檢測(cè)產(chǎn)生oxa-048碳青霉烯酶的細(xì)菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)和/或特異性鑒別生物學(xué)樣品中產(chǎn)生OXA-048型碳青霉烯酶的細(xì)菌的方法，所述方法包括如下步驟：a)將可能含有所述細(xì)菌的生物學(xué)樣品與反應(yīng)培養(yǎng)基接觸，所述培養(yǎng)基包含用于檢測(cè)酶活性的至少一種生色底物及濃度等于或大于150mg/L的替莫西林，優(yōu)選濃度為200-500mg/L，b)將所述樣品在培養(yǎng)基中保溫以使得細(xì)菌生長(zhǎng)，及c)檢測(cè)相應(yīng)于產(chǎn)生OXA-48碳青霉烯酶的細(xì)菌的菌株。本發(fā)明還涉及步驟a)中使用的培養(yǎng)基。
【專利說(shuō)明】檢測(cè)產(chǎn)生0XA-048碳青霉烯酶的細(xì)菌的方法
[0001] 本發(fā)明涉及微生物學(xué)分析領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及檢測(cè)和/或鑒別產(chǎn)生 0XA-48碳青霉烯酶的細(xì)菌的方法。
[0002] 0-內(nèi)酰胺抗生素類型如青霉素和頭孢菌素類藥物的抗生素抗性增加使得治療由 革蘭氏陰性菌株導(dǎo)致的感染變得復(fù)雜。這些抗生素因此被其它廣譜抗微生物制劑代替。碳 青霉烯在這些廣譜抗微生物制劑中發(fā)揮重要作用，特別是在治療住院患者中。碳青霉烯對(duì) 于大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性需氧菌及對(duì)于某些厭氧菌起作用。
[0003] 然而，在住院患者中出現(xiàn)增加數(shù)目的碳青霉烯抗性菌株。此外，需要快速檢測(cè)呈現(xiàn) 出碳青霉烯酶活性的菌株，以在適當(dāng)情況中進(jìn)行抗生素治療，使得可以適當(dāng)?shù)刂委煾腥?，?用以鑒別攜帶者以降低這些菌株在護(hù)理中心增殖的危險(xiǎn)。
[0004] 0 -內(nèi)酰胺酶是導(dǎo)致0 -內(nèi)酰胺抗生素抗性的細(xì)菌性酶，其命名不完全是標(biāo)準(zhǔn)化 的。其基于其一級(jí)原始結(jié)構(gòu)可以分為四種分子類別（A-D) (Ambler分類），或者基于靶向的 底物及其對(duì)抑制劑的抗性按功能分組（參見BushandJacoby,AntimicrobialAgentsand Chemotherapy, 2010 ；54(3):969-976)〇
[0005]碳青霉稀抗性細(xì)菌非限制性地是：大腸桿菌（Escherichia coli)、陰溝腸 桿菌（Enterobacter cloacae)、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes)、朽1 樣酸桿 菌（Citrobacter sp.)、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae)、臭鼻克雷伯菌 (Klebsiella oxytoca)、綠胺桿菌（Pseudomonas aeruginosa)、雷氏普羅威登斯菌 (Providencia rettgeri)、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida)、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌 (Stenotrophomonas maltophilia)、鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumanii)、叢毛單胞 菌（Comamonas sp.)、產(chǎn)氣單胞菌（Aeromonas sp.)、摩氏摩根菌（Morganella morganii)、 腸球菌（Enterococcus sp.)、奇異變形桿菌（Proteus mirabilis)、森夫頓堡沙門氏菌 (Salmonella senftenberg)、粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens)、鼠傷寒沙門氏桿菌 (Salmonella typhimurium)等。
