一種蘋果組織總rna的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蘋果組織總RNA的提取方法，該方法將蘋果組織用液氮研磨成粉末，加裂解液，振蕩混勻，水浴使樣品完全裂解，離心，上清中加入等體積的酚-氯仿混勻，離心，上清中加入LiCl離心得RNA沉淀，用DEPC-treated?ddH2O溶解RNA沉淀，加醋酸鈉和無水乙醇放置，離心，乙醇洗滌，得沉淀物，置室溫下干燥即得到蘋果組織總RNA。該方法提取的RNA純度高，沒有DNA的污染，完整性好，而且操作方法簡便快速，得到的RNA可用于分子克隆、Northern?blot、Real-time?PCR等操作。
【專利說明】一種蘋果組織總RNA的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種提取蘋果組織RNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蘋果(Malus domestica)是薔薇科蘋果亞科蘋果屬植物,落葉喬木。蘋果組織中富含多酚、多糖、蛋白質(zhì)及其他次生代謝物，嚴重影響RNA的提取。酚類化合物被氧化后會與RNA不可逆的結(jié)合，導致RNA活性喪失；多糖會形成難溶的膠狀物，與RNA形成共沉淀；內(nèi)源或外源的RNA酶極易引起RNA的降解；DNA也會影響所提取RNA的純度。異硫氰酸胍(Trizol)法雖然是公認的RNA提取方法，但由于蘋果組織富含多酚多糖，該方法并不適合蘋果組織RNA的提取。商品化的試劑盒提取效果也并非十分理想，而且價格較貴。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對上述現(xiàn)有RNA提取方法存在的缺陷或不足，本發(fā)明的目的在于，提供一種適用于蘋果不同組織的高效、快速、簡便的總RNA提取方法。
[0004]為了實現(xiàn)上述任務，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案:
[0005]一種蘋果組織總 RNA的提取方法，其特征在于，按下述步驟操作:
[0006]I)取25mg-50mg蘋果組織用液氮研磨成粉末，加800 μ I~1000 μ I裂解液，振蕩混勻；所述的裂解液由以下物質(zhì)制備:CTAB:2%~3% ；Tris-HCl =IOOmmoI/L~300mmol/L，ρΗ8.0 ；EDTA:25mmol/L,pH8.0 ；NaCl:2mol/L ；PVP-40:2% ~4% ； β -巰基乙醇:2% ~4%,定容至 1000ml ；
[0007]2)65°C水浴4~IOmin使樣品完全裂解。12000rpm，4°C離心4~lOmin，取上清。
[0008]3)向上清中加入等體積的酚-氯仿混合物(酚:氯仿=25:24，pH4.5)混勻，12000rpm, 4°C離心 4 ~IOmin,取上清。
[0009]4)將得到的上清重復步驟3)的操作；
[0010]5)向步驟4)的上清液中加入等體積氯仿,混勻，12000rpm4°C離心4~IOmin,取上清。
[0011]6)上清中加入7~10mol/L的LiCl，使終濃度達到2mol/L，混勻，_20°C放置lh，12000rpm, 4°C離心8~15min,棄上清,得RNA沉淀。
[0012]7)用 80 ~100 μ I 的 DEPC-treated ddH20 溶解 RNA 沉淀，加入 1/10 體積的 3mol/L醋酸鈉(ρΗ5.2)和2.5倍體積的無水乙醇，_20°C放置15~25min，12000rpm，4°C離心8~15min,棄上清。
[0013]8)用500~1000 μ I濃度為75%的乙醇洗滌RNA沉淀物，12000rpm，4°C離心4~IOmin,棄上清,得沉淀物。
[0014]9)沉淀物再重復上一步操作；
[0015]10)將沉淀物置室溫下干燥4~lOmin，揮發(fā)殘留的乙醇，得到蘋果組織總RNA。
[0016]將蘋果組織總RNA溶于50 μ I的DEPC-treated ddH20中，_70°C長期保存。[0017]本發(fā)明的蘋果組織總RNA的提取方法，所采用的RNA提取液中，含有的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)可以對組織細胞進行裂解，同β-巰基乙醇共同作用，使蛋白質(zhì)變性，有利于RNA的釋放；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)螯合多酚物質(zhì)，使之不被氧化成醌類，防止與RNA結(jié)合，減少RNA損失；β -巰基乙醇作為強還原劑也可以抑制多酚的氧化；高濃度的氯化鈉可以去除多糖。另外，本發(fā)明的方法與已知的其他方法不同之處，專門使用酚-氯仿(酚:氯仿=25:24，ρΗ4.5)作為蛋白變性劑，不僅可以去除蛋白質(zhì)，還可以去除DNA的干擾，所以使用本發(fā)明的方法提取的RNA純度高，沒有DNA的污染，完整性好，而且操作方法簡便快速，得到的RNA可用于分子克隆、Northern blot、Real-time PCR等操作。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是蘋果組織RNA瓊脂糖凝膠電泳圖；圖中從左至右分別表示:1、蘋果葉，2、蘋果皮，3、平果花。
