 示的⑶RH2在C末端比Kabat定義短5個殘基。在包含該⑶RH2的重鏈序列中，大鼠衍生 的CDR序列較短并摻入更多的人框架序列，因此，當將其給予人時，更小可能被識別為異種 抗原。此外，#32A1抗體的輕鏈可變區(qū)具有包含SEQ ID NO: 12所表示氨基酸序列的⑶RLl (RASQSVTISGYSFIH)、包含SEQ IDN0: 13所表示氨基酸序列的CDRL2 (RASNLAS)和包含SEQ ID NO: 14所表示氨基酸序列的CDRL3 (QQSRKSPWT)。順便提及，上述SEQ ID NO: 7-10和 12-14的⑶R的氨基酸序列還在圖4中示出。
[0071] 作為#32A1抗體衍生的人源化抗體的CDR-修飾變體的一個實例，可舉例出以下抗 體：其中SEQ ID NO: 10的⑶RH3的第3位蘇氨酸殘基用谷氨酸殘基置換。涎免凝集素-15 為堿性蛋白，通過將酸性氨基酸殘基例如天冬氨酸或谷氨酸引入抗體序列中，在抗原與抗 體間形成離子鍵，因此預期結(jié)合親和性得到改善。設計了其中將谷氨酸殘基（其為酸性氨 基酸并具有長側(cè)鏈）在位于CDRH3環(huán)（其被認為是抗體識別位點最重要的CDR，并且基于 X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析推測面向抗原）中心的蘇氨酸殘基位置處引入抗體的置換變體。包含 上述置換的⑶RH3 (SLEGGDYFDY)對應于序列表中SEQ ID NO: 11的氨基酸序列。順便提 及，SEQ ID NO: 11的⑶RH3的氨基酸序列還在圖4中示出。
[0072] 作為上述⑶R-修飾變體抗體的優(yōu)選實例，可舉例出含有以下重鏈可變區(qū)的重鏈 和含有以下輕鏈可變區(qū)的輕鏈的組合：所述重鏈可變區(qū)含有包含SEQ ID NO: 6的氨基酸殘 基20-140的氨基酸序列，所述輕鏈可變區(qū)含有包含SEQ ID NO: 4的氨基酸殘基21-133的 氨基酸序列。
[0073] 作為更優(yōu)選的抗體，可舉例出包含以下重鏈和輕鏈的抗體：所述重鏈具有包含SEQ ID NO: 6的氨基酸殘基20-466的氨基酸序列，所述輕鏈具有包含SEQ ID NO: 4的氨基酸 殘基21-238的氨基酸序列。在本說明書中，上述抗體被稱為"K3-1115/T103E"或"K3-1115/ T103E抗體"。順便提及，K3-1115/T103E抗體重鏈為以下序列：其中通過從SEQ ID NO: 2 所表示的K3-1115重鏈序列去除信號序列獲得的氨基酸序列的第103位蘇氨酸殘基用谷氨 酸殘基置換。
[0074] 然而，本發(fā)明人源化#32A1的⑶R-修飾變體不限于上述⑶R-修飾變體，只要其具 有SEQ ID NO: 11的⑶RH3序列即可。此外，本發(fā)明人源化#32A1的⑶R-修飾變體的⑶RH2 序列可為SEQ ID NO: 8或SEQ ID NO: 9所表示的CDRH2。
[0075] 順便提及，已經(jīng)知道通過哺乳動物培養(yǎng)細胞所生產(chǎn)的抗體的重鏈羧基末端處的賴 氨酸殘基是缺失的（Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995))，還已知這樣 的重鏈的羧基末端處的下列兩個氨基酸殘基：甘氨酸和賴氨酸是缺失的，并且位于羧基末 端的任何脯氨酸殘基被重新酰胺化（Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007))。然 而，重鏈序列這樣的缺失和修飾不影響抗體的抗原結(jié)合親和性和效應子功能（補體激活、 抗體-依賴的細胞毒活性等）。因此，本發(fā)明還包括經(jīng)受此種修飾的抗體，并且可舉例出其 中重鏈羧基末端的一個或兩個氨基酸缺失的缺失變體、通過所述重鏈的酰胺化（例如，其 中羧基-末端位點的脯氨酸殘基被酰胺化的重鏈）獲得的缺失變體等。然而，其中本發(fā)明 抗體的重鏈的羧基-末端殘基缺失的缺失變體不限于上述變體，只要其具有抗原結(jié)合親和 性和效應子功能即可。組成本發(fā)明抗體的兩條重鏈可包括全長重鏈和選自上述缺失變體的 任一條重鏈，或可包括選自其中的任何兩條重鏈的組合。每個缺失變體的相對量可受本發(fā) 明抗體生產(chǎn)中所使用的哺乳動物培養(yǎng)細胞的類型和培養(yǎng)條件影響，然而，一個實例為其中， 作為本發(fā)明抗體的主要組分，兩條重鏈均在羧基末端包含一個氨基酸殘基的缺失。
[0076] 可通過實施例3中所述方法等評估通過上述方法獲得的抗體的抗原結(jié)合活性，并 可選擇優(yōu)選的抗體。作為比較抗體性質(zhì)的另一個指標的一個實例，可舉例出抗體的穩(wěn)定性。 差示掃描量熱法（DSC)為能夠快速且精確地測量熱變性中點溫度（Tm)的方法，Tm為蛋白相 對結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的有利指標。通過使用DSC測量Tm值并比較該值，可比較熱穩(wěn)定性差異。已知 抗體的儲存穩(wěn)定性顯示與抗體的熱穩(wěn)定性有一些相關(guān)（Lori Burton,等，Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12，pp. 265-273)，優(yōu)選的抗體可通過使用熱穩(wěn)定 性作為指標進行選擇。用于選擇抗體的其它指標的實例如下：在適當宿主細胞中的產(chǎn)率高； 和在水性溶液中的聚集性低。例如，顯示最高產(chǎn)率的抗體并不總是顯示高熱穩(wěn)定性，因此， 通過基于上述指數(shù)做出綜合評估選擇最適合給予人的抗體是必需的。
[0077] 此外，亦已知其中使用適當接頭連接抗體的全長重鏈和輕鏈序列從而獲得單 鏈免疫球蛋白的方法（Lee, H-S,等，Molecular Immunology (1999) 36，61-71 頁； Shirrmann, T?等，mAbs (2010)，2，（1) 1-4頁）。通過二聚化這樣的單鏈免疫球蛋 白，所得二聚體可具有與本身為四聚體的抗體相似的結(jié)構(gòu)和活性。此外，本發(fā)明抗體可 為具有單一重鏈可變區(qū)且不具有輕鏈序列的抗體。這樣的抗體被稱為單一結(jié)構(gòu)域抗體 (sdAb)或納米抗體，事實上，其在駱駝和羊駝中被觀察到，并且經(jīng)報道具有抗原結(jié)合親和性 (Muyldemans S?等，Protein Eng. (1994) 7(9)，1129-35，Hamers-Casterman C?等， Nature (1993) 363 (6428) 446-8)。上述抗體也可被視為本發(fā)明抗體的一種抗原結(jié)合片 段。
[0078] 此外，通過控制其中聚糖與本發(fā)明抗體結(jié)合的糖基化，提高抗體-依賴性細胞毒 活性是可能的。關(guān)于控制抗體糖基化的技術(shù)，已知WO 99/54342、W0 00/61739、W0 02/31140 等。然而，所述技術(shù)并不限于此。
[0079] 在通過首先分離抗體基因然后將基因引入適當宿主生產(chǎn)抗體的情況下，可使用適 當宿主與適當表達載體的組合。抗體基因的具體實例包括編碼本說明書中所述抗體重鏈序 列的基因與編碼其輕鏈序列的基因的組合。當轉(zhuǎn)化宿主細胞時，將重鏈序列基因和輕鏈序 列基因插入同一表達載體是可能的，分別插入不同表達載體也是可能的。在真核細胞用作 宿主的情況下，可使用動物細胞、植物細胞和真核微生物。作為動物細胞，哺乳動物細胞，例 如，猿猴COS細胞的（Gluzman, Y.，Cell, (1981) 23，175-182頁，ATCC CRL-1650)的二 氫葉酸還原酶-缺陷型細胞株（Urlaub, G?和0^8；[11，1^六.，？1'0(3.似1:1.六。3(1.3。;[. USA (1980) 77，4126-4220 頁）、鼠成纖維細胞NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658)和中國倉鼠 卵巢細胞（CH0細胞；ATCC: CCL-61)可作為例示。此外，在使用原核細胞的情況下，例如， 大腸桿菌和枯草芽孢桿菌可作為例示。通過轉(zhuǎn)化將靶抗體基因引入這些細胞，并體外培養(yǎng) 如此轉(zhuǎn)化的細胞，可獲得抗體。在上述培養(yǎng)方法中，產(chǎn)率可有時根據(jù)抗體序列而不同，因此， 通過使用產(chǎn)率作為指標在具有類似結(jié)合活性的抗體中選擇容易作為藥物生產(chǎn)的一種抗體 是可能的。
