一種白色念珠菌檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種白色念珠菌（CA-DNA）檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應(yīng)液，所述核酸釋放劑包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mmol/L，氯化鉀20～300mmol/L，十二烷基磺酸鈉0.01～2%和乙醇0.05～1%；所述PCR反應(yīng)液中包含用于CA-DNA檢測(cè)的引物和探針序列如下，CA-DNA上游引物：CTCGTAGTTGAACCTTGG，CA-DNA下游引物：GCCTGCTTTGAACACTCT，CA-DNA探針：TTTTGATGCGTACTGGACCCTGT。使用本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)白色念珠菌的靈敏度高，定量線性范圍寬；應(yīng)用該試劑盒可以對(duì)血液、痰液、肺泡灌洗液等培養(yǎng)物中的CA-DNA進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，為診斷白色念珠菌感染提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種白色念珠菌檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供一種白色念珠菌檢測(cè)試劑盒，具體是一種基于熒光PCR的CA檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]白色念珠菌(Canidia Albicans，CA)是寄居在正常人體消化道、呼吸道和女性生殖道黏膜上的菌群，也是念珠菌屬中最常見(jiàn)的一種條件致病菌。近年來(lái)，由于免疫抑制劑的大量應(yīng)用，腫瘤放療、化療，侵入性治療和器官移植的開(kāi)展，以及大量廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用導(dǎo)致正常菌群失調(diào)，白色念珠菌的感染率和發(fā)病率較以往有明顯的增加。
[0003]白色念珠菌感染作為一種常見(jiàn)的侵襲性真菌感染，具有危害大，病程進(jìn)展快，預(yù)后差，給感染者的身體健康甚至生命帶來(lái)嚴(yán)重威脅等特點(diǎn)，臨床上主要通過(guò)直接涂片鏡檢、組織病理學(xué)方法、影像學(xué)方法、血清學(xué)方法等檢測(cè)白色念珠菌的感染，傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定方法和組織病理學(xué)方法是診斷侵襲性真菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)。但血培養(yǎng)和涂片直接鏡檢陽(yáng)性率較低；組織病理學(xué)方法為確診的重要手段，但需要進(jìn)行有創(chuàng)操作，對(duì)于白血病化療、粒細(xì)胞極低甚至缺乏的患者無(wú)疑會(huì)提高感染的風(fēng)險(xiǎn)，臨床應(yīng)用具有局限性；高分辨率CT對(duì)侵襲性真菌感染特別是肺部真菌感染的診斷具有一定的臨床價(jià)值，但影像學(xué)表現(xiàn)較臨床表現(xiàn)有延遲，而且特異性差、無(wú)法作為真菌感染確診證據(jù)。
[0004]近年來(lái)以DNA為基礎(chǔ)的PCR分子生物學(xué)檢測(cè)方法因快速、準(zhǔn)確而倍受關(guān)注，成為探索的熱點(diǎn)，主要包括巢式PCR (nest PCR)、實(shí)時(shí)突光定量PCR (real-time fluorescencequantify PCR)等。由于實(shí)時(shí)熒光定量PCR在速度、操作、特異性等多方面存在眾多優(yōu)勢(shì)，因此臨床上其中白色念珠菌感染早期診斷領(lǐng)域的應(yīng)用愈加廣泛，給臨床診斷和治療帶來(lái)了重要的指導(dǎo)意義。
[0005]運(yùn)用熒光PCR技術(shù)檢測(cè)白色念珠菌DNA主要包括白色念珠菌核酸提取和核酸PCR擴(kuò)增兩方面。
[0006]目前國(guó)內(nèi)臨床上主要采用機(jī)械破碎法對(duì)白色念珠菌核酸進(jìn)行提取:先將分泌物樣本濃縮、洗滌，再加裂解液，反復(fù)高速震蕩和高速離心，再取上清為模板。該方法優(yōu)點(diǎn)在于對(duì)于樣本中的PCR抑制物去除較徹底，但存在步驟繁瑣，操作時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)于操作人員技術(shù)水平要求高和需添置專(zhuān)門(mén)的設(shè)備等不足之處。