[0019]以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明。
【具體實施方式】
[0020]需要說明的是，在以下的實施例中，裂解液由以下物質(zhì)制備:CTAB:2%~3%，Tris-HCl (pH8.0):100mmol/L ~300mmol/L ；EDTA (pH8.0):25mmol/L, NaCl:2mol/L,PVP-40:2%~4% ； β -巰基乙醇:2%~4%，定容至1000ml。
[0021]實施例1:
[0022]I)取25mg蘋果葉用液 氮研磨成粉末，加1000 μ I裂解液(由以下物質(zhì)制備:CTAB:3%, Tris-HCl (ρΗ8.0):100mmol/L ；EDTA (ρΗ8.0):25mmol/L，NaCl:2mol/L, PVP-40:2% ；β -巰基乙醇:4%,定容至1000ml)立即振蕩混勻。
[0023]2)65°C水浴5min使樣品完全裂解。12000rpm，4°C離心5min，取上清。
[0024]3)向上清液中加入等體積酚-氯仿混合物(酚:氯仿=25:24，pH4.5)混勻，12000rpm, 4°C離心 5min,取上清。
[0025]4)將得到的上清重復步驟3)的操作；
[0026]5)向步驟4)的上清液中加入等體積氯仿,混勻，12000rpm,4°C離心5min,取上清。
[0027]6)上清中加入 1/3 體積 8mol/L LiCl，混勻，-20°C 放置 lh，12000rpm4 °C 離心lOmin,棄上清,得RNA沉淀。
[0028]7)用 100 μ I 的 DEPC-treated ddH20 溶解 RNA 沉淀,加入 1/10 體積 3mol/L 醋酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積無水乙醇，_20°C放置15min, 12000rpm，4°C離心lOmin，棄上清。
[0029]8)用700 μ I濃度為75%的乙醇洗滌沉淀，12000rpm，4°C離心4min，棄上清，得沉淀物。
[0030]9)沉淀物再重復上一步操作；
[0031]10)將沉淀物置室溫干燥6min，徹底揮發(fā)殘留的乙醇。得到蘋果組織總RNA。
[0032]蘋果組織RNA瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1中左邊的標記I所示。
[0033]將蘋果組織總RNA溶于50 μ I的DEPC-treated ddH20中，_70°C長期保存。
[0034]實施例2:
[0035]I)取50mg蘋果皮用液氮研磨成粉末，加800 μ I裂解液(由以下物質(zhì)制備:CTAB:2%, Tris-HCl (ρΗ8.0):200mmol/L ；EDTA (ρΗ8.0):25mmol/L, NaCl:2mol/L, PVP-40:2% ； 巰基乙醇:2%,定容至1000ml),立即振蕩混勻。
[0036]2) 65°C水浴6min使樣品完全裂解，12000rpm，4°C離心6min，取上清。
[0037]3)向上清中加入等體積酹-氯仿(酹:氯仿=25:24,pH4.5)混勻，12000rpm, 4°C離心5min,取上清。
[0038]4)將得到的上清液重復步驟3)的操作；
[0039]5)向步驟4)的上清中加入等體積氯仿,混勻，12000rpm,4°C離心5min,取上清。
[0040]6)加入 1/4 體積 IOmoI/L 的 LiCl，混勻，_20°C放置 lh, 12000rpm4°C離心 IOmin,
棄上清，得RNA沉淀。
[0041]7)用 80 μ I 的 DEPC-treated ddH20 溶解 RNA 沉淀,加入 1/10 體積的 3mol/L 醋酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積無水乙醇，_20°C放置15min，12000rpm，4°C離心12min，棄上清，得 沉淀物。
[0042]8)用600 μ I的濃度為75%的乙醇洗滌沉淀物，12000rpm，4°C離心5min，棄上清，
得沉淀物。
