專利名稱：用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組被子植物的載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更特別地涉及植物遺傳工程。具體說，提供了一種用于在被子植物質(zhì)體(plastids)中有效導(dǎo)入和表達(dá)外源基因的DNA構(gòu)建體。公開了這些遺傳構(gòu)建體用于高效地得到轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組(transplastomic)植物的用途，其中轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物表達(dá)異源蛋白，特別是疫苗抗原和有藥學(xué)用途的蛋白。
背景技術(shù)：
植物遺傳工程已經(jīng)表明是一項對基礎(chǔ)研究和新的生物技術(shù)產(chǎn)品的商業(yè)化生產(chǎn)十分有生產(chǎn)價值的技術(shù)(Hammond J.Curr.Top.Microbiol.Immunol 1999，2401-19；Simoens C.和Van Montagu M.ReproductionUpdate 1995，1523-542)。
直到數(shù)年前，通過直接轉(zhuǎn)化方法或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物的焦點是嵌合基因如何穩(wěn)定地插入植物細(xì)胞的細(xì)胞核(見Hansen G.和Chilton M.D.Curr.Top.Microbiol.Immunol.1999，24021-57；Newell C.A.Mol.Biotechnol 2000，1653-65)。然而，目前核轉(zhuǎn)化的一些缺陷只能通過選擇新基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞器的方法來克服(見Bogorad L.Trends in Biotechnology 2000，18257-263；Heifetz P.B.Biochimie 2000，82655-666)。特別地，外源基因在質(zhì)體中表達(dá)同核表達(dá)相比，具有下面的優(yōu)點1)由于質(zhì)體基因組在每個細(xì)胞中的高拷貝數(shù)，轉(zhuǎn)入基因在質(zhì)體中的表達(dá)水平比細(xì)胞核中的高10到50倍；2)新基因通過同源重組的插入是位點專一的，避免了位置效應(yīng)，基因沉默和其它的影響轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞核中基因表達(dá)的不良現(xiàn)象；3)多順反子基因表達(dá)是可能的，這對于試圖制造新陳代謝途徑或改變多基因特征的工程是非常需要的；4)質(zhì)體的遺傳信息主要來自母本，減少了嵌合基因由于通過花粉擴(kuò)散到環(huán)境中而對自然界可能造成損壞的危險性。此外，質(zhì)體中基因的表達(dá)提供了在新的能夠提供更加穩(wěn)定和/或更加簡易純化方法的微環(huán)境中積累異源蛋白的可能性。
已經(jīng)報道了將基因轉(zhuǎn)入藻類和高等植物的質(zhì)體中的不同方法。具體說，常見的是用DNA包裹的加速微粒子進(jìn)行轟擊(Boynton J.E；GilhamE.H；Hosler J.P等Science 1988，2401534-1538；Daniell H；Vivekananda J；Nielsen B等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990，8788-92；Svab Z；Hajdukiewicz P；Maliga P.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990，878526-8530)，少數(shù)則使用PEG對植物的原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化(O′Neill C；Horvath G.V；Horvath E等Plant J 1993，3729-738；Golds T；Maliga P；Koop H-U.Biotechnology 1993，1195-97)，還有使用微注射的方法(Knoblauch M；Hibberd J.M；Gray J.C；van BelA.J.E.Nature Biotechnol 1999，17906-909)。
通過使用這些細(xì)胞器中天然存在的同源重組的有效機(jī)制，已經(jīng)將轉(zhuǎn)化的DNA序列穩(wěn)定地插入質(zhì)體基因組中(Blowers A.D；Bogorad L；Shark K.B.；Sanford J.C.Plant Cell 1989，1123-132；Staub J.M.和Maliga P.Plant Cell 1992，439-45；Kavanagh T.A；Thanh N.D；Lao N.T等Genetics 1999，1521111-1122)。需要著重強(qiáng)調(diào)的是DNA同源區(qū)域越大，重組的頻率就會越高，當(dāng)同源區(qū)域小于137bp時就可忽略不計了(Zoubenko O.V；Allison L.A；Svab Z；Maliga P.NucleicAcid Res 1994，223819-3824)。