[0006] 這些細(xì)菌可產(chǎn)生能水解碳青霉烯的各種類型的e-內(nèi)酰胺酶或者碳青霉烯酶。碳 青霉烯酶是非常廣譜的內(nèi)酰胺酶，能失活幾乎所有內(nèi)酰胺抗生素。根據(jù)Ambler分 類法將其概括地分為三個(gè)類別：
[0007] A類，也稱作絲氨酸碳青霉烯酶，特征在于通過(guò)克拉維酸及硼酸的衍生物的可變抑 制。主要的代表物是KPC酶；
[0008]B類，也稱作金屬-碳青霉烯酶，特征在于通過(guò)陽(yáng)離子螯合劑如EDTA的抑制。主要 的代表物是NDM、VM和MP酶；
[0009]D類，其相應(yīng)于0XA-型0-內(nèi)酰胺酶，其中是變體0XA-48,其具有擁有碳青霉烯酶 活性的特性。盡管不是常見的，但是存在通過(guò)點(diǎn)突變從0XA-48中衍生的其它變體，其保留 這種碳青霉烯酶活性?？梢蕴峒暗氖荗XA-162、OXA-163、OXA-181、0XA-204和0XA-232。 [0010]金屬_內(nèi)酰胺酶（MBL)和肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC)在腸桿菌中是普遍 存在的，更特別是在北美洲、南美洲、以色列、意大利、希臘、印度、中國(guó)和巴基斯坦。苯唑西 林酶-48((^3(：;[11;[1^86-48,0乂4-48)最近在土耳其、地中海盆地和在西歐已經(jīng)分離。
[0011] 碳青霉烯酶基因能存在于染色體和/或質(zhì)粒中。由于在質(zhì)粒形式中的這種存在， 這些酶促類型抗性能非常明顯地傳播及因此在流行病學(xué)方面存在重大危險(xiǎn)。
[0012] 為了檢測(cè)和/或鑒別碳青霉烯-抗性菌株，可以使用分子生物學(xué)技術(shù)，其是非常靈 敏的并具有可以快速鑒別產(chǎn)生碳青霉烯酶的腸桿菌菌株的優(yōu)勢(shì)。然而，這些方法是昂貴且 復(fù)雜的，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中通常還不具備。
[0013]為了篩選、檢測(cè)和/或鑒別產(chǎn)生碳青霉烯酶的腸桿菌（CPE)，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知 基于培養(yǎng)的方法。這些方法是基于依次在通過(guò)加入碳青霉烯或者在產(chǎn)生示出碳青霉烯非敏 感性抗菌譜之后而變?yōu)檫x擇性的Mac-Conkey瓊脂型常規(guī)培養(yǎng)基上或者在胰蛋白酶解的大 豆肉湯中分離。在適當(dāng)?shù)那闆r中，可以使用浸漬了碳青霉稀或Etest?strips(bioM6rieux) 的培養(yǎng)皿。通過(guò)補(bǔ)加檢測(cè)證實(shí)碳青霉烯酶的存在是必要的，可以提及的檢測(cè)是：修改的Hodge檢測(cè)（CLSIM10〇-S22:PerformanceStandardsforAntimicrobialSusceptibility Testing；Twenty-SecondInformationalSupplement.January2012.Supplemental Table2A-S2)，及在瓊脂中的擴(kuò)散（或者組合的培養(yǎng)皿）協(xié)同檢測(cè)，使用與碳青霉烯組合 的抑制劑，例如對(duì)于B類碳青霉烯酶的EDTA，對(duì)于檢測(cè)A類碳青霉烯酶的苯硼酸。Rosco 公司提議一種多皿式方法以使用分離的菌株檢測(cè)產(chǎn)生碳青霉稀酶的細(xì)菌（BioConnections KPC+MBLConfirmIDkit)，并建議加入包含30yg替莫西林的培養(yǎng)皿以檢測(cè)0XA-48酶的 存在。然而，這個(gè)檢測(cè)示出替莫西林不抑制所有的KPC、AmpC和MBL菌株，因此其自身不能 特異性檢測(cè)0XA-48菌株。