[0043]9)沉淀物再重復上一步操作；
[0044]10)將沉淀物置室溫干燥6min，徹底揮發(fā)殘留的乙醇。得到蘋果組織總RNA。
[0045]蘋果組織RNA瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1中中間的標記2所示。
[0046]將蘋果組織總RNA溶于50 μ I的DEPC-treated ddH20中，_70°C長期保存。
[0047]實施例3:
[0048]I)取30mg蘋果花用液氮研磨成粉末，加900 μ I裂解液(由以下物質(zhì)制備:CTAB:3%, Tris-HCl (ρΗ8.0):300mmol/L ；EDTA (ρΗ8.0):25mmol/L, NaCl:2mol/L, PVP-40:4% ；β -巰基乙醇:4%,定容至1000ml)立即振蕩混勻。
[0049]2)65°C水浴8min使樣品完全裂解。12000rpm4°C離心5min，取上清。
[0050]3)向上清中加入等體積酹-氯仿混合物(酹:氯仿=25:24,pH4.5)混勻，12000rpm,4°C離心5min,取上清。
[0051]4)將得到的上清重復步驟3)的操作；
[0052]5)向步驟4)上清中加入等體積氯仿,混勻，12000rpm,4°C離心5min,取上清。
[0053]6)加入 2/5 體積的 7mol/L 的 LiCl，混勻，_20°C放置 lh，12000rpm，4°C離心 lOmin，
棄上清，得RNA沉淀。
[0054]7)用 120 μ I 的 DEPC-treated ddH20 溶解 RNA 沉淀,加入 1/10 體積 3mol/L 醋酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積無水乙醇，_20°C放置20min, 12000rpm，4°C離心8min，棄上清，得
沉淀物。
[0055]8)用800 μ I濃度為75%的乙醇洗滌沉淀物，12000rpm，4°C離心6min，棄上清。
[0056]9)沉淀物再重復上一步操作；
[0057]10)室溫干燥5min，徹底揮發(fā)殘留的乙醇。得到蘋果組織總RNA。
[0058]蘋果組織RNA瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1中右邊的標記3所示。
[0059]將蘋果組織總RNA溶于50 μ I的DEPC-treated ddH20中，_70°C長期保存。
【權(quán)利要求】
1.一種蘋果組織總RNA的提取方法，其特征在于，按下述步驟操作: 1)取25mg-50mg蘋果組織，用液氮研磨成粉末，加800μ I~1000 μ I裂解液，振蕩混勻； 所述的裂解液由以下物質(zhì)制備:CTAB:2%~3%，Tris-HCl =IOOmmoI/L~300mmol/L ；EDTA:25mmol/L, NaCl:2mol/L, PVP-40:2% ~4% ； β -巰基乙醇:2% ~4%,定容至 1000ml ； 2)65°C水浴4~IOmin使樣品完全裂解，然后以12000rpm，4°C離心4~lOmin，取上清； 3)向上清中加入等體積的酚-氯仿混合物混勻，酚-氯仿混合物比例為酚:氯仿=25:24, pH4.5,12000rpm, 4°C離心 4 ~IOmin,取上清； 4)將得到的上清重復一次步驟3)的操作； 5)向步驟4)的上清中加入等體積氯仿,混勻，12000rpm,4°C離心4~IOmin,取上清； 6)上清中加入7~10mol/L的LiCl，使終濃度達到2mol/L，混勻，-20°C放置lh，12000rpm, 4°C離心8~15min,棄上清,得RNA沉淀； 7)用80~100μ I的DEPC-treated ddH20溶解RNA沉淀，加入1/10體積的3mol/L醋酸鈉和2.5倍體積的 無水乙醇，其中，醋酸鈉的pH值為5.2 ;-20°C放置15~25min，12000rpm，4°C離心8~15min,棄上清； 8)用500~1000μ I濃度為75%的乙醇洗滌RNA沉淀物，12000rpm, 4°C離心4~lOmin，棄上清，得沉淀物。 9)沉淀物再重復上一步操作； 10)將沉淀物置室溫下干燥4~lOmin，揮發(fā)殘留的乙醇，得到蘋果組織總RNA。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蘋果組織總RNA溶于50μ I的DEPC-treated ddH20 中，_70°C長期保存。
【文檔編號】C12N15/10GK103756996SQ201410008482
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月8日
【發(fā)明者】樊明濤, 徐穎, 李亞輝 申請人:西北農(nóng)林科技大學