[0007]臨床上檢測(cè)CA-DNA的方法目前主要是基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的技術(shù)及其改進(jìn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展迅速的一種核酸檢測(cè)技術(shù)，使用一種帶有熒光檢測(cè)裝置的PCR擴(kuò)增儀，熒光檢測(cè)裝置能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長(zhǎng)的激發(fā)光，收集檢測(cè)熒光信號(hào)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的動(dòng)態(tài)變化實(shí)時(shí)反映PCR的每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增水平，試驗(yàn)結(jié)束后可通過(guò)軟件自動(dòng)分析獲得擴(kuò)增曲線，根據(jù)擴(kuò)增曲線與熒光閾值線的交點(diǎn)(即Ct值)以及擴(kuò)增曲線的形狀，可以判斷陰陽(yáng)性結(jié)果；如果同一反應(yīng)中有已知濃度的定量參考品或標(biāo)準(zhǔn)品，則可以通過(guò)軟件自動(dòng)分析獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此實(shí)現(xiàn)對(duì)未知樣本的定值(即定量檢測(cè))。與傳統(tǒng)的PCR相對(duì)比，其在反應(yīng)體系中增加了一條兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針。探針結(jié)構(gòu)完整時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，呈現(xiàn)淬滅效應(yīng)；如果擴(kuò)增過(guò)程中有靶序列的存在，隨著目標(biāo)片段的延伸，探針?lè)肿又饾u被Taq酶水解切斷，熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互解離，阻斷了二者間熒光能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被熒光檢測(cè)裝置收集。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號(hào)隨著目的片段的擴(kuò)增而呈現(xiàn)線性增強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)束后，可以通過(guò)熒光PCR儀自帶的軟件自動(dòng)分析數(shù)據(jù)，可以獲得陰陽(yáng)性結(jié)果和樣本濃度的定值結(jié)果，因此，該技術(shù)在靶多核苷酸樣品的檢測(cè)和定量分析中，已逐漸取代傳統(tǒng)的PCR方法，得到十分廣泛的應(yīng)用。
[0008]目前國(guó)外已有基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)CA-DNA的試劑盒，但這些試劑盒的核酸提取過(guò)程較復(fù)雜，樣本處理耗時(shí)長(zhǎng)，且在處理樣本時(shí)，樣本中的DNA存在損耗，尤其對(duì)于高濃度的樣本，裂解不充分、富集不完全，會(huì)造成DNA的大量丟失導(dǎo)致樣本定量偏低。且其檢測(cè)靈敏度不高，某些弱陽(yáng)性樣本經(jīng)常無(wú)法擴(kuò)增。這些試劑盒大多缺乏完善的質(zhì)控體系，還需要進(jìn)一步完善和提高技術(shù)水平，使此類(lèi)產(chǎn)品更加滿足臨床準(zhǔn)確診斷的需要。另外，受限于現(xiàn)有技術(shù)中針對(duì)CA-DNA檢測(cè)的引物探針序列，本領(lǐng)域還需要開(kāi)發(fā)出一種檢測(cè)CA-DNA特異性好且綜合性能優(yōu)良的PCR檢測(cè)試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明提供一種核酸釋放劑在白色念珠菌檢測(cè)中的應(yīng)用，所述核酸釋放劑包含莎梵婦(surfactin)0.01 ~0.5mmol/L,氯化鉀 20 ~300mmol/L,十二烷基橫酸鈉 0.01 ~2%和乙醇0.05~1%。
[0010]在本發(fā)明所述核酸釋放劑中，其溶劑可以為本領(lǐng)域常用的，例如為無(wú)菌水或TE緩沖液。本發(fā)明首次披露在CA檢測(cè)中使用含強(qiáng)蛋白變性劑的核酸釋放劑，在很大程度上簡(jiǎn)化了該核酸檢測(cè)的步驟，而且檢測(cè)靈敏度有了很大的提高。
[0011]本發(fā)明提供一種白色念珠菌(CA-DNA)檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應(yīng)液，所述核酸釋放劑包含莎梵婦(surfactin) 0.01~0.5mmol/L,氯化鉀20~300mmol/L，十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇0.05~1% ;所述PCR反應(yīng)液中包含用于CA-DNA檢測(cè)的引物和探針序列如下，
[0012]CA-DNA 上游引物:CTCGTAGITGAACCTTGG，
[0013]CA-DNA 下游引物:GCCTGCITTGAACACTCT，