[0080] 對本發(fā)明抗體的同種型無限制，其實例包括IgG (IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、 IgA (IgAl、IgA2)、IgD和IgE，其優(yōu)選實例包括IgG和IgM，其進一步更優(yōu)選的實例包括IgGl 和 IgG2。
[0081] 此外，本發(fā)明抗體可為具有抗體的抗原結(jié)合位點的抗體的抗原結(jié)合片段或其修飾 片段?？贵w片段可通過用蛋白酶例如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶處理抗體或根據(jù)基因工程技 術(shù)修飾抗體基因并在合適的培養(yǎng)細胞中表達修飾基因獲得。在這些抗體片段中，具有全長 抗體分子的所有或一些功能的片段可被稱為抗體的抗原結(jié)合片段。作為抗體的功能，通常 抗原結(jié)合活性、中和抗原活性的活性、增加抗原活性的活性、抗體-依賴性細胞毒活性、補 體-依賴性細胞毒活性和補體-依賴性細胞的細胞毒活性可作為例示。本發(fā)明抗體的抗原 結(jié)合片段的功能為結(jié)合涎免凝集素-15的活性，優(yōu)選抑制破骨細胞形成的活性，更優(yōu)選抑 制破骨細胞細胞融合過程的活性。
[0082] 抗體片段的實例包括Fab、F (ab'）2、Fv、單鏈Fv (scFv)(其中重鏈和輕鏈的Fv 分子經(jīng)由適當接頭連接）、雙抗體（多種雙抗體）、線性抗體和由抗體片段組成的多特異性 抗體。此外，通過在還原條件下處理F(ab'）2獲得的抗體可變區(qū)的單價片段Fab'也被視為 抗體片段。
[0083] 此外，本發(fā)明抗體可為對至少兩種不同抗原具有特異性的多特異性抗體。一般而 言，這樣的分子與兩種抗原結(jié)合（例如，雙特異性抗體），然而，如本文所使用的"多特異性 抗體"包括對兩種或更多種（例如，三種）抗原具有特異性的抗體。
[0084] 本發(fā)明的多特異性抗體可為全長抗體或這樣的抗體的片段（例如，F(xiàn)(ab'）2雙 特異性抗體）。雙特異性抗體可通過連接兩種類型抗體的重鏈和輕鏈（HL對）生產(chǎn)，或 也可通過融合生產(chǎn)不同單克隆抗體的雜交瘤以制備生產(chǎn)雙特異性抗體的融合細胞來生產(chǎn) (Millstein 等，Nature (1983) 305，537-539 頁）。
[0085] 本發(fā)明抗體可為單鏈抗體（也稱為scFv)。單鏈抗體可通過經(jīng)由多肽接頭連接 抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)獲得（Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 (Rosenburg 和 Moore 編輯，Springer Verlag, New York, 269-315 頁 (1994)，Nature Biotechnology (2005)，23，1126-1136 頁）。此外，通過經(jīng)由多肽接頭 連接兩個scFv分子產(chǎn)生的BiscFv片段也可用作雙特異性抗體。
[0086] 生產(chǎn)單鏈抗體的方法在本【技術(shù)領域】已知（參見，例如，美國專利號4, 946, 778、 5,260,203、5,091，513、5,455,030等）。在該8〇?￥中，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)經(jīng)由不形 成綴合物的接頭，優(yōu)選經(jīng)由多肽接頭連接（Huston, J. S.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988)，85，5879-5883頁）。在scFv中，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)可從同一抗體或 不同抗體衍生。作為用于連接可變區(qū)的多肽接頭，例如，使用由12-19個殘基組成的給定單 鏈肽。
[0087] 編碼scFv的DNA可通過以下獲得：使用編碼整個氨基酸序列或期需的部分氨基酸 序列（選自上述抗體的重鏈或重鏈可變區(qū)和其輕鏈或輕鏈可變區(qū)）的DNA作為模板，通過 PCR方法使用限定其兩末端的引物對進行擴增，并通過將編碼多肽接頭部分的DNA與限定 其兩末端的引物對結(jié)合進一步進行擴增，以便將兩個末端分別連接至重鏈和輕鏈。
[0088] 此外，一旦生產(chǎn)編碼scFv的DNA，包含該DNA的表達載體和被該表達載體轉(zhuǎn)化的宿 主可根據(jù)通用程序獲得。此外，通過使用所得宿主，可根據(jù)通用程序獲得scFv。其抗體片段 可通過以與上述相同的方式獲得基因并表達該基因在宿主細胞中生產(chǎn)。
[0089] 本發(fā)明抗體可進行多聚化以增加其抗原親和性。待多聚化的抗體可為一種類型的 抗體或識別同一抗原多個表位的多種抗體。作為多聚化抗體的方法，IgG CH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合 兩種scFv分子、結(jié)合鏈霉親和素、引入螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序等可作為例示。
[0090] 本發(fā)明抗體可為多克隆抗體，其為具有不同氨基酸序列的多種類型抗-涎免凝集 素-15抗體的混合物。作為多克隆抗體的一個實例，具有不同CDR的多種類型的抗體的混 合物可作為例示。作為這樣的多克隆抗體，培養(yǎng)生產(chǎn)不同抗體的細胞的混合物，并且可使用 從所得培養(yǎng)物純化的抗體（參見WO 2004/061104)。
[0091] 還可使用與作為抗體修飾物質(zhì)的任何各種類型分子（例如聚乙二醇（PEG))結(jié)合 的抗體。
[0092] 此外，本發(fā)明抗體可為任何這些抗體與另一種藥劑之間形成的綴合物形式（免疫 綴合物）。這樣的抗體的實例包括其中抗體與放射性物質(zhì)或具有藥理學作用的化合物綴合 的抗體（Nature Biotechnology (2005) 23，1137-1146 頁）。
[0093] 所獲抗體可純化為同質(zhì)的。抗體的分離和純化可使用常規(guī)的蛋白分離和純化方 法進行。例如，可通過適當?shù)剡x擇和結(jié)合柱色譜法、濾膜過濾、超濾、鹽沉淀、透析、制備 型聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點聚焦電泳等分離和純化抗體（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual (用于蛋白純化 和表征的策略：實驗室課程手冊），Daniel R. Marshak等編輯，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual (抗體：實驗室手冊）? Ed Harlow 和 David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988))，但該方法不限于此。
[0094] 這樣的色譜法的實例包括親和色譜法、離子交換色譜法、疏水色譜法、凝膠過濾色 譜法、反相色譜法和吸附色譜法。這樣的色譜法可使用液相色譜例如HPLC或FPLC進行。 作為親和色譜法中使用的柱，蛋白A柱和蛋白G柱可作為例示。例如，作為使用蛋白A柱的 柱，Hyper D、P0R0S、Sepharose FF (Pharmacia)等可作為例示。此外，通過使用具有抗原 固定化于其上的載體，也可使用抗體與抗原的結(jié)合活性純化抗體。
