一株產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株及其應(yīng)用，其特征在于，所述菌株在中國微生物菌株保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為：CGMCC?No.8312，保藏日期為：2013年10月9日，所述菌株分類命名為：海洋嗜鹽單胞菌SH-19(Halomonas?elongata)，所述菌株的16S?rDNA的多核苷酸序列為SEQ?ID?No.1所示的多核苷酸序列。本發(fā)明所述菌株SH-19可高效表達褐藻膠裂解酶，可應(yīng)用于高效生產(chǎn)褐藻膠裂解酶，本發(fā)明所述菌株SH-19的發(fā)酵培養(yǎng)基配料簡單，都是實驗室中非常普遍容易獲得的，發(fā)酵效果顯著，使褐藻膠裂解酶的生產(chǎn)成本大大降低，可應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。
【專利說明】一株產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于海洋生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種生產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 藻類被譽為“能源新秀”，與其他陸生植物相比，藻類可在單位養(yǎng)殖面積下獲得更高的生物量，也更容易大面積栽培和機械化采收。因此藻類漸漸成為現(xiàn)代的生物能源材料，在產(chǎn)量、產(chǎn)能以及總成本上都具有顯著優(yōu)勢。
[0003]褐藻中含有大量的褐藻膠，褐藻類本身的結(jié)構(gòu)復雜，其細胞壁組成成分褐藻膠難以降解，各種多糖緊緊結(jié)合成一個有機整體，復雜的結(jié)構(gòu)造成了藻類利用上的困難。這無形中增加了利用藻類生物能源生產(chǎn)的成本。另外，褐藻膠被裂解以后可以制備不同長度的寡糖，這種寡糖具有多種生物活性，具有潛在的產(chǎn)業(yè)價值。因此，致力于尋找經(jīng)濟高效的細胞壁多糖裂解酶成為研究熱點之一。
[0004]當前，常規(guī)的裂解酶存在水解效率低、產(chǎn)量低等問題。所以，通過現(xiàn)有的技術(shù)手段，對自然界及動物腸道內(nèi)的微生物資源進行挖掘，以期望得到一種在降解褐藻膠方面上能力突出的菌株。為后續(xù)的采用系統(tǒng)方法研究自然中降解策略，為發(fā)展有效褐藻加工技術(shù)提供重要的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的之一在于提供一株生產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株，本發(fā)明所述菌株是首次從海膽腸道研磨物中篩選得到，可以在最適條件下高效的合成褐藻膠裂解酶。
[0006]本發(fā)明目的之二在于提供一株生產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株的應(yīng)用，即將篩選出的Halomonas elongata SH-19菌株用于褐藻膠裂解酶的制備,從而高效的生產(chǎn)褐藻膠裂解酶，以彌補現(xiàn)有的褐藻膠水解效果差的不足。
[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為:
[0008]一株產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株，其特征在于，所述菌株在中國微生物菌株保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為=CGMCC N0.8312，保藏日期為:2013年10月9日，所述菌株分類命名為:海洋嗜鹽單胞菌SH-19 (Halomonas elongata)。
[0009]優(yōu)選的是，所述菌株篩選自海膽腸道。
[0010]一種產(chǎn)褐藻膠裂解酶的方法，其特征在于，應(yīng)用如權(quán)利要求1或2所述的菌株生產(chǎn)褐藻膠裂解酶。
[0011]優(yōu)選的是，所述的方法具體包括以下步驟:在褐藻膠裂解酶生產(chǎn)階段，生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為褐藻酸鈉，褐藻酸鈉在生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中的質(zhì)量百分比濃度為I~3%，氮源為硫酸銨或者氯化銨。
[0012]優(yōu)選的是，所述的方法具體包括以下步驟:
[0013]I)種子液制備階段:利用如權(quán)利要求1或2所述的菌株制各種子液；[0014]2)菌種繁殖階段:將所述種子液接種于一次發(fā)酵培養(yǎng)基后，所述一次發(fā)酵培養(yǎng)基在pH為4.5~9.5和溫度為26~30°C的條件下進行連續(xù)發(fā)酵；
[0015]3)褐藻膠裂解酶生產(chǎn)階段:向所述一次發(fā)酵培養(yǎng)基中添加褐藻酸鈉和氯化鈉，配制成生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基，生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中的褐藻酸鈉和氯化鈉的濃度各為I~3%，所述生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為4.5~9.5，在26~30°C條件下連續(xù)發(fā)酵8~14天。