[0014] 因此?，F(xiàn)有技術(shù)不能特異性檢測(cè)OXA-48CPE，需要三天的較長(zhǎng)應(yīng)答時(shí)間。此外，就 預(yù)防多重抗性細(xì)菌感染而言，這些技術(shù)不太適于搜索用于尋找攜帶者的糞便或直腸樣品中 的CPE。
[0015]其它方法使用商業(yè)生色培養(yǎng)基如&'illianceCRE培養(yǎng)基（Oxoid?)、 CHROVIagar?KPC培養(yǎng)基（CHROMagar?,Paris,France)、ColorexKPC等價(jià)培養(yǎng)基 (BiomedDiagnosticsInc.)，或者 申請(qǐng)人:的chromlDCR)ESBL或chromlD?CARBA培養(yǎng) 基。后者的培養(yǎng)基證實(shí)能檢測(cè)參考OXA-48菌株，但是條件是接種物量大（大約107CFU/ ml)。已經(jīng)描述了另一培養(yǎng)基（SuperCarba(Nordmannetal.，2012,J.Clin.Microbiol.，in press))，其能可靠地檢測(cè)產(chǎn)生OXA-48的CPE，然而不能鑒別或特異性檢測(cè)，因?yàn)楫a(chǎn)生其它 類型碳青霉烯酶的細(xì)菌不被抑制。此外，這種培養(yǎng)基具有非常短的保存期限（大約一周） 的缺點(diǎn)，這很大程度地限制其常規(guī)使用及其工業(yè)化。
[0016] 因此，這些方法無(wú)一是同時(shí)足夠敏感地、特異性地和快速地檢測(cè)0XA-48菌株，并 且還沒(méi)有提出改良的解決方案。由于0XA-48菌株的檢測(cè)在臨床和流行病學(xué)方面是確實(shí)感 興趣的，因此仍然需要克服這個(gè)領(lǐng)域中現(xiàn)有培養(yǎng)基的缺點(diǎn)。
[0017] 在此方面，本發(fā)明涉及一種特異性檢測(cè)和/或鑒別生物學(xué)樣品中產(chǎn)生0XA-48碳青 霉烯酶的細(xì)菌的方法，所述方法包括如下步驟：
[0018] a)使可能含有所述細(xì)菌的生物學(xué)樣品與反應(yīng)培養(yǎng)基接觸，所述培養(yǎng)基包含濃度高 于或等于150mg/L、優(yōu)選200-500mg/L的替莫西林及可以檢測(cè)特異性酶活性的生色底物，
[0019] b)保溫全部的混合物，以使得細(xì)菌生長(zhǎng)，及
[0020] c)檢測(cè)相應(yīng)于產(chǎn)生0XA-48碳青霉烯酶的細(xì)菌的菌株。
[0021] 實(shí)際上，本 申請(qǐng)人:的研宄已經(jīng)令人驚奇地示出高于或等于150mg/L的高濃度的替 莫西林可以特異性區(qū)分OXA-48CPE。優(yōu)選地，使用的替莫西林的濃度為150-500mg/L。因 此，本發(fā)明的方法可以敏感性、特異性及快速地檢測(cè)（通常少于24小時(shí)）0XA-48CPE，同時(shí) 具有使用即用型培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)，所述培養(yǎng)基具有較長(zhǎng)的保存期限，使其可以工業(yè)化。有利 地，本發(fā)明的方法也可以鑒別菌株。
[0022] 替莫西林是替卡西林的6-a_甲氧基衍生物，其自身是青霉素，有時(shí)與克拉維酸 組合使用。本文描述了針對(duì)多重抗性的腸桿菌科細(xì)菌的另一種治療。
[0023] 體外易感性測(cè)試已經(jīng)由Livermoreetal.(InternationalJournalof AntimicrobialAgents, 2011 ;37:415_419)進(jìn)行。他們表明最小抑制濃度（MIC) ^ 256mg/ L，本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)此的解釋為，所檢測(cè)的細(xì)菌可生長(zhǎng)的最終測(cè)試替莫西林濃度為128mg/ L。這些測(cè)試因此示出18/19的0XA-48菌株和32/35的具有金屬-碳青霉烯酶的菌株對(duì)替 莫西林具有抗性。這樣阻止了本領(lǐng)域技術(shù)人員在特異性檢測(cè)0XA-48的培養(yǎng)基中使用替莫 西林。