[0095] 4.包含抗-涎免凝集素-15抗體的藥物 從通過上述部分"3.抗-涎免凝集素-15抗體的生產(chǎn)"中所述方法獲得的抗-涎免凝 集素-15抗體可獲得中和涎免凝集素-15生物學活性的抗體。中和涎免凝集素-15生物 學活性的此種抗體在體內(nèi)抑制涎免凝集素-15的生物學活性，S卩，破骨細胞的分化和/或成 熟，因此可作為藥物用作破骨細胞異常分化和/或成熟導致的骨代謝異常的治療和/或預 防劑。骨代謝異常可為特征在于凈骨質(zhì)流失（骨質(zhì)減少或骨質(zhì)溶解）的任何病癥。一般而 言，通過抗-涎免凝集素-15抗體治療和/或預防適用于其中需要抑制骨吸收的情況?？?用抗-涎免凝集素-15抗體治療和/或預防的骨代謝異常的實例包括骨質(zhì)疏松癥（絕經(jīng)后 骨質(zhì)疏松癥、老年性骨質(zhì)疏松癥、使用治療劑例如留類或免疫抑制劑引起的繼發(fā)性骨質(zhì)疏 松癥或伴隨類風濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥）、伴隨類風濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)破壞、癌性高鈣血 癥、伴隨多發(fā)性骨髓瘤或癌癥轉(zhuǎn)移至骨骼的骨質(zhì)破壞、巨細胞瘤、骨質(zhì)減少、牙周炎引起的 牙損失、假關(guān)節(jié)周圍的骨質(zhì)溶解、慢性骨髓炎中的骨質(zhì)破壞、骨佩吉特氏病、腎性骨營養(yǎng)不 良和成骨不全，然而，骨代謝異常不限于此，只要其為伴隨破骨細胞導致的凈骨質(zhì)流失的疾 病即可。用作上述藥物的抗-涎免凝集素-15抗體的實例包括從#32A1抗體產(chǎn)生的人源化 抗體及其⑶R-修飾的抗體。
[0096] 抗-涎免凝集素-15抗體中和涎免凝集素-15生物學活性的體外活性可通過，例 如，抑制過表達涎免凝集素-15的細胞分化為破骨細胞的活性測定。例如，將不同濃度的 抗-涎免凝集素-15抗體加入小鼠單核細胞-衍生的細胞系RAW 264. 7細胞或RAW 264 細胞，可測定抑制通過用RANKL或TNF-a刺激的向破骨細胞分化的活性。此外，將不同濃 度的抗-涎免凝集素-15抗體加入骨髓-衍生的原代培養(yǎng)細胞，可測定抑制通過用RANKL、 TNF-a或活性維生素仏刺激的向破骨細胞分化的活性。此外，將不同濃度的抗-涎免凝 集素-15抗體加入正常人破骨細胞前體細胞（正常人天然破骨細胞前體細胞,可從Sanko Junyaku Co.，Ltd.獲得，Cat. No. 2T-110)，可測定抑制通過用RANKL和M-CSF刺激的 向破骨細胞分化的活性。對破骨細胞分化的此種抑制作用可通過使用對破骨細胞耐酒石酸 鹽酸性磷酸酶（TRAP)活性的抑制作為指標測定。此外，對破骨細胞分化的抑制作用還可 通過使用對形成TRAP-陽性多核破骨細胞的抑制，即對破骨細胞細胞融合的抑制作為指標 測定。此外，在利用凹坑測定（pit assay) (Takada 等，Bone and Mineral, (1992) 17， 347-359)使用股骨-和/或脛骨-衍生的細胞的實驗中，體外抑制破骨細胞骨吸收的活性 可通過將不同濃度的抗-涎免凝集素-15抗體加入股骨-和/或脛骨-衍生的細胞中并在 牙質(zhì)切片上觀察凹坑形成來測定。作為用于測定體外抑制破骨細胞骨吸收活性的系統(tǒng)，使 用用銪_綴合人膠原包覆的板也是可能的。使用實驗動物，抗-涎免凝集素-15抗體對骨 代謝異常的體內(nèi)治療或預防作用可通過，例如，給予骨質(zhì)疏松癥動物模型或過表達涎免凝 集素-15的轉(zhuǎn)基因動物抗-涎免凝集素-15抗體并測量破骨細胞的任何變化確認。骨質(zhì)疏 松癥動物模型的實例為卵巢切除大鼠和卵巢切除猴子。抗-涎免凝集素-15抗體對骨吸收 活性的抑制作用可通過給予這樣的實驗動物抗-涎免凝集素-15抗體然后測量骨礦物密度 或骨代謝標志物測定。骨代謝標志物的實例包括，但不限于，骨吸收標志物例如尿脫氧吡啶 啉（deoxypyridinoline)、尿I型膠原的N-端肽（NTX)、尿I型膠原的C-端肽（CTX)、血液 NTX、血液CTX和血液耐酒石酸鹽酸性磷酸酶（TRAP5b)，和骨形成標志物例如血液骨堿性磷 酸酶（BAP)、血液骨鈣素（BGP)和I型前膠原C-肽（PlNP)。
[0097] 所獲得的中和涎免凝集素-15生物學活性的抗體，可用作藥物，特別地用作治療 或預防骨代謝異常例如骨質(zhì)疏松癥、伴隨類風濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)破壞或伴隨癌癥轉(zhuǎn)移至骨 骼的骨質(zhì)破壞的藥物組合物，或用作免疫診斷此類疾病的抗體。
[0098] 在類風濕性關(guān)節(jié)炎（RA)的治療中，一個主要問題為伴隨該疾病發(fā)生的骨質(zhì)流失。 據(jù)報道破骨細胞在伴隨RA的此種骨質(zhì)流失中發(fā)揮主要作用。認為造成破骨細胞誘導（分 化和成熟）和活化以及RA中的骨質(zhì)破壞的最重要的細胞因子為RANKL和TNF- a (RomasE.等，Bone 30，pp. 340-346，2002)。RANKL 的誘餌受體 0CIF/0PG 可抑制 RANKL 誘導的 破骨細胞形成但不抑制TNF-a誘導的破骨細胞形成。另一方面，本發(fā)明抗-涎免凝集素-15 抗體有效抑制RANKL和TNF- a二者誘導的破骨細胞形成。因此，預期本發(fā)明抗-涎免凝集 素-15抗體可比RANKL阻斷劑（0CIF/0PG、抗-RANKL抗體等）更強烈地抑制RA中TNF- a 誘導的骨質(zhì)流失和骨質(zhì)破壞等。
[0099] 作為一個實例，用于治療或預防骨代謝異常，抗-涎免凝集素-15抗體可單獨或與 至少一種其它骨疾病治療劑組合給予。作為另一個實例，抗-涎免凝集素-15抗體可與治 療有效量的骨代謝異常治療劑組合給予?？膳c抗-涎免凝集素-15抗體組合給予的其它治 療劑的實例包括，但不限于二膦酸鹽（例如，阿侖膦酸鹽、依替膦酸鹽、伊班膦酸鹽、伊卡膦 酸鹽、帕米膦酸鹽、利塞膦酸鹽和唑來膦酸鹽）、活性維生素 D3、降鈣素及其衍生物、激素例 如雌二醇、SERM (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑）、依普黃酮、維生素 K2 (四烯甲萘醌）、鈣制 劑、PTH (甲狀旁腺素）、非留類抗炎劑（例如，塞來考昔和羅非考昔）、可溶性TNF受體（例 如，依那西普）、抗-TNF-a抗體或抗體的抗原結(jié)合片段（例如，英夫利昔單抗）、抗-PTHrP (甲狀旁腺素-相關(guān)蛋白）抗體或抗體的抗原結(jié)合片段、IL-I受體拮抗劑（例如，阿那白滯 素）、抗-IL-6受體抗體或抗體的抗原結(jié)合片段（例如，托珠單抗）、抗-RANKL抗體或抗體的 抗原結(jié)合片段（例如，地舒單抗）和OCIF (破骨細胞形成抑制因子）。根據(jù)骨代謝異常的 狀態(tài)或治療和/或預防的預期程度，可給予兩種或三種或更多種類型的其它治療劑，這些 其它治療劑可以通過將其包封在同一制劑中一起給予。其它治療劑和抗-涎免凝集素-15 抗體也可通過將其包封在同一制劑中一起給予。另外，抗-涎免凝集素-15抗體和其它治 療劑也可通過將其包封在分開的制劑中一起給予。此外，其它治療劑和抗-涎免凝集素-15 抗體還可接連地單獨給予，即，給予其它治療劑后可給予包含抗-涎免凝集素-15抗體或抗 體的抗原結(jié)合片段作為活性成分的治療劑，或給予包含抗-涎免凝集素-15抗體或抗體的 抗原結(jié)合片段作為活性成分的治療劑后，可給予其它治療劑。在給予基因治療的情況下，可 將用于骨疾病的蛋白質(zhì)治療劑的基因和抗-涎免凝集素-15抗體的基因插入同一啟動子區(qū) 域或不同啟動子區(qū)域的下游，并且可將其引入同一載體或不同載體。
[0100] 通過將骨疾病治療劑綴合到抗-涎免凝集素-15抗體或其片段，可生產(chǎn)如M. C. Garnet "Targeted drug conjugates: principles and progress (祀向藥物綴合物：原理 和進展）"，Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53，171-216 中所述的革巴向藥物 綴合物。為了達到該目的，除了抗體分子外，任何抗體片段均可適用，只要其不完全喪失識 別破骨細胞的能力即可，其實例包括片段例如Fab、F(ab'）2和Fv。在本發(fā)明中，抗體和片段 可以以相同的方式使用?？?涎免凝集素-15抗體或其片段與骨疾病治療劑形成的綴合物 可為M. C. Garnet "Targeted drug conjugates: principles and progress (革巴向藥物 綴合物：原理和進展）"，Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53，171-216，G. T. Hermanson "Bioconjugate Techniques (生物綴合技術(shù)），' Academic Press, California (1996), Putnam和 J. Kopecek "Polymer conjugates with Anticancer Activity (具有 抗癌活性的多聚體綴合物）" Advances in Polymer Science (1995) 122，55-123等中所 述任何各種不同形式。