[0016]優(yōu)選的是，所述一次發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:碳源、氮源和陳海水，其中，碳源為牛肉膏或/酵母浸提物，所述氮源為硫酸銨或氯化銨。
[0017]優(yōu)選的是，所述一次發(fā)酵培養(yǎng)基中牛肉膏和酵母浸提物的質(zhì)量百分比濃度各為0.1~1.5%，硫酸銨或者氯化銨的質(zhì)量百分比濃度為0.1-2%。
[0018]優(yōu)選的是，所述步驟3)中，褐藻酸鈉在生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中的質(zhì)量百分比濃度為1 %，氯化鈉在生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中的質(zhì)量百分比濃度為I%。
[0019]優(yōu)選的是，所述一次發(fā)酵培養(yǎng)基和所述生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基pH均為7.5~8.5。
[0020]優(yōu)選的是，所述一次發(fā)酵培養(yǎng)基和所述生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基pH均為7.5。
[0021]本發(fā)明的有益效果本發(fā)明所述菌株SH-19是首次從海膽腸道研磨物中篩選出來，在比較適宜的生長條件下可高效表達褐藻膠裂解酶，可應(yīng)用于高效生產(chǎn)褐藻膠裂解酶，本發(fā)明還對所述菌株SH-19高效表達褐藻膠裂解酶的生活條件進行了探索，獲得了所述菌株表達褐藻膠裂解酶的發(fā)酵培養(yǎng)中最優(yōu)碳源、最優(yōu)氮源、最優(yōu)氯化鈉濃度等生活條件，本發(fā)明所述菌株SH-19的發(fā)酵 培養(yǎng)基配料簡單，都是實驗室中非常普遍容易獲得的，發(fā)酵效果顯著，使褐藻膠裂解酶的生產(chǎn)成本大大降低，可應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明所述菌株與blast結(jié)果相近的菌的16srRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0023]圖2為本發(fā)明所述菌株在不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中時的酶活力和生物量比較圖。
[0024]圖3為本發(fā)明所述菌株在不同氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中時的酶活力和生物量比較圖。
[0025]圖4為本發(fā)明所述菌株在不同濃度氯化鈉的發(fā)酵培養(yǎng)基中時的酶活力和生物量比較圖。
[0026]圖5為本發(fā)明所述菌株在不同pH值的發(fā)酵培養(yǎng)基中時的酶活力和生物量比較圖?！揪唧w實施方式】
[0027]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。
[0028]本發(fā)明篩選的Halomonas elongata SH-19菌株在中國微生物菌株保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為=CGMCC N0.8312，保藏日期為:2013年10月9日，所述菌株分類命名為:海洋嗜鹽單胞菌SH-19 (Halomonas elongata)，所述菌株的16S rDNA的多核苷酸序列為SEQ ID N0.1所示的多核苷酸序列。
[0029]Halomonas elongata SH-19 的形態(tài)特征:
[0030]菌落為圓形，光滑、規(guī)則、有光澤、不透明、棕色菌落。直徑在2_3mm。菌體寬度
0.5-0.8 μ m，長度1-2 μ m，革蘭氏染色呈陽性。[0031]菌種的基因組學鑒定:
[0032]通過對菌株SH-19的16SrDNA序列測定,將該菌16s rDNA片段與Genbank中序列進行比對從而確定該菌的種屬，得到該菌株是一株極端嗜鹽菌屬細菌。
[0033]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明實施過程作詳盡描述:
[0034]實施例1菌株的篩選與鑒定
[0035]1、產(chǎn)酶菌株的篩選
[0036] 本發(fā)明是用研磨后的海膽腸道來篩選褐藻膠裂解酶的生產(chǎn)菌株，將海膽腸道研磨樣品倍比稀釋后于褐藻酸鈉為唯一碳源篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，挑取可在篩選培養(yǎng)基中生存的菌株用于褐藻膠裂解酶的發(fā)酵生產(chǎn)，菌株經(jīng)鑒定后冷凍保存于甘油管中。具體步驟如下:
[0037]將研磨后的海膽腸道樣品倍比稀釋后涂布于褐藻酸鈉為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基中，置于25°C~30°C下培養(yǎng)I~7天.選取可在此條件下生長的菌落，獲得的發(fā)酵菌株挑選產(chǎn)酶活最高的一株經(jīng)16s rDNA序列分析鑒定為Halomonas sp.,命名為Halomonaselongata SH—19。
[0038]篩選培養(yǎng)基組成為(w/v):褐藻酸鈉I~2 %，硫酸銨0.5~2 %，鐵0.1~I %，瓊脂 1.5 ~2.5%，添加 1000ml 陳海水，pH=7.6 ~8.5。