[0024] 給出以下定義以更清楚地理解本發(fā)明。
[0025] 術(shù)語(yǔ)"生物學(xué)樣品"是指分離的小部分或少量實(shí)體以進(jìn)行分析。這個(gè)樣品可以是 人或動(dòng)物臨床樣品，得自生物學(xué)液體樣品，或者是食物樣品，得自任何類型食物，或者是得 自食物生產(chǎn)或運(yùn)輸環(huán)境的樣品。這個(gè)樣品因此可以是液體或固體?？梢蕴峒暗姆窍拗菩缘?是全血、血清、血漿、尿液、糞便或腦脊液的臨床樣品，或者是鼻、咽喉、皮膚、直腸或傷口樣 品，食物樣品，來(lái)自水、飲料如牛奶或果汁、來(lái)自酸奶、肉類、蛋類、蔬菜、蛋黃醬、奶酪、魚等， 食物樣品，得自動(dòng)物飼料如特別是得自動(dòng)物肉的樣品，或者地表或水處理樣品。優(yōu)選地，根 據(jù)本發(fā)明，所述樣品是臨床樣品。
[0026] 樣品可以現(xiàn)狀使用或者在分析前可以經(jīng)歷富集、稀釋、提取、濃縮和/或純化等制 備，根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備。
[0027] 術(shù)語(yǔ)"反應(yīng)培養(yǎng)基"是指包含為代謝物表達(dá)和/或微生物生長(zhǎng)所需的所有成分的 培養(yǎng)基。反應(yīng)培養(yǎng)基可以是固體、半固體或者液體。術(shù)語(yǔ)"固體培養(yǎng)基"是指例如凝膠或 瓊脂培養(yǎng)基。瓊脂是在微生物學(xué)中培養(yǎng)微生物的常規(guī)膠凝劑，但是可以單獨(dú)或組合使用 明膠、瓊脂糖或其它天然或人工膠凝劑。某些制備物是可以商購(gòu)的，例如Columbia瓊脂、 胰蛋白酶消化的大豆瓊脂、Mac Conkey瓊脂、Mueller Hinton瓊脂，或者在Handbook of Microbiological Media(CRC Press)中描述的更通常的那些瓊脂。
[0028] 反應(yīng)培養(yǎng)基可包含一或多種元件組合，如氨基酸、蛋白胨、碳水化合物、核苷酸、礦 物質(zhì)、維生素等。所述培養(yǎng)基也可包含染料。例如可以提及的染料是Evans藍(lán)、中性紅，綿 羊血、馬血，遮光劑如氧化鈦或高嶺土，硝基苯胺，孔雀綠，亮綠，或者一或多種代謝指示物， 一或多種代謝調(diào)節(jié)物等。
[0029] 反應(yīng)培養(yǎng)基可以是展示培養(yǎng)基或者是培養(yǎng)和展示培養(yǎng)基。在第一種情況中，微生 物的培養(yǎng)在接種之前進(jìn)行；在第二種情況中，培養(yǎng)基還包含檢測(cè)和/或鑒別培養(yǎng)基。鑒別是 指微生物在感興趣的種或群中的分類。
[0030] 本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以使用雙平板或者包含兩個(gè)隔室的Petri型培養(yǎng)皿，使得可 以容易地對(duì)比包含不同底物或者不同的選擇性混合物的兩個(gè)培養(yǎng)基，其上已經(jīng)沉積了相同 的生物學(xué)樣品。
[0031] 反應(yīng)培養(yǎng)基可包含一或多種選擇劑。術(shù)語(yǔ)"選擇劑"是指能阻止或減緩除了靶微 生物之外的微生物生長(zhǎng)的任何化合物。非限制性地，濃度在0. 〇lmg/L-5g/L之間特別適于 本發(fā)明。
[0032] 作為選擇劑，可以提及的是抗生素、抗真菌劑、膽鹽、結(jié)晶紫、堿性品紅、亮綠、表面 活性劑如Tergitol?等。術(shù)語(yǔ)"抗生素"是指能阻止或減緩細(xì)菌生長(zhǎng)的任何化合物。它們 特別屬于內(nèi)酰胺抗生素、糖肽、氨基糖苷、多肽、磺胺、喹諾酮類。例如可以特別提及的 抗生素是羧芐青霉素、替卡西林、替莫西林、福米西林、頭孢噻肟、頭孢磺啶、頭孢他啶、頭孢 西丁、頭孢曲松、頭孢泊污、氨曲南、厄他培南、法羅培南、多利培南、萬(wàn)古霉素、慶大霉素、甲 氧芐啶、托普霉素、拉氧頭孢、磷霉素、D-環(huán)絲氨酸、多粘菌素、粘菌素、喹諾酮類如萘啶酸。