例如，其中抗-涎免凝集素-15抗體與骨疾病治療劑直接或經(jīng)由間 隔基例如寡肽彼此化學綴合的綴合物和經(jīng)由適當藥物載體形成的綴合物。藥物載體的實例 包括脂質(zhì)體和水溶性多聚體。經(jīng)由這樣的藥物載體形成的綴合物的更特別的實例包括其中 將抗體與骨疾病治療劑包含入脂質(zhì)體中并且脂質(zhì)體與抗體彼此綴合的綴合物，和其中骨疾 病治療劑與水溶性多聚體（具有分子量約1，000-100, 〇〇〇的化合物）直接或經(jīng)由間隔基例 如寡肽彼此化學綴合并且抗體與水溶性多聚體綴合的綴合物?？贵w（或其片段）與骨疾病 治療劑或藥物載體例如脂質(zhì)體或水溶性多聚體的綴合可通過本領域技術(shù)人員已知的方法 例如 G. T. Hermanson "Bioconjugate Techniques (生物綴合技術(shù)）" Academic Press, California (1996), Putnam 和 J. Kopecek "Polymer conjugates with Anticancer Activity (具有抗癌活性的多聚體綴合物）" Advances in Polymer Science (1995) 122， 55-123中所述方法達成。將骨疾病治療劑包含入脂質(zhì)體中可通過本領域技術(shù)人員已知的 方法例如D. D. Lasic "Liposomes: From Physics to Applications (脂質(zhì)體：從物理學 到應用）" Elsevier Science Publishers B. V.，Amsterdam (1993)中所述方法等達成。 骨疾病治療劑與水溶性多聚體的綴合可通過本領域技術(shù)人員已知的方法例如D. Putnam和 J. Kopecek "Polymer conjugates with Anticancer Activity (具有抗癌活性的多聚體 綴合物）" Advances in Polymer Science (1995) 122，55-123 中所述方法達成。除上述 方法外，抗體（或其片段）與骨疾病蛋白治療劑（或其片段）的綴合物可通過本領域技術(shù) 人員已知的方法通過基因工程生產(chǎn)。
[0101] 本發(fā)明還提供包含治療和/或預防有效量的抗-涎免凝集素-15抗體和藥學上可 接受的稀釋劑、載體、增溶劑、乳化劑、防腐劑和/或佐劑的藥物組合物。
[0102] 本發(fā)明還提供包含治療和/或預防有效量的抗-涎免凝集素-15抗體、治療和/ 或預防有效量的至少一種骨疾病治療劑和藥學上可接受的稀釋劑、載體、增溶劑、乳化劑、 防腐劑和/或佐劑的藥物組合物。骨疾病治療劑的實例包括，但不限于，二膦酸鹽（例如阿 侖膦酸鹽、依替膦酸鹽、伊班膦酸鹽、伊卡膦酸鹽、帕米膦酸鹽、利塞膦酸鹽和唑來膦酸鹽）、 活性維生素 D3、降鈣素及其衍生物、激素例如雌二醇、SERM (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑）、依 普黃酮、維生素 K2 (四烯甲萘醌）、鈣制劑、PTH (甲狀旁腺素）、非留類抗炎劑（例如塞來 考昔和羅非考昔）、可溶性TNF受體（例如依那西普）、抗-TNF-抗體或抗體的抗原結(jié)合片 段（例如英夫利昔單抗）、抗-PTHrP (甲狀旁腺素-相關(guān)蛋白）抗體或抗體的抗原結(jié)合片 段、IL-I受體拮抗劑（例如阿那白滯素）、抗-IL-6受體抗體或抗體的抗原結(jié)合片段（例如 托珠單抗）、抗-RANKL抗體或抗體的抗原結(jié)合片段（例如地舒單抗）和OCIF (破骨細胞形 成抑制因子）。
[0103] 本發(fā)明藥物組合物可接受的制劑中使用的物質(zhì)優(yōu)選對依據(jù)劑量和濃度給予藥物 組合物的個人無毒。
[0104] 本發(fā)明藥物組合物可包含用于藥學用途的能夠改變或維持其pH、滲透壓、粘度、 透明度、顏色、等滲性、無菌狀態(tài)、穩(wěn)定性、可溶性、釋放速率、吸收速率或滲透性的物質(zhì)。這 樣的藥學用途的物質(zhì)的實例包括，但不限于，氨基酸例如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰 胺、精氨酸和賴氨酸；抗微生物劑；抗氧化劑例如抗壞血酸、硫酸鈉和亞硫酸氫鈉；緩沖劑 例如磷酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽緩沖劑、碳酸氫鈉和Tris-HCl溶液；填充劑例如甘露醇和甘 氨酸；螯合劑例如乙二胺四乙酸鹽（EDTA);絡合劑例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷、￠-環(huán)糊精 和羥丙基-P -環(huán)糊精；膨脹劑例如葡萄糖、甘露糖和糊精；其它碳水化合物例如單糖和二 糖；著色劑；矯味劑；稀釋劑；乳化劑；親水多聚體例如聚乙烯吡咯烷；防腐劑例如低分子 量多肽、鹽形成反荷離子、苯扎氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、 對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸和過氧化氫；溶劑例如甘油、丙二醇和聚乙二醇；糖醇 例如甘露醇和山梨醇；懸浮劑；表面活性劑例如脫水山梨糖醇酯、聚山梨酸酯（例如聚山梨 酸酯20和聚山梨酸酯80)、Triton、氨丁三醇、卵磷脂和膽固醇；穩(wěn)定性增強劑例如蔗糖和 山梨醇；彈性增強劑例如氯化鈉、氯化鉀和甘露醇及山梨醇；運載劑；賦形劑；和/或藥物 佐劑。這些物質(zhì)用于藥學用途所添加的量優(yōu)選為抗-涎免凝集素-15抗體重量的0. 01-100 倍，特別地優(yōu)選〇. 1-10倍。本領域技術(shù)人員可根據(jù)組合物所應用的疾病、應用的給藥途徑 等適當確定制劑中藥物組合物的優(yōu)選配方。
[0105] 藥物組合物中的賦形劑或載體可為液體或固體形式。適當?shù)馁x形劑或載體可為可 注射水、生理鹽水、人工腦脊液或通常用于胃腸外給予的另一種物質(zhì)。此外，中性生理鹽水 或包含血清白蛋白的生理鹽水也可用作載體。藥物組合物可包含pH 7. 0-8. 5的Tris緩沖 劑、pH 4. 0-5. 5的醋酸鹽緩沖劑或pH 3. 0-6. 2的檸檬酸鹽緩沖劑。此外，這樣的緩沖劑可 添加山梨醇或其它化合物。本發(fā)明藥物組合物的實例包括包含抗-涎免凝集素-15抗體 的藥物組合物和包含抗-涎免凝集素-15抗體以及至少一種骨疾病治療劑的藥物組合物。 本發(fā)明藥物組合物以凍干產(chǎn)物或液體形式制備為具有所選組成和所需純度的藥物。包含 抗-涎免凝集素-15抗體的藥物組合物和包含抗-涎免凝集素-15抗體及至少一種骨代謝 異常治療劑的藥物組合物也可使用適當?shù)馁x形劑例如蔗糖形成凍干產(chǎn)物。
[0106] 可制備本發(fā)明藥物組合物用于胃腸外給予或用于通過口服給予胃腸道吸收。制劑 的組成和濃度可根據(jù)給予方法確定。本發(fā)明藥物組合物中包含的抗-涎免凝集素-15抗體 對涎免凝集素-15的親和性越高，S卩，其對涎免凝集素-15的解離常數(shù)（Kd值）越低，抗-涎 免凝集素-15抗體可顯示的藥效越多，甚至當降低用于人的劑量時。因此，本發(fā)明藥物組合 物用于人的劑量也可基于此考慮確定。關(guān)于劑量，在將人抗-涎免凝集素-15抗體給予人 的情況下，抗體可以以每卜180天一次約0. 1-100 mg/kg的劑量給予。
[0107] 本發(fā)明藥物組合物的劑型的實例包括注射劑（包括輸液）、栓劑、鼻劑、舌下劑、經(jīng) 皮吸收劑。 實施例
[0108] 后文中，本發(fā)明將參考實施例更具體地描述，然而，本發(fā)明并不限于此。應注意的 是，下列實施例中關(guān)于基因處理的各個操作根據(jù)〃分子克隆〃（Sambrook, J.，F(xiàn)ritsch, E. F?和 Maniatis, T?著，Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989 年出版）中所述 方法進行，或在使用可市售獲得的試劑或試劑盒的情況下，根據(jù)其中所附的方案使用，除非 另外說明。
[0109] 參考實施例1 人源化#32A1抗體K3-1115基因的生產(chǎn) 在本說明書中，作為在比較試驗中用作對照的抗體，使用WO 2010/117011中所述的 h#32Al-Hl-l/L2-15。該抗體基因可根據(jù)WO 2010/117011生產(chǎn)。順便提及，在本說明書中， 上述 h#32Al-Hl-l/L2-15 抗體被稱為 "K3-1115" 或 "K3-1115 抗體"。