許多區(qū)域被認(rèn)為是用于在植物質(zhì)體中插入嵌合序列的合適重組位點rbcL-accD，psbE-petA，trnV-16SrRNA操縱子，psbA-trnH，trnA-trnI，23SrRNA區(qū)等(Svab Z.和Maliga P.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993，90913-917；Zoubenko O.V；Allison L.A；Svab Z；Maliga P.Nucleic Acid Res 1994，223819-3824；Daniell H；DattaR；Varma S等Nature Biotechnol 1998，16345-348；US專利號5,877,402；WO9910513)。盡管這些區(qū)域中的一些被認(rèn)為用于在不同植物品種的質(zhì)體基因組中整合外源DNA序列是“通用的”，然而，由于以下一種或多種原因，它們普遍存在限制1)它們的序列和/或結(jié)構(gòu)在不同的植物品種的質(zhì)體基因組中不是高度保守的；2)它們的高同源區(qū)非常短，后面跟隨或者間隔了內(nèi)含子，或其它較低保守的區(qū)域(這降低了同源重組的頻率以及因此的轉(zhuǎn)基因質(zhì)體(轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組(transplastomics))植物的獲得量)；3)它們有時位于質(zhì)體的操縱子中，可是已知這些結(jié)構(gòu)體內(nèi)部的改變會影響每個操縱子基因的野生轉(zhuǎn)錄水平或多順反子的正確的加工(Ohme M；Kamogashira T；Shinozaki K；Sugiura M.Nucleic Acid Res 1985，131045-1056)，這會給質(zhì)體代謝造成不良后果。事實上，使用含有上述提到的區(qū)域作為重組位點的載體，在同期發(fā)表的刊物中，只報道了生產(chǎn)來自煙草(Svab Z.和Maliga P.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993，90913-917)，馬鈴薯(Sidorov V.A；Kasten D；Pang S.Z等Plant J 1999，19209-216)和西紅柿(Ruf S；Hermann M；Berger I.J等Nature Biotechnol 2001，19870-875)的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物不是偶然現(xiàn)象，上述茄科種(Solanaceus species)植物在進(jìn)化和DNA一級結(jié)構(gòu)水平上非常接近。此外，使用這些重組區(qū)域的載體顯示出同質(zhì)的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物(所有的質(zhì)體基因組都被均勻轉(zhuǎn)化的植物)的產(chǎn)率低，可能是因為這些載體包括使用了大于174bp的質(zhì)體來源的終止子區(qū)域和啟動子(Iamtham S.和Day A.Nature Biotechnol2000，181172-1176)，這樣由于載體元件和質(zhì)體基因組同源區(qū)域間的重組產(chǎn)生了非活力質(zhì)體，導(dǎo)致許多轉(zhuǎn)化失敗(Svab Z.和Maliga P.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993，90913-917；Kanevski I；Maliga P；Rhoades D.F；Gutteridge S.Plant Physiol 1999，119133-141)。
被子植物之間，結(jié)構(gòu)和核苷酸序列上更加普遍保守的質(zhì)體基因組區(qū)域是由分開轉(zhuǎn)錄的rbcL和atpB操縱子組成。事實上，這些含有大于1500bp的DNA片段的基因，在屬于不同綱(雙子葉和單子葉)的植物的質(zhì)體中有高于85％的同源性，而且在分析的同綱植物中核苷酸的同源性大于91％(見表1)。相反，這些操縱子間的基因間區(qū)域在雙子葉和單子葉植物的質(zhì)體基因組中則表現(xiàn)了很低的核苷酸同源性(低于50％)。
表1來源于不同種和綱的植物的rbcL和atpB基因的核苷酸序列同源性
核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)的大亞基由質(zhì)體基因rbcL編碼。試驗表明rbcL亞基的羧基末端區(qū)域形成了這個蛋白的8號α-螺旋，而且此區(qū)域涉及與由核基因rbcS編碼酶的小亞基的相互作用(Knight S；Andersson I；Branden C-I.J.Mol.Biol.1990，215113-160；Curmi P.M.G；Cascio D；Sweet R.M等J.Biol.Chem.1992，26716980-16989)。從這些和其它數(shù)據(jù)(Kanevski I；Maliga P；Rhoades D.F；Gutteridge S.Plant Physiol.1999，119133-141)開始，鑒于不同植物品種的質(zhì)體rbcL蛋白質(zhì)的C末端區(qū)域間的低度保守性，人們提出假設(shè)rbcL的α-螺旋8規(guī)定了Rubisco酶亞基間相互作用的種特異性。已經(jīng)表明可能由于一個位于rbcL啟動子(從轉(zhuǎn)錄起始點+1位至+26位)轉(zhuǎn)錄起始處附近的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，使產(chǎn)生的信使RNA變得穩(wěn)定，這種方式彌補(bǔ)了啟動子在黑暗期轉(zhuǎn)錄活性的下降(Shiina T；Allison L；Maliga P.The Plant Cell 1998，101713-1722)。同樣地，位于啟動子結(jié)構(gòu)區(qū)域附近或里面的各種序列片段與葉綠體DNA結(jié)合因子(CDF)的序列相似，可能在rbcL啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中起到重要作用。
已經(jīng)報道了atpB-atpE操縱子(編碼葉綠體ATP-合成酶的β亞基和ε亞基)轉(zhuǎn)錄/翻譯的一些標(biāo)志性特征(Shinozaki K；Deno H；Kato A；Sugiura M.Gene 1983，24147-155；Gatenby A.A；Rothstein S.；Nomura M.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989，864066-4070；KapoorS；Wakasugi T；Deno H；Sugiura M.Curr.Genet.1994，26263-268)。這兩個基因是重疊的，而且特別引人注意的是atpE的翻譯特征，因為它們基于開放閱讀框架移碼，和atpB編碼序列內(nèi)的保守區(qū)域含有一個atpE的可能啟動子(核苷酸序列+1027位至+1064位，編碼水稻，煙草等的atpB蛋白)。這個啟動子在體內(nèi)的功能還沒有得到證實，但不可忽略的是它可能在atpE表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中扮演一定角色。