[0014]CA-DNA 探針:TTTTGATGCGTACTGGACCCTGT。
[0015]使用本發(fā)明試劑盒中的核酸釋放劑釋放核酸的方法與煮沸法提取核酸的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有明顯差異，而本發(fā)明中提取核酸時(shí)采用強(qiáng)烈的蛋白變性劑，快速破壞病原體外殼蛋白結(jié)構(gòu)，釋放出病原體核酸，無(wú)需加熱即可完成DNA的釋放和提??；本發(fā)明試劑盒檢測(cè)CA的靈敏度高，定量線性范圍寬。另外，本發(fā)明的試劑盒因采用用于檢測(cè)靶多核苷酸的上述引物和探針序列，具 有很好的特異性。
[0016]本發(fā)明中，優(yōu)選所述試劑盒中還包括內(nèi)標(biāo)，且所述PCR反應(yīng)液中還包含用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的引物和探針序列，
[0017]內(nèi)標(biāo):GACGCAGGACAGATAGCATCCGATCCGTCTGCGTTAACAATTTTTTCCACAAAACGCCCCCTTCCGTAGGACGATTATGCACACTTCCCCAAG ；
[0018]內(nèi)標(biāo)上游引物:GACGCAGGACAGATAGCATCCGATC，[0019]內(nèi)標(biāo)下游引物:GGGAAGTGTGCATAATCGTCCTACG，
[0020]內(nèi)標(biāo)探針:TGCGTTAACAATITITTCCACAAAA。
[0021]本發(fā)明中所述內(nèi)標(biāo)為插入pUC18T載體的一段長(zhǎng)為93堿基對(duì)的人工合成DNA序列的重組體，即質(zhì)粒，它作為PCR擴(kuò)增體系中的陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照，預(yù)防由于樣本中可能存在的PCR干擾物質(zhì)導(dǎo)致的假陰性。
[0022]優(yōu)選本發(fā)明所述試劑盒中還包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和0.5~2U/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同時(shí)在所述PCR反應(yīng)液中還包含dUTP。其中UNG酶的功能是降解含有dU的PCR產(chǎn)物，利用UNG酶和PCR反應(yīng)液中的dUTP可以起到預(yù)防PCR產(chǎn)物污染的作用，從而防止樣本檢測(cè)假陽(yáng)性。 [0023]在一個(gè)【具體實(shí)施方式】中，所述試劑盒中包括核酸釋放劑、內(nèi)標(biāo)、PCR反應(yīng)液、酶混合液、CA定量參考品、CA陽(yáng)性對(duì)照、CA陰性對(duì)照和CA濃縮液。
[0024]本發(fā)明還提供一種白色念珠菌CA-DNA檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液中包含用于CA-DNA檢測(cè)的引物和探針序列如下，
[0025]CA-DNA 上游引物:CTCGTAGTTGAACCTTGG，
[0026]CA-DNA 下游引物:GCCTGCTTTGAACACTCT，
[0027]CA-DNA 探針:TTTTGATGCGTACTGGACCCTGT。
[0028]本發(fā)明提供的白色念珠菌熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒操作快速、方法簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)范圍寬，應(yīng)用該試劑盒可以對(duì)血液、痰液、肺泡灌洗液等培養(yǎng)物中的CA-DNA進(jìn)行快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，為診斷白色念珠菌感染提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【具體實(shí)施方式】
[0029]以下僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明公開(kāi)的技術(shù)范圍內(nèi)，可很容易進(jìn)行的改變或變化都涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以權(quán)利要求書(shū)的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
[0030]另外，如未做特殊交待，則本發(fā)明中的百分含量指質(zhì)量百分含量。
[0031]實(shí)施例1
[0032]本實(shí)施例提供一種具體的白色念珠菌檢測(cè)試劑盒，它包括如下組分:
[0033]①核酸釋放劑:包含莎梵婦(surfactin) 0.lmmol/L,氯化鉀100mmol/L,十二烷基磺酸鈉(SDS) 0.1%，0.1%的乙醇和溶劑TE緩沖液。