[0110] K3-1115重鏈的氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 2表不。包含SEQ ID NO: 2氨基酸序列的氨基酸殘基1-19的序列、包含其氨基酸殘基20-140的序列和包含其氨基酸 殘基141-466的序列，分別對應于信號序列、重鏈可變區(qū)和重鏈恒定區(qū)。編碼SEQ ID NO: 2 氨基酸序列的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 1表示。包含SEQ ID NO: 1核苷酸序 列的核苷酸1-57的序列、包含其核苷酸58-420的序列和包含其核苷酸421-1398的序列， 分別編碼信號序列、重鏈可變區(qū)序列和重鏈恒定區(qū)序列。SEQ ID NO: 1的核苷酸序列和SEQ ID NO: 2的氨基酸序列在圖1中示出。
[0111] K3-1115輕鏈的氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 4表示。包含SEQ ID NO: 4氨基酸序列的氨基酸殘基1-20的序列、包含其氨基酸殘基21-133的序列和包含其氨基酸 殘基134-238的序列，分別對應于信號序列、輕鏈可變區(qū)和輕鏈恒定區(qū)。編碼SEQ ID NO: 4 氨基酸序列的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 3表示。包含SEQ ID NO: 3核苷酸序 列的核苷酸1-60的序列、包含其核苷酸61-399的序列和包含其核苷酸400-714的序列，分 別編碼信號序列、輕鏈可變區(qū)序列和輕鏈恒定區(qū)序列。SEQ ID NO: 3的核苷酸序列和SEQ ID NO: 4的氨基酸序列在圖2中示出。
[0112] 實施例1 將T103E突變引入K3-1115基因（表達構(gòu)建體的產(chǎn)生） 由于涎免凝集素-15為堿性蛋白，因此預期用抗原與抗體之間的新離子鍵可改善結(jié) 合親和性，這通過向抗體序列中引入酸性氨基酸殘基例如天冬氨酸或谷氨酸獲得。設計了 其中將谷氨酸殘基（其為酸性氨基酸并具有長側(cè)鏈）在位于CDRH3環(huán)（被認為是抗體識 別位點最重要的CDR并且基于X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析推測面向抗原）中心的蘇氨酸殘基 位置處引入抗體的置換突變。作為引入置換的重鏈序列，選擇了 K3-1115重鏈，并且將其 中K3-1115重鏈序列的CDRH3序列第3位氨基酸殘基蘇氨酸殘基用谷氨酸殘基置換的重 鏈序列命名為"K3-1115/T103E重鏈"。氨基酸殘基的置換位點對應于已除去信號序列的 K3-1115重鏈序列的第103位。順便提及，"K3-1115/T103E重鏈"有時被稱為"K3-1115/ T103E抗體重鏈"。
[0113] 通過使用WO 2010/117011實施例28中所述pEG2/h#32Al-Hl-l作為模板， 并且還使用例如 QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Inc.)和下列引物對，根據(jù)試劑盒所附方案進行堿基置換，借此可構(gòu)建 K3-1115/T103E重鏈表達載體。獲得的表達載體命名為"pEG2/K3-1115/T103E"。
[0114] 用于引入堿基置換的引物對 5' -CTACTACTGCGCCAGGTCCTTGGAGGGCGGCGAC-3'（32Al_HT103EFw:序列表中 SEQ ID NO: 15) 5' -GTCGCCGCCCTCCAAGGACCTGGCGCAGTAGTAG-3'（32Al_HT103ERv:序列表中 SEQ ID NO: 16) K3-1115/T103E重鏈的氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 6表示。包含SEQ ID NO: 6氨基酸序列的氨基酸殘基1-19的序列、包含其氨基酸殘基20-140的序列和包含其氨基酸 殘基141-466的序列，分別對應于信號序列、重鏈可變區(qū)和重鏈恒定區(qū)。編碼SEQ ID NO: 6 氨基酸序列的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 5表示。包含SEQ ID NO: 5核苷酸序 列的核苷酸1-57的序列、包含其核苷酸58-420的序列和包含其核苷酸421-1398的序列， 分別編碼信號序列、重鏈可變區(qū)序列和重鏈恒定區(qū)序列。SEQ ID NO: 5的核苷酸序列和SEQ ID NO: 6的氨基酸序列在圖3中示出。
[0115] 實施例2 K3-1115抗體和K3-1115/T103E抗體的制備 2-1) K3-1115抗體和K3-1115/T103E抗體的生產(chǎn) 抗體根據(jù)下列方法或其改良方法生產(chǎn)。根據(jù)方案傳代培養(yǎng)和培養(yǎng)FreeStyle 293F 細胞（Invitrogen Corporation)。將對數(shù)生長期的 FreeStyle 293F 細胞（Invitrogen Corporation)的 1.2 X IO9 個細胞接種在 3_L Fernbach Erlenmeyer Flask (Corning Incorporated)中并通過用 FreeStyle 293 表達培養(yǎng)基（Invitrogen Corporation)稀釋以 1.0 X IO6細胞/ml制備，然后，在8% CO2培養(yǎng)箱中37°C 90 rpm震蕩培養(yǎng)1小時。將3. 6 mg 聚乙烯亞胺（Polyscience #24765)溶解在 20 ml Opti-Pro SFM 培養(yǎng)基（Invitrogen Corporation)中。接著，將使用 NucleoBond Xtra (TaKaRa Bio, Inc.)制備的重鏈表達載 體（0.4 mg)和輕鏈表達載體（0.8 mg)懸浮在20 ml Opti-Pro SFM培養(yǎng)基（Invitrogen Corporation)中。然后，將20 ml所獲表達載體/Opti-Pro SFM混合物加入20 ml所獲聚 乙烯亞胺/Opti-Pro SFM混合物中，輕輕攪拌所得混合物，然后放置5分鐘。其后，將混合 物加入Freestyle 293F細胞，并在8% 0)2培養(yǎng)箱中37°C 90 rpm震蕩培養(yǎng)7天。將所得 培養(yǎng)上清過濾通過一次性囊式過濾器（Advantec #CCS-045_E1H)。
[0116] 在上述培養(yǎng)中，通過組合WO 2010/117011中所述重鏈表達載體pEG2/ h#32Al-Hl-l 和輕鏈表達載體 pEF6KCL/h#32Al-L2-15,可生產(chǎn) K3-1115 抗體。
[0117] 此外，通過組合實施例1中生產(chǎn)的重鏈表達載體PEG2/K3-1115/T103E和WO 2010/117011中所述輕鏈表達載體pEF6KCL/h#32Al-L2-15,可生產(chǎn)大鼠抗-人涎免凝集 素-15單克隆抗體#32A1的人源化抗體的單-氨基酸殘基置換變體。將單-氨基酸殘基置 換變體命名為"K3-1115/T103E"，在本說明書中，"K3-1115/T103E"有時被稱為"K3-1115/ T103E抗體"。如上述抗體制備方法中所述，K3-1115抗體與K3-1115/T103E抗體的輕鏈序 列相同。即，K3-1115抗體與K3-1115/T103E抗體之間，僅重鏈的⑶RH3中的一個氨基酸殘 基不同。
[0118] 2-2) K3-1115 和 K3-1115/T103E 抗體的純化 K3-1115和K3-1115/T103E抗體根據(jù)下列方法或其改良方法純化。