atpB-rbcL基因間區(qū)域作為質(zhì)體中外源基因插入靶點的用途僅在歐洲專利No.0251654由Cannon M.C.和Cannon F.C.描述過。然而，這個專利提出使用細(xì)菌轉(zhuǎn)座子作為把外源基因引入兩個分散的轉(zhuǎn)錄操縱子之間的基因間區(qū)域的載體分子。Cannon M.C.和Cannon F.C.沒有成功得到轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物不是偶然的，因為轉(zhuǎn)座子插入基因間區(qū)域不僅防礙了atpB和rbcL啟動子之間已報道的相互作用(Hanley-Bowdoin L.和Chua N-H.Mol.Gen.Genet.1989，215217-224)，而且(例如，對玉米和水稻來說)中斷了從位于rbcL基因5’非翻譯區(qū)的NEP啟動子(核聚合酶依賴啟動子)開始的atpB基因的轉(zhuǎn)錄(Welhe A.和BrnerT.Trends in Plant Science 1999，4169-170)。顯然，精確的轉(zhuǎn)錄和由這些操縱子編碼的產(chǎn)物的表達(dá)調(diào)節(jié)對質(zhì)體的正確功能和活力來說，是絕對需要的。此外，Cannon M.C.和Cannon F.C.所述的表達(dá)載體不含有轉(zhuǎn)錄終止子，它是質(zhì)體中基因正確表達(dá)必不可缺的元件(Stern D.B.和Kindle K.L.Mol.Cell Biol.1993，132277-2285；Chen H.C.和Stern D.B.Mol Cell Biol.199l，114380-4388)。
除了可能細(xì)菌來源的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域之外(Chen L.J.和Orozco E.M.Jr.Nucleic Acid Res.1988，168411-8431)，還必須將轉(zhuǎn)入質(zhì)體的基因置于該細(xì)胞器中的功能啟動子的控制之下。在最常用的用于轉(zhuǎn)基因質(zhì)體中基因表達(dá)的啟動子中，最強(qiáng)的啟動子是16S rRNA的Prrn(SvabZ.y Maliga P.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993，90913-917)和PsbA(Daniell H.Methods in Molecular Biology 1997，62463-489)。Prrn啟動子是組成型的，然而PsbA啟動子產(chǎn)生的RNA轉(zhuǎn)錄和翻譯是受光誘導(dǎo)的，并且依賴5’非翻譯區(qū)。刪除了psbA基因的5’非翻譯區(qū)使得它的mRNA表達(dá)變成光非依賴型，盡管這會影響翻譯(Staub J.M.y Maliga P.Plant J.1994，6547-553；Eibi C；Zou Z；Beck A等Plant J.1999，19333-345)。這些啟動子有與細(xì)菌啟動子同源的-35和-10的一致序列，并且它們的轉(zhuǎn)錄依賴質(zhì)體基因組(PEP)編碼的聚合酶(Hess W.和Brner T.Int.Rev.Cytol.1999，1901-59)。
其它的質(zhì)體和細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄/翻譯的相似性也得到證實，多順反子mRNA可以在煙草質(zhì)體中表達(dá)和有效翻譯(Staub J.M.和Maliga P.PlantJ.1995，7845-848)；含有SD類似序列的核糖體結(jié)合位點(RBS)在葉綠體中是有功能的(Stern D.B；Higgs D.C；Yang J.Trends Plant Sci.1997，2308-315)。
為了方便篩選轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，在其它替代方案中，已經(jīng)提出使用陽性篩選標(biāo)記，比如卡那霉素(Daniell H.Methods in MolecularBiology 1997，62463-489)，或最常用的壯觀霉素(Svab Z；Hajdukiewicz P；Maliga P.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990，878526-8530；Svab Z.和Maliga P.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993，90913-917)；為了此目的，帶來對篩選試劑有抗性的基因被克隆到轉(zhuǎn)化載體中合適的控制信號下，以便在質(zhì)體中正確表達(dá)。
為了保護(hù)自然界，人們設(shè)計了“清除”技術(shù)允許在釋放到環(huán)境中時，從植物中除去編碼篩選標(biāo)記的基因。以下兩項技術(shù)成功地應(yīng)用到轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組的生產(chǎn)中兩個載體共轉(zhuǎn)化，隨后分離，并且除去攜帶篩選標(biāo)記的個體(Fisher N；Stampacchia O；Redding K；Rochaix J.D.Mol.Gen.Genet.1996，251373-380)，和將標(biāo)記基因插入表達(dá)盒中的兩個同向重復(fù)序列間，在隨后的使用非選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)周期中，允許通過同源重組除去這些基因(Fisher N；Stampacchia O；Redding K；RochaixJ.D.Mol.Gen.Genet.1996，251373-380；Iamtham S.和Day A.Nature Biotechnol.2000，181172-1176)。