[0033] 術(shù)語(yǔ)"抗真菌劑"是指能阻止或減緩酵母或霉菌生長(zhǎng)的任何化合物。例如可以特 別提及的是兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、放線菌酮和氟胞嘧啶。
[0034] 術(shù)語(yǔ)"生色底物"是指可以通過(guò)直接或間接可檢測(cè)信號(hào)檢測(cè)靶微生物的酶或代 謝活性的底物。對(duì)于直接檢測(cè)，這種底物可以與作為標(biāo)記的成分結(jié)合，其是熒光或有色的 (Orengaetal.，2009 ;J.Microbiol.Methods;79 (2) : 139-55)。對(duì)于直接檢測(cè)，本發(fā)明的反 應(yīng)培養(yǎng)基可另外包含pH指示劑，其對(duì)由于底物的消耗所致pH變化敏感及展示靶微生物的 代謝。所述pH指示劑可以是生色團(tuán)或者熒光團(tuán)。生色團(tuán)例如可以提及的是溴甲酚紫、溴百 里酚藍(lán)、中性紅、苯胺藍(lán)和溴甲酚藍(lán)。熒光團(tuán)包含例如4-甲基傘形酮、羥基香豆素衍生物或 者試鹵靈衍生物。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明，生色底物優(yōu)選選自基于如下基團(tuán)的底物：吲哚酚（3-吲哚 酚、5-溴-3-吲哚酚、5-碘-3-吲哚酚、4-氯-3-吲哚酚、5-溴-4-氯-3-吲哚酚、 5_溴-6-氯-3-吲哚酚、6-溴-3-吲哚酚、6-氯-3-吲哚酚、6-氟-3-吲哚酚、 5-溴-4-氯-N-甲基-3-吲哚酚、N-甲基-3-吲哚酚、Aldol?等）；傘形酮（4-甲基 傘形酮，環(huán)己烯七葉亭等）；茜素；P-萘酚苯；硝基酚（正-硝基酚，對(duì)-硝基酚等）；羥 基喹啉；cathecol(cathecol，二輕基黃酮，輕基黃酮等）；試鹵靈；氯酷紅；焚光素；氨基 苯酷（對(duì)-氨基苯酷，二氯氨基苯酷等）；萘酷（a-萘酷，2_萘酷，萘酷-ASBI等）；氨 基香豆素（7-氨基-4-甲基香豆素等）；萘基酰胺；吖啶（氨基苯基吖啶等）；氨基吩噁 嗪（氨基苯并吩噁嗪，氨基戊基試鹵靈等）；氨基苯乙烯基化合物（氨基苯乙烯基喹啉， aminostyryllepidinium等）。
[0036] 例如，由生色底物靶向的酶活性可以屬于水解酶類，優(yōu)選苷酶、酯酶或者肽酶類。 優(yōu)選地，由生色底物靶向的酶活性選自：葡糖苷酸酶、半乳糖苷酶、核糖苷酶、酯酶、硫酸酯 酶、磷脂酶、氨基肽酶和脫氨酶。
[0037] 例如，用于檢測(cè)葡糖苷酸酶活性的底物可特別是4-甲基傘形酮-0-葡糖 苷酸，5-溴-4-氯-3-吲哚基-葡糖苷酸，5-溴-6-氯-3-吲哚基-葡糖苷酸， 6_氯-3-吲哚基-0 -葡糖苷酸，Aldol?- 0 -葡糖苷酸，茜素-0 -葡糖苷酸，環(huán)己烯七葉 亭-0-葡糖苷酸，或者其鹽。
[0038] 用于檢測(cè)半乳糖苷酶活性的底物可特別是4-甲基傘形酮-0-半乳糖苷， 5_溴-4-氯-3-吲哚基-0 -半乳糖苷，5-溴-6-氯-3-吲哚基-0 -半乳糖苷，6-氯-3-吲 哚基-0 _半乳糖苷，Aldol?- 0 -半乳糖苷，茜素-0 -半乳糖苷，環(huán)己烯七葉亭-0 -半乳 糖苷，或者其鹽。
[0039] 用于檢測(cè)a_半乳糖苷酶活性的底物可特別是4-甲基傘形酮-a_半乳糖苷， 5_溴-4-氯-3-吲哚基-a-半乳糖苷，5-溴-6-氯-3-吲哚基-a-半乳糖苷，6-氯-3-吲 哚基-a-半乳糖苷，或者其鹽。
[0040] 用于檢測(cè)葡糖苷酶活性的底物可特別是4-甲基傘形酮-0-葡糖苷， 5_溴-4-氯-3-吲哚基-葡糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-葡糖苷， 5_漠_6_氣_3_卩引噪基-13 -匍糖昔，6_氣_3_卩引噪基-13 -匍糖昔，A1do1?-13 -匍糖昔，茜 素-0 _葡糖苷，環(huán)己烯七葉亭-0 _葡糖苷，硝基苯基-0 _葡糖苷，二氯氨基苯基葡糖苷， 或者其鹽。