[0119] 上述2-1)中獲得的培養(yǎng)上清液經(jīng)受兩步過程純化，包括r蛋白A親和色譜（于 4-6°C )和陶瓷羥基磷灰石（于室溫）。1蛋白A親和色譜純化后和陶瓷羥基磷灰石純化 后的緩沖液更換步驟在室溫下進行。首先，將1100-1200 ml培養(yǎng)上清液施加到用PBS平 衡的 MabSelect SuRe (GE Healthcare Bio-Sciences Ltd?制造 ，2 X I ml HiTrap 柱 串聯(lián)）。所有培養(yǎng)溶液均倒入柱中后，用15-30 ml PBS洗滌柱。隨后，用2 M鹽酸精氨酸 溶液（pH 4.0)進行洗脫，收集包含抗體的級分。收集的級分使用脫鹽柱（GE Healthcare Bio-Sciences Ltd?制造，2 X 5 ml HiTrap 脫鹽柱串聯(lián)）用包含 5 mM磷酸鈉、50 mM MES 和20 mM NaCl的緩沖液（pH 6. 5)進行緩沖液更換。此外，將更換緩沖液的抗體溶液施加 到用包含5 mM NaPi、50 mM MES和20 mM NaCl的緩沖液（pH 6. 5)平衡的陶瓷羥基磷灰石 柱（Bio-Rad Laboratories, Inc. (Japan), Bio-Scale CHT2-1 輕基憐灰石柱（2 ml 體 積））。然后，進行氯化鈉線性濃度梯度洗脫，并收集包含抗體的級分。所收集級分使用脫 鹽柱（GE Healthcare Bio-Sciences Ltd?制造，2 X 5 ml HiTrap 脫鹽柱串聯(lián)）用 CBS (包含140 mM氯化鈉的10 mM檸檬酸鹽緩沖液，pH 6.0)進行液體更換。最后，所得溶液使 用 Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN 20 (分級分子量：30 K, Sartorius Co.， Ltd.，于4°C )濃縮，將IgG的濃度調(diào)整至I. 0 mg/ml或更高，由此獲得的溶液被用作純樣 品。
[0120] 實施例3 K3-1115/T103E抗體與人涎免凝集素-15蛋白的結(jié)合親和性的評估 3-1)人涎免凝集素-15 V-set結(jié)構(gòu)域的表達和純化 將編碼其中His標簽和因子Xa識別序列連接到人涎免凝集素-15 V-set結(jié)構(gòu)域（包 含NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫登記號NP_998767的氨基酸序列的氨基酸殘基39-165的多肽）的 N-末端一側(cè)的蛋白的 DNA 整合至載體 pDEST14 (Invitrogen, Corporation, Cat. No. 11801-016)。通過使用該質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 Rosetta-gamiB (DE3) (Novagen, Inc., Cat. No. 71136-4)并在 TB 培養(yǎng)基（Invitrogen, Corporation, Cat. No. 22711-022) 中培養(yǎng)。培養(yǎng)后，細菌細胞通過超聲均質(zhì)化，將所得勻漿離心，上清液使用HisTrap HP 柱（GE Healthcare Ltd.，Cat. No. 17-5247-01)進行純化。其后，用因子 Xa (New England BioLabs Inc.，Cat. No. P8010L)切割 His 標簽，然后使用 Mono S5/50 GL 柱 (GE Healthcare Ltd.，Cat. No. 17-5168-01)和 Superdex 75 10/300 柱（GE Healthcare Ltd.，Cat. No. 17-5174-01)純化人涎免凝集素-15 V-set結(jié)構(gòu)域，直至通過電泳獲得分 子量14 kDa的單一條帶。
[0121] 3-2) K3-1115或K3-1115/T103E與人涎免凝集素-15 V-set結(jié)構(gòu)域之間解離常數(shù) 的測量 K3-1115或K3-1115/T103E抗體與人涎免凝集素-15 (39-165) V-set結(jié)構(gòu)域之間的解 離常數(shù)使用Biacore T2〇0 (GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.)通過固定抗體作為配體 并使用抗原作為分析物測量。K3-1115或K3-1115/T103E抗體以約50 RU通過胺偶聯(lián)方法 經(jīng)由固定在其上的抗-人IgG抗體（GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.)結(jié)合到傳感器芯 片 CM5 (GE Healthcare Bio-Sciences Ltd.)上。作為運行緩沖液，使用 HBS-EP+ (10 mM HEPES pH 7. 4，0. 15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.05%表面活性劑P20)。在具有抗體結(jié)合到其 上的芯片上，以90 ii L/min的流速加入稀釋系列的抗原溶液（0. 003-7 nM) 233秒，隨后監(jiān) 測解離相2000-3600秒。作為再生溶液，以10 iiL/min的流速加入3 M MgCl2 30秒。在 數(shù)據(jù)分析中，使用分析軟件（Biacore T200 Evaluation軟件，版本1.0)的1:1結(jié)合模型， 計算結(jié)合速率常數(shù)（kon)、解離速率常數(shù)（koff)和解離常數(shù)（KD; KD = koff/kon)。結(jié)果， K3-1115 具有 2. 6E-10 [M]的 KD 值，K3-1115/T103E 具有 4. IE-12 [M]的 KD 值，并且顯示 通過置換一個氨基酸殘基，K3-1115/T103E的親和性相比K3-1115的親和性提高約60倍。 順便提及，作為K3-1115的單-氨基酸置換變體，根據(jù)實施例2中所述方法或其改良方法生 產(chǎn)了 121種抗體，并根據(jù)實施例3中所述方法或其改良方法評估了與人涎免凝集素-15蛋 白的結(jié)合活性。在這些121種置換變體中，6種抗體顯示比K3-1115高的人涎免凝集素-15 蛋白親和性，K3-1115/T103E在這些抗體中顯示最高的親和性。
[0122] 實施例4 K3-1115/T103E抗體對小鼠破骨細胞形成的作用 從5-8周齡的雄性ddY小鼠切除股骨和脛骨并除去軟組織。切去股骨或脛骨的兩端， 使用具有25-號注射針的注射器注射D-PBS以排出骨髓細胞，將細胞收集在離心管中。室 溫100 g進行離心5分鐘，除去上清液。向所得細胞沉淀中加入I ml溶血緩沖液（紅細胞 裂解緩沖液，Sigma Co.，Ltd.制造）懸浮沉淀，所得懸浮液置于室溫5分鐘。向其中加入 20 ml D-PBS，并將懸浮液室溫100 g離心5分鐘，除去上清液。向所得細胞沉淀中加入10 ml 包含 5 ng/ml M-CSF (R&D Systems, Inc?制造）和 10% 胎牛血清（FBS)的 MEM- a 培 養(yǎng)基（Invitrogen, Corporation制造）懸浮沉淀。然后，所得懸浮液通過細胞過濾器（40 iim Nylon, BD Falcon制造）以除去聚集體。所得細胞轉(zhuǎn)移至75 cm2 T-燒瓶（用于粘附 型細胞的附著）并在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。過夜培養(yǎng)后，回收不粘附在T-燒瓶的細胞并 用作小鼠骨髓非粘附型細胞。通過上述方法制備的小鼠骨髓非粘附型細胞在包含10% FBS 和 10 ng/ml M-CSF (R&D Systems, Inc?制造）的 a-MEM 培養(yǎng)基中以 I. 5 X IO5 細胞/ml 制備，所得細胞制備物以200 ill的量接種在96-孔板的每個孔中，并在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 細胞2天。除去96-孔板中的舊培養(yǎng)溶液，向每個孔中加入100 ill MEM-a培養(yǎng)基，已向包 含 10% FBS 的該 100 ill MEM-a 培養(yǎng)基中加入人 RANKL (RANKL, P 印rotech, Inc?制造） 和M-CSF，分別得到20 ng/ml和10 ng/ml的終濃度。向細胞培養(yǎng)溶液中加入3-100 ng/ml 濃度的實施例2中所制備的K3-1115/T103E抗體，并在CO2培養(yǎng)箱中另外培養(yǎng)細胞3天。培 養(yǎng)完成后，通過下文所述程序測量所形成的破骨細胞的耐酒石酸鹽酸性磷酸酶（TRAP)活 性。吸去96-孔板每個孔中的培養(yǎng)溶液，并向每個孔中加入50 ill包含1% Triton X-100 的50 mM朽1檬酸鈉緩沖液（pH 6. 1)。然后，將板在板搖床上搖動5分鐘以裂解細胞。向每 個孔中加入50 ill底物溶液（包含5 mg/ml磷酸對硝基苯酯和0. 46%酒石酸鈉的50 mM 檸檬酸鈉緩沖液（pH 6. 1))，室溫孵育板10分鐘。孵育后，向96-孔板的每個孔中加入50 I N氫氧化鈉溶液以終止酶促反應。終止酶促反應后，測量每個孔405 nm處的吸光度， 并將所獲得的吸光度用作TRAP活性的指標。通過與未加抗體的情況比較TRAP活性，可估 計K3-1115/T103E抗體對小鼠破骨細胞形成的抑制作用。