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供的用于在被子植物質(zhì)體中穩(wěn)定轉(zhuǎn)化和表達(dá)異源基因的載體含有一些獨有的特點1)不使用轉(zhuǎn)座子向質(zhì)體基因組中插入DNA片段；2)atpB和rbcL邊界區(qū)域?qū)儆诓煌V的被子植物，形成了人工基因間區(qū)域；3)人工基因間區(qū)域內(nèi)中轉(zhuǎn)錄非活性的多克隆位點允許插入一個或多個異源基因，而不會影響atpB和rbcL基因正確的轉(zhuǎn)錄，mRNA加工和表達(dá)；4)載體的設(shè)計允許當(dāng)核糖體結(jié)合位點位于編碼蛋白的序列之前時，轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)不一定需要攜帶啟動子區(qū)域和終止子區(qū)域(這有助于減少不良重組事件，而且節(jié)省質(zhì)體新陳代謝的資源，允許導(dǎo)入的外源DNA片段有更大的穩(wěn)定性和增加同質(zhì)體植物的產(chǎn)率)；5)本發(fā)明提出的邊界序列的結(jié)構(gòu)和序列保證了載體的通用性。此外，這里提供的載體構(gòu)成了一個用于向農(nóng)作物轉(zhuǎn)入基因時的“清除”工具，這是因為設(shè)計了一旦獲得同質(zhì)的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物后，通過同向重復(fù)序列間的同源重組允許除去篩選標(biāo)記。
帶有人工基因間區(qū)域的atpB-rbcL區(qū)域的設(shè)計和擴(kuò)展構(gòu)成了本發(fā)明目的的基礎(chǔ)，因為它允許我們以有效和穩(wěn)定的方式向任何種的被子植物的質(zhì)體基因組中插入基因和操縱子，而不會引起功能的改變。
對于設(shè)計人工基因間區(qū)域來說，必須要解決的問題是在該區(qū)域?qū)胪庠椿驅(qū)⒉粫绊憆bcL和atpB啟動子的相互作用和它們的野生轉(zhuǎn)錄水平。
另一方面，還必須考慮由atpB和rbcL基因產(chǎn)物作亞基組成的酶要執(zhí)行質(zhì)體和植物存活的重要功能。這種情況限制了選擇作為重組邊界的片段的長度，因為這些蛋白的某些區(qū)域會參與蛋白-蛋白的相互作用并且可能決定這些酶的不同亞基間的識別特異性以及它們的正確折疊和功能是合理的。
為了在不同種植物質(zhì)體中使用atpB-rbcL區(qū)域作為外源基因插入的重組位點，考慮生產(chǎn)雜種蛋白是重要的，因此上面所述內(nèi)容值得引起特別注意。以這種方式，為了避免干擾雜種Rubisco的正確折疊和功能，一定要在發(fā)生重組時保持編碼α螺旋8的rbcL基因區(qū)域不變。因此，在設(shè)計本發(fā)明的目的載體時，一定要使含有部分可翻譯的rbcL基因序列(更多的稱作rbcL-邊界)的，通過同源重組用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的DNA片段只應(yīng)延伸到α螺旋8的N-末端區(qū)域，特別是只到被子植物rbcL蛋白該部分中高度保守的色氨酸(Trp-411)位點。
關(guān)于atpB基因編碼區(qū)域，在比較來源不同種植物質(zhì)體的蛋白質(zhì)序列時，沒有發(fā)現(xiàn)任何有顯著變異的區(qū)域。然而，在選擇含有部分可翻譯的atpB基因序列(更多的稱作atpB-邊界)，作為通過同源重組使外源基因整合進(jìn)質(zhì)體的DNA片段時，要考慮atpB-atpE操縱子的轉(zhuǎn)錄/翻譯特征。
為了設(shè)計允許新基因插入質(zhì)體而不會影響atpB和rbcL的轉(zhuǎn)錄速率的人工基因間區(qū)域，我們利用了在比較來源不同種植物質(zhì)體的序列時，操縱子間在核苷酸水平表現(xiàn)低同源性的區(qū)域。
在本發(fā)明目的遺傳構(gòu)建體中，rbcL-邊界應(yīng)包括一個帶有基因的部分和整個5’調(diào)控區(qū)的DNA片段。這個片段含有1)結(jié)合有CDF序列的rbcL基因的PEP啟動子(依賴質(zhì)體編碼的聚合酶)；2)rbcL基因的5’非翻譯區(qū)，和3)截至N末端α螺旋8對應(yīng)區(qū)域的編碼rbcL蛋白的序列。因而，本發(fā)明目的載體中rbcL-邊界包括一個DNA片段，從煙草中編碼此蛋白的核苷酸序列的-291位延伸至始于該基因翻譯起始密碼子的+1233位(Trp-411所在的氨基酸序列位置)。需要指出的是當(dāng)試圖克隆rbcL-邊界時，我們發(fā)現(xiàn)rbcL基因從自身啟動子開始的表達(dá)對大腸桿菌是有毒的。因此，需要用“理想”lac操縱子來置換該基因5’非翻譯區(qū)的少量保守片段(Simons A；Tils D；von Wilcken-Bergmann B；Muller-Hill B.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1984，811624-1628)，并且將這個嵌和邊界克隆到一個低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體(pBR322)中，在1acIq大腸桿菌例如XL-1blue，JM 101等中繁殖。
在本發(fā)明目的遺傳構(gòu)建體中，作為atpB-邊界的DNA片段一定要包括1)相鄰的rbcL啟動子和轉(zhuǎn)錄起始位點附近的穩(wěn)定該啟動子產(chǎn)生的mRNA的莖-環(huán)狀序列；2)包括其NEP啟動子的atpB基因的啟動子；3)atpB基因的5’非翻譯區(qū)和4)截至基因終止密碼子前300bp的atpB編碼序列。以這種方式，設(shè)計本發(fā)明的目的載體時，atpB邊界從水稻中編碼蛋白的核苷酸序列的-654位延伸至始于該基因翻譯起始密碼子的+1211位。
在atpB-邊界中，rbcL啟動子與atpB基因相鄰可使目的基因以與atpB-atpE操縱子轉(zhuǎn)錄相反的方向穩(wěn)定地轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。便于用戶的是，可能克隆含有一個或多個受質(zhì)體中功能啟動子控制的外源基因的遺傳表達(dá)盒到rbcL啟動子下，這樣這些基因的表達(dá)將會由于兩個串聯(lián)的啟動子的轉(zhuǎn)錄而得到增強(qiáng)。