[0041] 用于檢測(cè)a-葡糖苷酶活性的底物可特別是4-甲基傘形酮-a-葡糖苷， 5_溴-4-氯-3-吲哚基-a-葡糖苷，5-溴-4-氯-3-吲哚基-N-甲基-a-葡糖苷， 5_漠_6_氣_3_H引噪基-a-匍糖昔，6_氣_3_H引噪基-a-匍糖昔，硝基苯基-a-匍糖昔， 或者其鹽。
[0042] 用于檢測(cè)核糖苷酶活性的底物可特別是4-甲基傘形酮-核糖苷， 5_溴-4-氯-3-吲哚基-0 -核糖苷，5-溴-6-氯-3-吲哚基-0 -核糖苷，6-氯-3-吲哚 基-|3 -核糖苷，茜素-|3 -核糖苷，硝基苯基-|3 -核糖苷，或者其鹽。
[0043] 例如，用于檢測(cè)酯酶活性的底物可特別是飽和或不飽和的線性脂肪酸的酯，具 有6-14個(gè)碳原子，優(yōu)選具有7-9個(gè)碳原子，及4-甲基傘形酮、5-溴-4-氯-3-吲噪酷、 5_溴-6-氯-3-吲哚酚、6-氯-3-吲哚酚、5-溴-3-吲哚基或者茜素的酯，或者其鹽。優(yōu)選 地，其選自4-甲基傘形酮辛酸酯，5-溴-4-氯-3-吲哚酚辛酸酯，5-溴-6-氯-3-吲哚酚 辛酸酯，6-氯-3-吲哚酚辛酸酯，5-溴-3-吲哚基辛酸酯或者茜素辛酸酯。
[0044] 用于檢測(cè)磷脂酶活性的底物可特別是4-甲基傘形酮-磷脂酰肌醇，4-甲基傘形 酮-磷脂酰膽堿，5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷脂酰肌醇，5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷脂酰 膽堿，硝基苯基-磷脂酰肌醇，硝基苯基-磷脂酰膽堿，或者其鹽。
[0045] 用于檢測(cè)氨基肽酶活性的底物可特別是L-丙氨酰-7-酰胺-4-甲基香豆 素，L-丙氨酰二氯酰胺苯基，L-丙氨酰-7-酰胺-1-戊基phenoxazinone，L-丙氨 酉先-4-amidostyrylquinaldinium，或者其鹽。
[0046] 用于檢測(cè)脫氨酶活性的底物可特別是L-色氨酸，L-苯丙氨酸，L-酪氨酸和L-組 氨酸。
[0047] 用于檢測(cè)硫酸酯酶活性的底物可特別是4-甲基傘形酮硫酸酯，5-溴-4-氯-3-吲 哚酚硫酸酯，5-溴-6-氯-3-吲哚酚硫酸酯，3-吲哚酚硫酸酯，酚酞二硫酸酯，或者其鹽。
[0048] 優(yōu)選地，生色底物選自：5_溴-4-氯-3-吲哚酚-0-D-吡喃葡萄糖苷（X-葡 糖苷），5-溴-6-氯-3-卩引噪酷-13 -D-半乳糖苷（Magenta|3 -Gal)，6-氯-3-卩引噪 酷-13 -D-葡糖苷酸（Pink-13 -Gur)，5-溴-4-氯-3-n引噪酷-N-甲基-13 -D-R比喃葡萄糖苷 (GreenA--Glu)，甲基--D-吡喃葡萄糖苷（甲基--D-葡糖苷），乳糖和L-色氨酸。
[0049]反應(yīng)培養(yǎng)基也可以含有至少一種EDTA型陽(yáng)離子螯合劑，以復(fù)合是B類碳青霉烯酶 輔因子的鋅，因此促進(jìn)其抑制作用并因此能恢復(fù)內(nèi)酰胺抗生素如替莫西林的活性。有 利地，EDTA濃度在1. 0-2. 5mmol/L之間。
[0050] 可以提及的其它螯合劑是：吡啶二羧酸，2-巰基乙醇及鄰二氮雜菲衍生物。
[0051] 術(shù)語(yǔ)"保溫"是指在適當(dāng)溫度，通常在20-50°C之間，優(yōu)選30-40°C維持1-48小時(shí)， 優(yōu)選4-24小時(shí)，更優(yōu)選16-24小時(shí)。
[0052] 術(shù)語(yǔ)"檢測(cè)"是指用裸眼或者使用光學(xué)或數(shù)字儀器辨識(shí)靶細(xì)菌生長(zhǎng)的尺度。有利 地，當(dāng)使用的培養(yǎng)基包含生色底物時(shí)，所述檢測(cè)也可以對(duì)靶細(xì)菌進(jìn)行分類鑒別。對(duì)于熒光底 物及對(duì)于生色底物，檢測(cè)是用裸眼或者使用光學(xué)或數(shù)字儀器進(jìn)行。
[0053] 術(shù)語(yǔ)"特異性"是指當(dāng)尋找的細(xì)菌菌株不存在時(shí)，所述方法或反應(yīng)培養(yǎng)基提供陰性 結(jié)果的能力。換句話說(shuō)，根據(jù)本發(fā)明，更特異性的鑒別相應(yīng)于與不表達(dá)0XA-48碳青霉烯酶 的菌株相關(guān)的假陽(yáng)性數(shù)降低，而不是指抑制所有這些菌株。