[0034]②內(nèi)標(biāo)(陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照):為插入PUC18T載體的一段長(zhǎng)為93堿基對(duì)的人工合成DNA序列的重組體，即質(zhì)粒，濃度為2.00E+05copies/ml,93堿基對(duì)的序列為:
[0035]5， -GACGCAGGACAGATAGCATCCGATCCGTCTGCGTTAACAATTTTTTCCACAAAACGCCCCCTTCCGTAGGACGATTATGCACACTTCCCCAAG-3’ ；
[0036]③PCR反應(yīng)液:包括10XPCR反應(yīng)緩沖液5 μ 1，0.2mmol/L的dNTP，用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上、下游引物均為0.3 μ mol/L，用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針為0.3 μ mol/L,用于內(nèi)標(biāo)片段擴(kuò)增的上下游引物均為0.lymol/L，用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的探針為0.lymol/L。其中，所述10XPCR反應(yīng)緩沖液為包括pH7.5的200mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液、30mmol/L氯化鎂溶液、500mmol/L氯化鉀溶液、0.2%的曲拉通溶液和10%的甲酰胺溶液；所述dNTP包括dATP、dCTP、dUTP、dGTP和dTTP ;所述用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上下游引物及用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針是源于白色念珠菌核酸的保守區(qū)域的引物和探針，其堿基序列分別為:
[0037]CA-DNA 上游引物:5 ’ -CTCGTAGTTGAACCTTGG-3 ’，
[0038]CA-DNA 下游引物:5，-GCCTGCTTTGAACACTCT-3，，
[0039]CA-DNA 探針:5，-TTTTGATGCGTACTGGACCCTGT-3，；
[0040]所述的用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的引物探針序列分別為:
[0041 ]內(nèi)標(biāo)上游引物:5 ’ -GACGCAGGACAGATAGCATCCGATC-3，，
[0042]內(nèi)標(biāo)下游引物:5’ -GGGAAGTGTGCATAATCGTCCTACG-3，，
[0043]內(nèi)標(biāo)探針:5’-TGCGTTAACAATITITTCCACAAAA-3’。
[0044]④酶混合液:包含5U/ Ul的耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和0.1U/ Ul的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)。
[0045]⑤CA定量參考品:來(lái)源于使用CA企業(yè)定量線性參考品LI~L5定值后的CA強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)粒，該定量參考品包括A、B、C、D四個(gè)濃度組成的梯度參考品，其濃度分別為1.00~
5.00E+06CFU/ml (A)、1.00 ~5.00E+05CFU/ml (B)、1.00 ~5.00E+04CFU/ml (C)、1.00 ~5.00E+03CFU/ml (D)。
[0046]⑥CA陽(yáng)性對(duì)照:為臨床醫(yī)院收集的CA強(qiáng)陽(yáng)性樣本，其濃度為1.00~5.00E+05CFU/ml。
[0047]⑦CA陰性對(duì)照:為滅菌生理鹽水。
[0048]⑧CA濃縮液:聚乙二醇6000 (PEG_6000)10~100mmol/L (質(zhì)量/體積)，氯化鈉50~500mmol/L (質(zhì)量/體積)。
[0049]實(shí)施例2
[0050]本實(shí)施例提供上述實(shí)施例1所述試劑盒用于檢測(cè)血液、痰液、肺泡灌洗液培養(yǎng)物等未知樣本中CA-DNA的操作步驟:
[0051]一、試劑準(zhǔn)備
[0052]根據(jù)待測(cè)樣本、CA陰性對(duì)照、CA陽(yáng)性對(duì)照以及CA定量參考品A~D的數(shù)量，按比例取相應(yīng)量的PCR反應(yīng)液(38 Ul/人份)、酶混合液(2 Ul/人份)及內(nèi)標(biāo)1 Ul/人份，充分混勻成PCR-mix ;瞬時(shí)離心后備用。
[0053]二、核酸提取
[0054]1.待測(cè)樣本:取100 U I待測(cè)樣本，加入CA濃縮液100 U 1，振蕩混勻后12，OOOrpm離心5min，棄上清，沉淀中加入50 U l核酸釋放劑，震蕩或移液槍吸打混勻，100°C處理IOmin, 12000r/min離心3min,作為待測(cè)樣本備用。