前面所述的邊界區(qū)域引入質(zhì)粒載體內(nèi)在大腸桿菌中維持和增殖，被含有用于插入將進(jìn)一步轉(zhuǎn)入質(zhì)體基因組的異源DNA的多克隆位點(MCS1，見圖1-A)的DNA片段隔開。按照這個結(jié)構(gòu)，atpB基因和rbcL基因?qū)⒎珠_轉(zhuǎn)錄，由于rbcL啟動子區(qū)域的復(fù)制，獲得的兩個同向重復(fù)DNA片段以含有多克隆位點的區(qū)域為邊界。然而，由于來自不同種被子植物質(zhì)體基因組之間，基因間區(qū)域在核苷酸水平的低同源性，預(yù)見不到我們的構(gòu)建體中重組事件，因為只有90bp的小片段有高度的同源性。
前面所述構(gòu)建體是本發(fā)明目的載體的基礎(chǔ)，其中編碼允許篩選陽性轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選標(biāo)記的基因?qū)⒁隡CS1(與rbcL-邊界同向，始于atpB-邊界的rbcL啟動子)，以一旦得到同質(zhì)的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物后，能夠通過同源重組除去標(biāo)記基因的同向重復(fù)DNA序列為邊界。標(biāo)記基因或引入MCS1的其它基因的轉(zhuǎn)錄將被位于與rbcL-邊界的5’末端相鄰的細(xì)菌終止子終止(優(yōu)選大腸桿菌的rrnB操縱子的rrnBT1T2雙向終止子(Brosius J；Dull T.J；Sleeter D.D；Noller H.F.J.Mol.Biol.1981，148107-127)，因此避免了插入基因的轉(zhuǎn)錄干擾rbcL-邊界啟動子的正常功能。
以這種方式，圖1-B顯示了本發(fā)明目的載體的基本結(jié)構(gòu)，其中目的基因插入atpB-邊界的rbcL啟動子下，形成單順反子或多順反子的轉(zhuǎn)錄單元(圖1-C)，或者其它質(zhì)體功能啟動子下，允許獲得例如，在兩個串聯(lián)的啟動子后的多順反子單元(圖1-D)，或者在啟動子區(qū)域的不同組合之后的兩個獨立的轉(zhuǎn)錄單元(圖1-E和圖1-F)。
為了便于篩選轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，我們決定使用潮霉素作為選擇標(biāo)記，盡管這種抗生素對象煙草這樣的雙子葉植物是極端有毒的，因此應(yīng)該小心使用，然而它作為獲得帶有遺傳修飾質(zhì)體的單子葉植物的篩選試劑會更加有效。用此種方式，含有適當(dāng)SD序列，在克雷白氏桿菌(Klebsiella)(Critz L.and Dvies J.Gene 1983，25179-188)中編碼抗潮霉素B的hgh基因被克隆到MCS1中，置于atpB-邊界的rbcL啟動子下(圖1-B)。
為了達(dá)到提供生態(tài)學(xué)工具的目的，本發(fā)明目的載體中的標(biāo)記基因被轉(zhuǎn)入兩個同向重復(fù)DNA序列的邊界處，當(dāng)同質(zhì)的(homoplasmic)轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物已經(jīng)得到后，一旦從培養(yǎng)基中除去篩選試劑，這兩個同向重復(fù)DNA序列通過同源重組將其除去(圖1-B)。用在構(gòu)建體中的重復(fù)序列來自編碼噬菌體T7的s10蛋白的DNA區(qū)域(Dunn J.J.和StudierF.W.J.Mol.Biol.1983，166477-535)。這些載體有只除去標(biāo)記基因的特性，這樣剩下的操縱子調(diào)控序列將維持不變(圖1-C，1-D，1-E和1-F)；因此，與標(biāo)記基因轉(zhuǎn)錄融合的任何基因?qū)⒉粫淖兯鼈兊谋磉_(dá)，以這種方式節(jié)約了載體的資源。本發(fā)明目的載體的結(jié)構(gòu)是它區(qū)別于其它所述系統(tǒng)中質(zhì)體遺傳轉(zhuǎn)化載體的另一個優(yōu)點。
顯然，帶來對抗生素如壯觀霉素(Chinault A.C；Blaskeley V.A；Roessler E；Willis D.G等Plasmid 1986，15119-131)或磺胺(Guerineau F.和Mullineaux P.Nucleic Acid Res 1989，174370)有抗性的其它基因，也能用于篩選轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物。同樣地，帶來對殺蟲劑如草甘膦(glyfosate)(Shah D.M；Horsch R.B；Klee H.J；Kishore G.M等.Science 1986，233478-481；Comai L；Facciotti D；Hiatt W.R；Thompson G等Nature 317741-744)，草銨膦(gluphosinate)(DeBlock M；Botterman J；Vandewiele M；Dockx J等EMBO Journal 1987，62513-2518)，磺草靈(asulam)(GuerineauF；Brooks L；Meadows J；Lucy A等Plant Mol Biol 1990，15127-136)，溴苯腈(bromoxinil)(Stalker D.M.等McBride K.E.J.Bacteriol 1987，169955-960)，磺酰脲和咪唑啉酮(LaRossa R.A和Smulky D.R.J.Bacteriol 1984，160391-394)等等，有抗性的基因也可被克隆到人工基因間區(qū)域并作為篩選標(biāo)記，其優(yōu)點是殺蟲劑耐性是農(nóng)業(yè)需要的特征。
本領(lǐng)域技術(shù)人員和熟知遺傳工程的人，根據(jù)這里所述內(nèi)容，顯然可以使用具有所述全部或部分特征的atpB和rbcL區(qū)域的任何組合，作為向質(zhì)體基因組整合基因的邊界區(qū)域，只要這些區(qū)域來自不同綱(單子葉或多子葉)的被子植物的質(zhì)體。同樣地，多個基因，篩選標(biāo)記以及順反子和操縱子的組合都可克隆到本發(fā)明目的載體的人工基因區(qū)域的MCS1(圖1-A)中，為了在任何被子植物質(zhì)體中穩(wěn)定地插入和表達(dá)它們。
微生物的保藏質(zhì)粒載體pVTPA-HB-aadA，pVTPA-f-GUS和pVIEP根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏在比利時微生物協(xié)調(diào)保藏中心BCCM，LMBP中心，編號分別為LMBP4635，LMBP4636和LMBP4637，保藏日為2002年9月24日。