[0123] 實施例5 K3-1115/T103E抗體對正常人破骨細胞的骨吸收活性的作用（體外生物學活性評估） 已知破骨細胞釋放蛋白酶例如組織蛋白酶K并降解骨組織的構(gòu)成成分I型膠原。 OsteoLyse測定試劑盒（Lonza, Inc?制造，Cat. No. PA-1500)提供用銪-綴合的人膠原 包覆的96-孔板（96-well OsteoLyse細胞培養(yǎng)板），當在該板中培養(yǎng)破骨細胞時通過測量 釋放在上清液中的熒光膠原片段的量體外評估破骨細胞的骨吸收活性是可能的。
[0124] 根據(jù)細胞所附方案將正常人破骨細胞前體細胞（正常人天然破骨細胞前體細胞， 購自 Sanko Junyaku Co.，Ltd.，Cat. No. 2T-110)以 I X IO4 細胞 / 孔接種在 96-孔 OsteoLyse細胞培養(yǎng)板上。順便提及，作為培養(yǎng)基，使用添加包含胎牛血清（終濃度：10%)、 人RANKL (終濃度：63. 8 ng/ml)、人M-CSF (終濃度：33 ng/ml)等的OPGM添加物集合 (supplement set)(購自 Sanko Junyaku Co.，Ltd.，Cat. No. PT-95Ol)的破骨細胞前 體細胞基礎培養(yǎng)基（0PBM，購自 Sanko Junyaku Co.，Ltd.，Cat. No. PT-8201)。向該培 養(yǎng)上清液中各自加入實施例2中制備的K3-1115抗體和K3-1115/T103E抗體，產(chǎn)生0. 8、4、 20或100 ng/ml的終濃度，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞5天。收集培養(yǎng)上清液的10- ii L等分 試樣，向其中加入200 UL OsteoLyse測定試劑盒中包含的熒光團釋放試劑，并使用熒光讀 板儀（ARVO MX, Perkin Elmer Inc?制造）測量熒光強度（激發(fā)：340 nm，發(fā)射：615 nm)， 從而測定釋放入培養(yǎng)上清液中的游離熒光膠原片段的量（圖5)。結(jié)果，K3-1115抗體在20 ng/ml-100 ng/ml范圍內(nèi)以濃度-依賴的方式降低游離膠原片段的量。另一方面，通過加 入K3-1115/T103E抗體，游離膠原片段的量在4 ng/ml-100 ng/ml的范圍內(nèi)以濃度-依賴 的方式降低。該結(jié)果顯示，與K3-1115抗體相比，K3-1115/T103E抗體強烈抑制較低濃度的 人破骨細胞的骨吸收活性。
[0125] 實施例6 使用卵巢切除大鼠對K3-1115/T103E抗體進行生物學評估 a)動物實驗方案 切除 12 周齡雌性 F344 大鼠（獲自 Charles River Laboratories Japan, Inc.)的雙 側(cè)卵巢，并將大鼠分為兩組：溶媒給予組，和K3-1115/T103E抗體給予組。此外，還準備一組 作為假手術(shù)組。在抗體給予組中，從手術(shù)的第二天腹膜內(nèi)給予I mg/kg劑量的實施例2中 所制備K3-1115/T103E抗體，每周三次，重復4周。在溶媒給予組和假手術(shù)組中，腹膜內(nèi)給 予作為溶媒的包含〇. 01%吐溫20的PBS。給予開始4周后，禁食條件下收集尿液24小時， 將尿液樣品儲存在_80°C直至測量。尿液收集完成后，大鼠被安樂死，并從每只大鼠切除腰 椎。
[0126] b)腰椎骨礦物密度測量 除去切除的腰椎上附著的軟組織，取出第4-第6塊腰椎。將取出的腰椎通過在乙醇中 搖動然后風干除油和脫水，使用骨密度計（DCS-600EX，Aloka Co.，Ltd.制造）測量骨礦物 密度。與假手術(shù)組相比在卵巢切除組中觀察到腰椎骨礦物密度顯著降低，然而，在K3-1115/ T103E抗體給予組中，卵巢切除引起的骨礦物密度降低受到顯著抑制。通過加入按照a)中 所述方案給予K3-1115抗體的一組，可比較K3-1115與K3-1115/T103E之間對骨礦物密度 現(xiàn)象的抑制作用。
[0127] c)尿脫氧吡啶啉排泄的測量 多種I型膠原交聯(lián)代謝產(chǎn)物尖銳地反映骨代謝更新，特別是骨吸收。尤其是，脫氧吡啶 啉主要位于骨膠原中，因此認為其作為骨吸收指標高度可靠。
[0128] 將冷凍保存的尿液樣品解凍，通過離心操作沉淀不溶解物質(zhì)，從而獲得上清液。使 用 Osteolinks "DH)"（DS Pharma Biomedical Co.，Ltd.制造）測量該上清液中包含的脫 氧批陡啉的量。此外，通過使用 Creatinine Test Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.制造），還測量了上清液中肌酸酐的量，并計算用肌酸酐校正的脫氧吡啶啉的量。與假 手術(shù)組相比，卵巢切除組的尿脫氧吡啶啉排泄顯著增加，因此，表明在卵巢切除大鼠中，破 骨細胞骨吸收增加。另一方面，在K3-1115/T103E抗體給予組中，卵巢切除引起的脫氧吡啶 啉排泄增加被抑制，使得脫氧吡啶啉排泄水平與假手術(shù)組類似。從這一結(jié)果，在動物模型中 還證實所研究的與涎免凝集素-15特異性結(jié)合的單克隆抗體抑制破骨細胞骨吸收，并且強 烈提示由于對骨吸收的抑制作用，卵巢切除大鼠中的腰椎骨礦物密度降低被抑制。通過加 入按照a)中所述方案給予K3-1115的一組，可比較K3-1115與K3-1115/T103E之間對骨礦 物密度現(xiàn)象的抑制作用。
[0129] 實施例7 使用卵巢切除猴子對K3-1115/T103E抗體進行生物學評估 K3-1115/T103E抗體在卵巢切除猴子中對骨吸收活性的抑制作用可通過下述方法評 估。
[0130] 切除7-15歲雌性食蟹猴的兩側(cè)卵巢，1個月后將猴子分為溶媒給予組和K3-1115/ T103E抗體給予組。在抗體給予組中，以單次劑量0. 1-30 mg/kg皮下給予實施例2中所制 備的K3-1115/T103E抗體。隨時間收集尿液和血液直至給予后2個月。通過測量尿液和血 液中的骨代謝標志物，評估了抗體抑制骨吸收的活性。骨代謝標志物的實例包括骨吸收標 志物例如尿I型膠原的N-端肽（NTX)、尿I型膠原的C-端肽（CTX)、血液NTX、血液CTX和 血液耐酒石酸鹽酸性磷酸酶（TRAP5b)，和骨形成標志物例如血液骨堿性磷酸酶（BAP)、血 液骨鈣素（BGP)和I型前膠原C-肽（PlNP)。
[0131] 工業(yè)適用性 本發(fā)明的人源化抗-涎免凝集素-15抗體的CDR-修飾變體具有比已知抗體高的抑制 破骨細胞分化或骨吸收活性的能力，包含抗-涎免凝集素-15抗體的藥物組合物可作為骨 代謝異常疾病的治療或預防劑。
[0132] 序列表自由文本 SEQ ID NO: I :K3-1115抗體重鏈的核苷酸序列 SEQ ID NO: 2:K3-1115抗體重鏈的氨基酸序列 SEQ ID NO: 3:K3-1115抗體輕鏈的核苷酸序列 SEQ ID NO: 4:K3-1115抗體輕鏈的氨基酸序列 SEQ ID NO: 5:K3-1115/T103E抗體重鏈的核苷酸序列 SEQ ID NO: 6:K3-1115/T103E抗體重鏈的氨基酸序列 SEQ ID NO: 7 :#32A1抗體的CDRHl的氨基酸序列 SEQ ID NO: 8 :#32A1抗體的⑶RH2的氨基酸序列（包含19個氨基酸殘基） SEQ ID NO: 9 :#32A1抗體的⑶RH2的氨基酸序列（包含14個氨基酸殘基） SEQ ID NO: 10 :#32A1抗體的CDRH3的氨基酸序列 SEQ ID NO: 11 :K3-1115/T103E 抗體 CDRH3 的氨基酸序列 SEQ ID NO: 12 :#32A1抗體的CDRLl的氨基酸序列 SEQ ID NO: 13 :#32A1抗體的CDRL2的氨基酸序列 SEQ ID NO: 14 :#32A1抗體的CDRL3的氨基酸序列 SEQ ID NO: 15:PCR 引物 32Al_HT103EFw SEQ ID NO: 16:PCR 引物 32Al_HT103ERv