[0039]2、Halomonas elongata SH-19 的形態(tài)特征
[0040]本發(fā)明獲得的菌株其菌落為圓形，光滑、規(guī)則、有光澤、不透明、白色菌落邊緣略帶黑色環(huán)。直徑在2-3mm。菌體寬度0.5-0.8 μ m，長度1-2 μ m，革蘭氏染色呈陽性。
[0041]3、菌株的基因組學鑒定
[0042]利用菌落PCR方法,將菌株16s rDNA片段與Genbank中序列進行比對從而確定該菌的種屬。
[0043]I)菌落 PCR:
[0044]將篩選到的菌株在篩選培養(yǎng)基中劃線純培養(yǎng)三代后將單菌落挑出進行菌落16srDNA PCR，期望得到該菌的16s rDNA特征片段與Genbank比對確定該菌株的種屬特性。
[0045]16s rDNA 引物為:1492R:5，-TACCTTGTTACGACTT-3，
[0046]27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
[0047]擴增體系:
【權(quán)利要求】
1.一株產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株，其特征在于，所述菌株在中國微生物菌株保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為=CGMCC N0.8312，保藏日期為:2013年10月9日，所述菌株分類命名為:海洋嗜鹽單胞菌SH-19 (Halomonas elongata)。
2.如權(quán)利要求1所述產(chǎn)褐藻膠裂解酶的菌株，其特征在于，所述菌株篩選自海膽腸道。
3.一種產(chǎn)褐藻膠裂解酶的方法，其特征在于，應(yīng)用如權(quán)利要求1或2所述的菌株生產(chǎn)褐藻膠裂解酶。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，具體包括以下步驟:在褐藻膠裂解酶生產(chǎn)階段，生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為褐藻酸鈉，褐藻酸鈉在生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中的質(zhì)量百分比濃度為I~3 %，氮源為硫酸銨或者氯化銨。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，具體包括以下步驟: 1)種子液制備階段:利用如權(quán)利要求1或2所述的菌株制各種子液； 2)菌種繁殖階段:將所述種子液接種于一次發(fā)酵培養(yǎng)基后，所述一次發(fā)酵培養(yǎng)基在PH為4.5~9.5和溫度為26~30°C的條件下進行連續(xù)發(fā)酵； 3)褐藻膠裂解酶生產(chǎn)階段:向所述一次發(fā)酵培養(yǎng)基中添加褐藻酸鈉和氯化鈉，配制成生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基，生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中的褐藻酸鈉和氯化鈉的濃度各為I~3%，所述生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為4.5~9.5，在26~30°C條件下連續(xù)發(fā)酵8~14天。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述一次發(fā)酵培養(yǎng)基成分為:碳源、氮源和陳海水，其中，碳源為牛肉膏和酵母浸提物，所述氮源為硫酸銨或氯化銨。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述一次發(fā)酵培養(yǎng)基中牛肉膏和酵母浸提物的質(zhì)量百分比濃度各為0.1~1.5%，硫酸銨或者氯化銨的質(zhì)量百分比濃度為0.1-2%。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中，褐藻酸鈉在生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中的質(zhì)量百分比濃度為1 %，氯化鈉在生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基中的質(zhì)量百分比濃度為I %。
9.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述一次發(fā)酵培養(yǎng)基和所述生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基pH均為7.5~8.5。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述一次發(fā)酵培養(yǎng)基和所述生產(chǎn)發(fā)酵培養(yǎng)基pH均為7.5。
【文檔編號】C12N1/20GK103911315SQ201410008138
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年1月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月3日
【發(fā)明者】李德茂, 陳樹林, 張藩, 高峰 申請人:中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所