圖1.A，本發(fā)明目的載體構(gòu)建的基本結(jié)構(gòu)，圖中表明含有多克隆位點(MCS1)的區(qū)域受到來源于不同綱(單子葉或雙子葉)的被子植物的 atpB邊界和 rbcL邊界的限制。
B，本發(fā)明目的載體的一般結(jié)構(gòu)，(rbcL基因的rbcLpr-啟動子，atpB基因的atpBpr-啟動子，非質(zhì)體來源的轉(zhuǎn)錄終止子，篩選標(biāo)記基因，通過同源重組允許除去標(biāo)記基因的R1，R2-同向重復(fù)序列)。
C，D，E，F(xiàn)，本發(fā)明目的載體的變體，圖中顯示了表達(dá)一個或多個作為單順反子單元(E，F(xiàn))，二順反子(C，E，F(xiàn))或三順反子(D)的目的基因(基因，基因1，基因2)的可能性，它們處于一個(C，E，F(xiàn))或多個(D，F(xiàn))質(zhì)體功能啟動子(Pr，Pr1，Pr2)的控制下。
圖2用于被子植物質(zhì)體轉(zhuǎn)化的載體pVTPA-f的圖譜。
圖3用于被子植物質(zhì)體轉(zhuǎn)化的載體pVTPA的圖譜。
圖4質(zhì)體中基因表達(dá)的中間載體pVIEP(S/D-Shine-Dalgarno序列)的圖。
圖510μg蔗糖梯度純化的葉綠體DNA用PstI消化與32P標(biāo)記的rbcL基因5′片段作為探針的Southern印跡。道1非轉(zhuǎn)化植物；道2-6轉(zhuǎn)化植物(可以看出所有植物都是同質(zhì)的)；道7和道8體外組培最后一個周期中，在缺乏篩選試劑的條件下生長的轉(zhuǎn)化植物(道7中注明標(biāo)記基因還沒有完全除去)。
圖6Western印跡顯示了使用本發(fā)明目的轉(zhuǎn)化載體，用于在葉綠體中表達(dá)乙肝表面抗原每道總共使用10μg的葉子蛋白。道1非轉(zhuǎn)化植物；道2-5表達(dá)HbsAg的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物(可以看見乙肝病毒抗體在預(yù)期的25kDa分子量處檢測到信號)。
圖7Western印跡顯示了使用本發(fā)明目的轉(zhuǎn)化載體，用于在質(zhì)體中表達(dá)單克隆抗體的重鏈和輕鏈每道總共使用10μg葉子蛋白。道1非轉(zhuǎn)化植物；道2-5表達(dá)重組抗體CB-Hep.1的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物(可以檢測到免疫球蛋白重鏈(50kDa)和輕鏈(25kDa)對應(yīng)的信號)。
實施例實施例1.用于在被子植物質(zhì)體中穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化和表達(dá)異源基因的載體的構(gòu)建。
a)rbcL-邊界的獲得通過使用SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所述的寡核苷酸，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增1524bp的與編碼煙草的rbcL蛋白的基因相對應(yīng)的DNA片段，得到rbcL-邊界片段。用來自N.tabacum var.SR1.葉子的純化的葉綠體DNA作PCR。擴(kuò)增的DNA片段克隆到用SpeI(Klenow)/EcoRV限制性內(nèi)切酶預(yù)先消化的pBScript SK載體(Stratagene，美國)，以生產(chǎn)pBSrbcL克隆。一些陽性克隆被完全測序，結(jié)果表明盡管在進(jìn)行PCR時使用了高保真的DNA聚合酶(Pfu DNA聚合酶，Promega，USA)，所有的克隆都出現(xiàn)了突變。這個事實和本發(fā)明不相關(guān)的其它證據(jù)，表明煙草的rbcL蛋白當(dāng)從自身啟動子開始表達(dá)時，對大腸桿菌是有毒的。因此，我們決定用含有一個“理想”lac操縱子的允許在lacI+大腸桿菌中克隆邊界片段的DNA的片段來置換rbcL基因的5’非翻譯區(qū)的低保守DNA片段。為了完成突變，用NcoI和EcoRI限制性內(nèi)切酶分別在-162位和-29位消化pBSrbcL13克隆子(在克隆的rbcL基因的SacII/BamHI片段中含有一個突變)，然后用帶有在rbcL基因(SEQ ID NO3)的-124位至-97位區(qū)域插入了“理想”lac操縱子的合成DNA片段來置換該片段。
一旦1ac操縱子插入pBSrbcL13克隆(現(xiàn)在稱為pBSrbcL131acOp)，用XbaI(Klenow)/SalI限制性內(nèi)切酶切除rbcL片段，并克隆到預(yù)先用SalI和EcoRV限制性內(nèi)切酶(修復(fù)的XbaI位點)消化的低拷貝載體pBR322(New England Biolabs，美國)中，獲得質(zhì)粒pBR322rbcL131acOp，其中rbcL基因按照SalI/XbaI方向轉(zhuǎn)錄。
然后，用來自另一個測序的pBSrbcL克隆的非突變的SacII/BamHI片段置換pBR322rbcL131acOp的SacII/BamHI片段，我們除去了rbcL13克隆子中存在的突變。用這種方式得到了含有rbcL-邊界(SEQ ID NO4)的質(zhì)粒pBR322rbcLOK。
b)atpB-邊界的獲得通過使用SEQ ID NO5和SEQ ID NO6所述的寡核苷酸，利用PCR擴(kuò)增1754bp的與編碼水稻的atpB蛋白的基因相對應(yīng)的DNA片段，獲得atpB-邊界片段。用來自O(shè)riza sativa var.IAC-18葉綠體純化的DNA作PCR。擴(kuò)增的DNA片段克隆到預(yù)先用HincII限制性內(nèi)切酶(HincII(SalI)限制酶切位點在克隆片段的5’區(qū)域得到修復(fù))消化的pBScript SK載體(Stratagene，美國)，用來生產(chǎn)pBSatpB克隆。一些陽性克隆被測序，然后選擇完全正確的克隆。
正確的pBSatpB克隆在片段(原始序列得到修復(fù)，SalI位點在克隆后丟失)的5’端用HindIII和SalI限制性內(nèi)切酶消化，用于克隆帶有附加限制酶切位點和含有NEP啟動子(SEQ ID NO7)的水稻atpB基因的5’非翻譯區(qū)的一部分的合成DNA片段，得到質(zhì)粒pBSatpBcmoplete。在該質(zhì)粒中，atpB基因按照從HindIII到XhoI的方向轉(zhuǎn)錄。構(gòu)建的atpB-邊界的核苷酸序列如SEQ ID NO8所示。