【權(quán)利要求】
1. 抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，特征在于： 重鏈序列包含具有⑶RH1XDRH2和⑶RH3的可變區(qū)，并且⑶RH1包含SEQ ID NO: 7所 表示的氨基酸序列，⑶RH2包含SEQ ID NO: 9所表示的氨基酸序列，和⑶RH3包含SEQ ID NO: 11所表示的氨基酸序列；和 輕鏈序列包含具有CDRL1、CDRL2和CDRL3的可變區(qū)，并且CDRL1包含SEQ ID NO: 12 所表不的氨基酸序列，⑶RL2包含SEQ ID NO: 13所表不的氨基酸序列，和⑶RL3包含SEQ ID NO: 14所表示的氨基酸序列。
2. 權(quán)利要求1的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，特征在于包含重鏈可變區(qū)序列和輕鏈 可變區(qū)序列，所述重鏈可變區(qū)序列包含SEQ ID NO: 6所表示氨基酸序列的氨基酸殘基 20-140,所述輕鏈可變區(qū)序列包含SEQ ID NO: 4所表示氨基酸序列的氨基酸殘基21-133。
3. 權(quán)利要求1的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，特征在于包含重鏈序列和輕鏈序列，所 述重鏈序列包含SEQ ID NO: 6所表示氨基酸序列的氨基酸殘基20-466,所述輕鏈序列包含 SEQ ID NO: 4所表示氨基酸序列的氨基酸殘基21-238。
4. 權(quán)利要求1的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，特征在于包含重鏈序列和輕鏈序列，所 述重鏈序列包含SEQ ID NO: 6所表示氨基酸序列的氨基酸殘基20-465,所述輕鏈序列包含 SEQ ID NO: 4所表示氨基酸序列的氨基酸殘基21-238。
5. 權(quán)利要求1或2的抗體的抗原結(jié)合片段，選自Fab、F(ab'）2、Fab'和Fv。
6. 權(quán)利要求1或2的抗體，特征在于為scFv。
7. -種藥物組合物，特征在于包含權(quán)利要求1-6的抗體或抗體的抗原結(jié)合片段中的至 少一種。
8. 權(quán)利要求7的藥物組合物，特征在于為用于骨代謝異常的治療和/或預防劑。
9. 用于治療和/或預防骨代謝異常的藥物組合物，特征在于包含權(quán)利要求1-6的抗體 或抗體的抗原結(jié)合片段中的至少一種和選自二膦酸鹽、活性維生素 D3、降鈣素及其衍生物、 激素例如雌二醇、SERM (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑）、依普黃酮、維生素1(2 (四烯甲萘醌）、 鈣制劑、PTH (甲狀旁腺素）、非留類抗炎劑、可溶性TNF受體、抗-TNF-a抗體或抗體的抗 原結(jié)合片段、抗-PTHrP (甲狀旁腺素-相關(guān)蛋白）抗體或抗體的抗原結(jié)合片段、IL-1受體 拮抗劑、抗-IL-6受體抗體或抗體的抗原結(jié)合片段、抗-RANKL抗體或抗體的抗原結(jié)合片段 和0CIF (破骨細胞形成抑制因子）的至少一種。
10. 權(quán)利要求8或9的藥物組合物，其中所述骨代謝異常選自骨質(zhì)疏松癥、伴隨類風濕 性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)破壞、癌性高鈣血癥、伴隨多發(fā)性骨髓瘤或癌癥轉(zhuǎn)移至骨骼的骨質(zhì)破壞、巨 細胞瘤、骨質(zhì)減少、牙周炎引起的牙損失、假關(guān)節(jié)周圍的骨質(zhì)溶解、慢性骨髓炎中的骨質(zhì)破 壞、骨佩吉特氏病、腎性骨營養(yǎng)不良和成骨不全。
11. 權(quán)利要求10的組合物，特征在于所述骨代謝異常為骨質(zhì)疏松癥、伴隨類風濕性關(guān) 節(jié)炎的骨質(zhì)破壞或伴隨癌癥轉(zhuǎn)移至骨骼的骨質(zhì)破壞。
12. 權(quán)利要求11的藥物組合物，特征在于所述骨代謝異常為骨質(zhì)疏松癥。
13. 權(quán)利要求12的藥物組合物，特征在于所述骨質(zhì)疏松癥為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、老年 性骨質(zhì)疏松癥、使用治療劑例如留類或免疫抑制劑引起的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥或伴隨類風濕 性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥。
14. 用于治療和/或預防骨代謝異常的方法，特征在于給予權(quán)利要求1-6的抗體或抗體 的抗原結(jié)合片段中的至少一種或權(quán)利要求8或9的藥物組合物。
15. 用于治療和/或預防骨代謝異常的方法，特征在于同時或依次給予權(quán)利要求1-6的 抗體或抗體的抗原結(jié)合片段中的至少一種或權(quán)利要求8的藥物組合物和選自二膦酸鹽、活 性維生素仏、降鈣素及其衍生物、激素例如雌二醇、SERM (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑）、依普 黃酮、維生素1(2 (四烯甲萘醌）、鈣制劑、PTH (甲狀旁腺素）、非留類抗炎劑、可溶性TNF受 體、抗-TNF-a抗體或抗體的抗原結(jié)合片段、抗-PTHrP (甲狀旁腺素-相關(guān)蛋白）抗體或抗 體的抗原結(jié)合片段、IL-1受體拮抗劑、抗-IL-6受體抗體或抗體的抗原結(jié)合片段、抗-RANKL 抗體或抗體的抗原結(jié)合片段和OCIF (破骨細胞形成抑制因子）的至少一種。
16. 權(quán)利要求14或15的治療和/或預防方法，特征在于所述骨代謝異常為骨質(zhì)疏松 癥、伴隨類風濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)破壞或伴隨癌癥轉(zhuǎn)移至骨骼的骨質(zhì)破壞。
17. 權(quán)利要求16的治療和/或預防方法，特征在于所述骨代謝異常為骨質(zhì)疏松癥。
18. 權(quán)利要求17的治療和/或預防方法，特征在于骨質(zhì)疏松癥為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、老 年性骨質(zhì)疏松癥、使用治療劑例如留類或免疫抑制劑引起的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥或伴隨類風 濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥。
19. 編碼權(quán)利要求1-6中任一項的抗體的多核苷酸。
20. 權(quán)利要求19的多核苷酸，特征在于包括含有包含SEQ ID NO: 5所表示核苷酸序列 的核苷酸58-420的核苷酸序列的多核苷酸和含有包含SEQ ID NO: 3所表不核苷酸序列的 核苷酸61-399的核苷酸序列的多核苷酸。
21. 權(quán)利要求19的多核苷酸，特征在于包括含有包含SEQ ID NO: 5所表示核苷酸序列 的核苷酸58-1398的核苷酸序列的多核苷酸和含有包含SEQ ID NO: 3所表不核苷酸序列 的核苷酸61-174的核苷酸序列的多核苷酸。
22. -種載體，包含權(quán)利要求19-21的多核苷酸中的任一種。
23. 轉(zhuǎn)化的宿主細胞，包含權(quán)利要求19-21的多核苷酸中的任一種。
24. 轉(zhuǎn)化的宿主細胞，包含權(quán)利要求22的載體。
25. 生產(chǎn)權(quán)利要求1-6中任一項的抗體的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求23或24的宿主細 胞，和從所得培養(yǎng)產(chǎn)物中純化抗體。
【文檔編號】C12N15/09GK104334722SQ201380028931
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月30日
【發(fā)明者】晝間由晴, 木村貴子, 清水洋成 申請人:第一三共株式會社