[0054] 術(shù)語(yǔ)"敏感性"是指當(dāng)尋找的細(xì)菌菌株存在于樣品中時(shí)提供陽(yáng)性結(jié)果的能力。
[0055] 因此，本發(fā)明涉及一種特異性檢測(cè)和/或鑒別生物學(xué)樣品中產(chǎn)生0XA-48碳青霉烯 酶的細(xì)菌的方法，所述方法包括如下步驟：
[0056]a)將可能含有所述細(xì)菌的生物學(xué)樣品與反應(yīng)培養(yǎng)基接觸，所述培養(yǎng)基包含生色底 物及濃度高于或等于150mg/L、優(yōu)選濃度為200-500mg/L的替莫西林，
[0057] b)保溫全部的混合物，以使得細(xì)菌生長(zhǎng)，及
[0058] c)檢測(cè)相應(yīng)于產(chǎn)生0XA-48碳青霉烯酶的細(xì)菌的菌株。
[0059] 有利地，生色底物使得可以檢測(cè)酶活性及鑒別檢測(cè)的細(xì)菌。
[0060] 有利地，所述反應(yīng)培養(yǎng)基是培養(yǎng)基。
[0061] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案，步驟a)中使用的反應(yīng)培養(yǎng)基還包含EDTA型 的二價(jià)陽(yáng)離子螯合劑，優(yōu)選濃度在1. 0-2. 5mM之間。
[0062] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特定的實(shí)施方案，步驟a)中使用的培養(yǎng)基包含至少一種其它 生色底物，其可以檢測(cè)酶活性。
[0063] 優(yōu)選地，檢測(cè)的以可以鑒別細(xì)菌的酶活性選自酯酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶和葡糖 苷酸酶活性。
[0064] 優(yōu)選地，能產(chǎn)生0XA-48碳青霉烯酶的靶細(xì)菌是腸桿菌科細(xì)菌。
[0065] 有利地，本發(fā)明的方法組合兩種反應(yīng)培養(yǎng)基，一種包含至少一種生色底物和替莫 西林，另一種包含至少一種生色底物和碳青霉烯，優(yōu)選法羅培南。優(yōu)選地，兩個(gè)隔室的Petri 型培養(yǎng)皿，也稱作雙平板，可以組合這兩種培養(yǎng)基。在保溫后存在的菌落的對(duì)比可以鑒別相 應(yīng)于碳青霉烯抗性的菌株和/或產(chǎn)生0XA-48碳青霉烯酶的細(xì)菌。
[0066] 本發(fā)明還涉及即用型培養(yǎng)基以特異性檢測(cè)和/或鑒別產(chǎn)生0XA-48碳青霉烯酶的 腸桿菌科細(xì)菌，其包含：
[0067] ?營(yíng)養(yǎng)性瓊脂培養(yǎng)基，適于腸桿菌科細(xì)菌的生長(zhǎng)，
[0068] ?替莫西林，濃度高于或等于150mg/L，優(yōu)選濃度為200-500mg/L，及
[0069] ?至少一種生色底物。
[0070] 有利地，所述培養(yǎng)基還包含EDTA型二價(jià)陽(yáng)離子螯合劑，優(yōu)選濃度為1. 0-2. 5mM。
[0071] 最后，本發(fā)明涉及在瓊脂或液體反應(yīng)培養(yǎng)基中使用替莫西林，濃度高于或等于 150mg/L，優(yōu)選濃度為200-500mg/L，以特異性檢測(cè)和/或鑒別可能包含于生物學(xué)樣品中的 產(chǎn)生0XA-48碳青霉烯酶的細(xì)菌。
[0072] 對(duì)于本發(fā)明，在存在樣品的條件下，替莫西林在反應(yīng)培養(yǎng)基中是均相的。替莫西林 未浸漬在培養(yǎng)皿或試紙條上或是沉積在反應(yīng)培養(yǎng)基上或之中的另一單獨(dú)的容器上。
[0073] 下文揭示的實(shí)施例的目的是便于理解本發(fā)明。這些實(shí)施例只是例證本發(fā)明而不限 制本發(fā)明的范圍。
[0074]實(shí)施例1:針對(duì)一組CPE菌株確定替莫西林的MIC(使用瓊脂稀釋方法）
[0075] 使用的菌株集合：