c)帶有重復(fù)邊界的篩選盒的獲得由質(zhì)粒pBSBar開始得到1kb的含有編碼潮霉素抗性(hgh)的基因的DNA片段，是通過使用SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所述的寡核苷酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在基因翻譯起始處前引入7bp的SD序列和便于該片段操作的限制酶切位點。用KpnI限制性內(nèi)切酶消化擴(kuò)增的DNA片段，然后克隆到KpnI/SmaI-消化的pUC19載體(克隆后SmaI位點保留)，產(chǎn)生質(zhì)粒pUC19Hyg。隨后，獲得的質(zhì)粒用HindIII和SmaI限制性內(nèi)切酶消化，它被引入含有用于進(jìn)一步基因操作(SEQ ID NO11)的限制酶切位點的合成DNA片段。得到的質(zhì)粒載體稱為pUC19-接頭-Hyg。
一旦獲得同質(zhì)的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，用于通過同源重組除去標(biāo)記基因的重復(fù)DNA片段是由編碼存在于pET3xb表達(dá)載體(Novagen，美國)中的噬菌體T7的s10蛋白的DNA片段得到的。pET3xb載體首先用BamHI和NdeI消化，得到的780bpDNA片段再用TaqI(Klenow)和KpnI消化，得到的約310bp的DNA片段克隆到SmaI/KpnI-消化的pUC19載體中，用于獲得質(zhì)粒pUC-間隔區(qū)。
來自pUC19-間隔區(qū)310bp的s10基因片段以XbaI(Klenow)/KpnI片段，克隆到先用EcoRI(Klenow)/KpnI消化的質(zhì)粒pUC19-接頭-Hyg中hgh基因的下游，產(chǎn)生了pUC19-接頭-Hyg-間隔區(qū)。
第二個310bp的重復(fù)片段以EcoRI(Klenow)/BamHI片段，克隆到先用SmaI和BglII限制性內(nèi)切酶消化的質(zhì)粒pUC19-接頭-Hyg-間隔區(qū)中hgh基因的上游，用來生產(chǎn)質(zhì)粒pUC-接頭-間隔區(qū)-Hyg-間隔區(qū)。
用BspHI消化，綠豆核酸酶處理和HindIII消化pTrcHisB表達(dá)載體(Invitrogen，美國)得到來自大腸桿菌的雙向終止子rrnBT1T2，用于將470bp的終止子片段克隆到先用HindIII和SmaI限制性內(nèi)切酶消化的pBScript SK載體中，得到質(zhì)粒pBS-rrnBT1T2。
最后，包含rrnBT1T2終止子的DNA片段作為HindIII(Klenow)/XbaI片段，克隆到先用BamHI(Klenow)/XbaI消化的質(zhì)粒pUC19-接頭-間隔區(qū)-Hyg-間隔區(qū)中與hgh基因相連的間隔區(qū)片段的下游，產(chǎn)生了質(zhì)粒pUC-接頭-間隔區(qū)-Hyg-間隔區(qū)-rrnBT1T2。從前面構(gòu)建體中切下含有從接頭到rrnBT1T2的表達(dá)盒以HindIII/XbaI片段，克隆到HindIII/XbaI-消化的pBScript SK載體以獲得帶有重復(fù)邊界的篩選表達(dá)盒的質(zhì)粒pUC-接頭-間隔區(qū)-Hyg-間隔區(qū)-rrnBT1T2(SEQ ID NO12)。
d)用于在被子植物的質(zhì)體中穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化和表達(dá)異源基因的載體，pVTPA-f的構(gòu)建本發(fā)明提出的用于在被子植物的質(zhì)體中穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化和表達(dá)異源基因的載體的裝配如下含有接頭-間隔區(qū)-Hyg-間隔區(qū)-rrnBT1T2的篩選盒以NotI(Klenow)/SalI片段克隆到先用EcoRI(Klenow)/SalI消化的載體pBR322中用于生產(chǎn)質(zhì)粒pBR322-sp-Hyg-sp-T。隨后，來自質(zhì)粒pBR332rbcLOK的rbcL-邊界以HindIII(Klenow)/XbaI片段克隆到用BamHI(Klenow)/XbaI消化的質(zhì)粒pBR322-sp-Hyg-sp-T以得到構(gòu)建體pBR-sp-Hyg-sp-T-rbcL。最后，來自pBSatpBcomplete質(zhì)粒的atpB-邊界以HindIII/XhoI片段克隆到用HindIII和SalI消化的質(zhì)粒pBR-sp-Hyg-sp-T-rbcL中。以這種方法獲得了具有圖1-B所述結(jié)構(gòu)的載體，稱為pVTPA-f(見圖2的結(jié)構(gòu)圖)。SEQ ID NO13顯示了位于pBR322運(yùn)送載體的+651位(SalI位點)和+1位(EcoRI位點)之間的來自pVTPA-f的DNA片段的核苷酸序列。
pVTPA-f載體的特征允許在被子植物質(zhì)體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化，并且獲得表達(dá)克隆到該載體的基因編碼的重組蛋白的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，只要這些基因在離它們的翻譯起始密碼子的合適距離處含有核糖體結(jié)合位點。
e)載體pVTPA允許幾個基因作為獨立轉(zhuǎn)錄單元在質(zhì)體中插入和表達(dá)的載體pVTPA-f的變體通過在pVTPA-f載體的克隆位點中插入能夠增強(qiáng)質(zhì)體中轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄終止的DNA序列獲得了允許幾個基因作為獨立轉(zhuǎn)錄單元在質(zhì)體中插入和表達(dá)的pVTPA-f的變體(見圖1-E)。為了此目的，例如包含質(zhì)體核糖體RNA(Prrn)(SEQ ID NO14)的16S亞基的啟動子和便于基因操作的克隆位點的合成DNA片段，被插入載體pBluescript SK的EcoRI和SmaI限制酶切位點之間，用于獲得質(zhì)粒pBSPrnn。隨后，包含Prrn啟動子的DNA片段以HindIII/MluI片段克隆到質(zhì)粒pVTPA-f中，產(chǎn)生了構(gòu)建體pVTPA(見圖3和SEQ ID NO15)。