[0055]2.CA陰性對(duì)照、CA陽(yáng)性對(duì)照、CA定量參考品:CA陰性對(duì)照、CA陽(yáng)性對(duì)照、CA定量參考品A~D分別取10 Ul與10 Ul核酸釋放劑混勻待用。
[0056]三、向PCR反應(yīng)管中加樣
[0057]每個(gè)PCR反應(yīng)管中加入上述第二步驟中處理后的待測(cè)樣本、CA陰性對(duì)照、CA陽(yáng)性對(duì)照以及CA定量參考品A~D各10 Ul ;靜置10分鐘后，每管加入步驟一中的PCR-mix40 u 1，吸打混勻2-3次，去除氣泡后蓋上管蓋，2000rpm離心30秒。
[0058]四、熒光PCR反應(yīng)與結(jié)果分析(在熒光定量PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行)
[0059]1)將PCR反應(yīng)管放入擴(kuò)增儀樣品槽，按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置待測(cè)樣本名稱(chēng)及定量參考品濃度。
[0060]2)突光檢測(cè)通道選擇:選擇FAM通道(Reporter: FAM, Quencher: None )檢測(cè)CA ;選擇 HEX 或 VIC 通道(Reporter: VIC, Quencher:None)檢測(cè)內(nèi)標(biāo)；參比突光(PassiveReference)設(shè)置為 none。
[0061]3)熒光定量PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表1:
[0062]表1
[0063]
【權(quán)利要求】
1.一種核酸釋放劑在白色念珠菌檢測(cè)中的應(yīng)用，所述核酸釋放劑包含莎梵婷(surfactin)0.01 ~0.5mmol/L,氯化鉀 20 ~300mmol/L,十二烷基橫酸鈉 0.01 ~2% 和乙醇 0.05 ~1%。
2.一種白色念珠菌CA-DNA檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括核酸釋放劑和PCR反應(yīng)液，所述核酸釋放劑包含莎梵婦(surfactin)0.01~0.Smmol /I,,氯化鉀20~300mmol/L,十二烷基磺酸鈉0.01~2%和乙醇0.05~1% ;所述PCR反應(yīng)液中包含用于CA-DNA檢測(cè)的引物和探針序列如下， CA-DNA 上游引物:CTCGTAGTTGAACCTTGG， CA-DNA 下游引物:GCCTGCTTTGAACACTCT，
CA-DNA 探針:TTTTGATGCGTACTGGACCCTGT。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括內(nèi)標(biāo)，且所述PCR反應(yīng)液中還包含用于檢測(cè)內(nèi)標(biāo)的引物和探針序列，
內(nèi)標(biāo):GACGCAGGACAGATAGCATCCGATCCGTCTGCGTTAACAATTTTTTCCACAAAACGCCCCCTTCCGTAGGACGATTATGCACACTTCCCCAAG ； 內(nèi)標(biāo)上游引物:GACGCAGGACAGATAGCATCCGATC， 內(nèi)標(biāo)下游引物:GGGAAGTGTGCATAATCGTCCTACG， 內(nèi)標(biāo)探針:TGCGTTAACAATTTTTTCCACAAAA。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括酶混合液，所述酶混合液中包含耐熱DNA聚合酶(Taq酶)和0.5~2U/ μ I的尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)，同時(shí)在所述PCR反應(yīng)液中還包含dUTP。
5.根據(jù)權(quán)利要求2~4中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括核酸釋放劑、內(nèi)標(biāo)、PCR反應(yīng)液、酶混合液、CA定量參考品、CA陽(yáng)性對(duì)照、CA陰性對(duì)照和CA濃縮液。
6.一種白色念珠菌CA-DNA檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液中包含用于CA-DNA檢測(cè)的引物和探針序列如下， CA-DNA 上游引物:CTCGTAGTTGAACCTTGG， CA-DNA 下游引物:GCCTGCTTTGAACACTCT，
CA-DNA 探針:TTTTGATGCGTACTGGACCCTGT。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103740834SQ201410017428
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2014年1月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月15日
【發(fā)明者】戴立忠, 張操昊, 鄧中平 申請(qǐng)人:湖南圣維爾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司