【權(quán)利要求】
1. 一種特異性檢測(cè)和/或鑒別生物學(xué)樣品中產(chǎn)生0XA-48碳青霉烯酶的細(xì)菌的方法，所 述方法包括如下步驟： a) 使可能含有所述細(xì)菌的生物學(xué)樣品與反應(yīng)培養(yǎng)基接觸，所述培養(yǎng)基包含使得可以 檢測(cè)酶活性的至少一種生色底物以及濃度為高于或等于150mg/L的替莫西林、優(yōu)選濃度為 200_500mg/L， b) 保溫全部的混合物以使得細(xì)菌生長(zhǎng)，及 c) 檢測(cè)相應(yīng)于產(chǎn)生0XA-48碳青霉烯酶的細(xì)菌的菌株。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中在步驟a)中使用的培養(yǎng)基還包含EDTA型二價(jià)陽(yáng)離子螯合 劑，優(yōu)選濃度為1. 0-2. 5mmol/L。
3. 權(quán)利要求1或2的方法，其中可能存在于樣品中的細(xì)菌是腸桿菌科細(xì)菌。
4. 權(quán)利要求2或3的方法，其中在步驟a)中使用的培養(yǎng)基包含至少一種其它生色底 物，使得可以檢測(cè)酶活性。
5. 權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)的方法，其中所述底物使得可以檢測(cè)選自如下一組的至少一種 酶活性：酯酶、葡糖苷酶、半乳糖苷酶及葡糖苷酸酶活性。
6. -種檢測(cè)和/或鑒別生物學(xué)樣品中的產(chǎn)生0XA-48碳青霉烯酶的細(xì)菌和碳青霉 烯-抗性細(xì)菌的方法，包括如下步驟： a) 將可能含有所述細(xì)菌的生物學(xué)樣品與反應(yīng)培養(yǎng)基接觸，所述培養(yǎng)基包含可以檢測(cè) 酶活性的至少一種生色底物及濃度為高于150mg/L的替莫西林，且與另一種反應(yīng)培養(yǎng)基 接觸，該另一種培養(yǎng)基包含可以檢測(cè)酶活性的至少一種生色底物及碳青霉烯，優(yōu)選法羅培 南； b) 保溫全部混合物以使得細(xì)菌生長(zhǎng)，及 c) 檢測(cè)相應(yīng)于碳青霉烯-抗性細(xì)菌和/或產(chǎn)生0XA-48碳青霉烯酶的細(xì)菌的菌株。
7. 權(quán)利要求7的方法，其中步驟a)在組合了步驟a)中所述的兩種培養(yǎng)基的雙平板上 進(jìn)行。
8. 檢測(cè)和/或鑒別產(chǎn)生0XA-48碳青霉烯酶的腸桿菌科細(xì)菌的即用型培養(yǎng)基，包含： ?適于腸桿菌科細(xì)菌生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)性瓊脂培養(yǎng)基， ?濃度高于或等于150mg/L的替莫西林、優(yōu)選濃度為200-500mg/L， ?至少一種生色底物。
9. 權(quán)利要求8的培養(yǎng)基，還包含EDTA型二價(jià)陽(yáng)離子螯合劑，其濃度優(yōu)選為1. 0-2. 5mM。
10. 液體或瓊脂反應(yīng)培養(yǎng)基中濃度高于或等于150mg/L、優(yōu)選濃度為200-500mg/L的替 莫西林在檢測(cè)和/或鑒別可能包含于生物培養(yǎng)基中的產(chǎn)生0XA-48碳青霉烯酶的細(xì)菌中的 應(yīng)用。
11. 權(quán)利要求10的應(yīng)用，其中將替莫西林與二價(jià)陽(yáng)離子螯合劑組合，所述二價(jià)陽(yáng)離子 螯合劑的濃度優(yōu)選為1. 0-2. 5mmol/L。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104508140SQ201380040004
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2013年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月27日
【發(fā)明者】G·贊巴爾迪, L·德維涅, S·吉拉爾迪 申請(qǐng)人:生物梅里埃公司