實施例2異源單順反子單元在煙草轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物中的表達(dá)(pVTPA-f-GUS)。
為了使用載體pVTPA-f在轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組中表達(dá)異源基因，該基因必須攜帶一個位于翻譯起始密碼子上游約5至15bp處的核糖體結(jié)合位點(RBS)。為此原因，和達(dá)到便于在我們的載體中克隆外源基因的目的，設(shè)計了允許在此插入目的基因的中間載體(pVIEP)，然后用限制性酶消化切下它們，克隆到載體pVTPA-f或pVTPA中。向pVIEP載體中克隆基因引入一個RBS，同時允許增加轉(zhuǎn)錄終止子或附加的啟動子用于在本發(fā)明目的載體中正確的表達(dá)。
為了構(gòu)建載體pVIEP，包含帶有為了避免光對該基因的翻譯控制而刪除了部分5’非翻譯區(qū)(始于翻譯起始子的-68位和-25位之間)的煙草psbA基因的啟動子的DNA片段(PpsbA*，SEQ ID NO16)，以EcoRI/SmaI片段克隆到載體pBluescript SK中，以獲得質(zhì)粒pBSPpsbA*。隨后，含有微順反子(mini-cistron)(用于穩(wěn)定mRNA和幫助翻譯)的合成DNA片段，一個核糖體結(jié)合位點(RBS)和多克隆位點(SEQ ID NO17)，以NdeI/SacI片段克隆到質(zhì)粒pBSPpsbA*中PpsbA*啟動子的下游，產(chǎn)生了質(zhì)粒pBSPpsbA*-接頭。
最后，通過在BamHI/StuI-消化的質(zhì)粒pBSPpsbA*-接頭中，插入由BamHI/EcoRV消化質(zhì)粒pET3c(Novagen，美國)得到的噬菌體T7(Tφ)轉(zhuǎn)錄終止子，得到了pVIEP載體。序列SEQ ID NO18對應(yīng)于pVIEP載體(見圖4)中KpnI和第二個SalI位點之間的一級結(jié)構(gòu)。通過用EcoRI(綠豆核酸酶)/SnaBI消化pVIEP得到了缺少PpsbA*啟動子和微順反子的中間載體pVIEP的改型體(version)，然后再連接用于生產(chǎn)構(gòu)建體pVIEP-2。
為了在轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物中表達(dá)異源單順反子單元，由NcoI/SmaI消化質(zhì)粒pDMC200(CAMBIA)得到uidA基因(gus)，并連接到NcoI/SmaI-消化的pVIEP-2載體以獲得質(zhì)粒pVIEP-GUS。包含由質(zhì)粒pVIEP-GUS獲得的RBS融合的uidA基因的DNA片段，以HindIII/SmaI片段克隆到MluI(Klenow)/HindIII-消化的質(zhì)體轉(zhuǎn)化載體pVTPA-f中水稻rbcL啟動子的下游，得到構(gòu)建體pVTPA-f-GUS(SEQ ID NO19)。在轉(zhuǎn)化階段篩選維持期時，pVTPA-f-GUS載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物將表達(dá)處于rbcL啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下，作為雙-順反子單元的基因hgh和uidA；然而，一旦在非選擇條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物時，將通過同源重組除去標(biāo)記基因，而uidA基因的表達(dá)將由單順反子表達(dá)單元繼續(xù)維持。通過按照如下方法獲得的煙草轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物說明該構(gòu)建體的功能體外生長的4-6周齡植物的煙草(var.SR1)葉子遠(yuǎn)軸朝上地放置在補(bǔ)加了0.4M甘露醇(manitol)的誘芽培養(yǎng)基上(SIMS鹽和維生素(Murashige T.，Skoog F.Physiol.Plant.1962，15493-497)，BAP1mg/L，NAA 0.1mg/L，蔗糖25g/L，植物凝膠(phytagel)4g/L，pH5.7)，用于2-4小時的滲透性預(yù)處理。被DNA包裹的0.6μm的金粒子(BioRad)用于如發(fā)表所述的轟擊(Russell D.R.，Wallace K.M.，Bathe J.H.等Plant Cell Rep.1993，12165-169)。使用1100帕斯卡(psi)壓力的PDS-1000/He biolistic基因槍(Biorad)執(zhí)行轉(zhuǎn)化，射程是6cm，每個葉子樣品一槍。被轟擊的葉子在等滲培養(yǎng)基中維持14-16小時，然后在SI培養(yǎng)基中放置2天。隨后，將葉子切成小段(3mm×3mm)，遠(yuǎn)軸朝下地轉(zhuǎn)移到含有5mg/L潮霉素B(Duchefa，荷蘭)的SI培養(yǎng)基上。5-8周培養(yǎng)后，出現(xiàn)了抗性綠芽和愈傷組織；綠色的愈傷組織和芽被轉(zhuǎn)移到使用加大濃度的潮霉素B(10mg/L和15mg/L)的相同篩選培養(yǎng)基上用于第2次和第3次篩選周期。最后，抗性芽在添加了15mg/L潮霉素B的MS培養(yǎng)基(MS鹽和維生素，蔗糖30g/L，植物凝膠4g/L，pH5.8)上生根以獲得植株。所有培養(yǎng)階段使用16小時光照和8小時黑暗的制度。
根據(jù)Jefferson(Jefferson R.A.Plant Mol.Biol.Rep.1987，5387-405)的使用X-gluc的組織化學(xué)分析方法，檢測了一些抗潮霉素B的克隆的GUS活性。表2顯示了3次轉(zhuǎn)化試驗和它們對照物的結(jié)果。
表2.使用構(gòu)建體pVTPA-f-GUS得到轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物

此外，用PstI限制性內(nèi)切酶消化蔗糖梯度純化的葉綠體DNA，并使用標(biāo)記的rbcL基因片段作為探針的Sowthern印跡(Sambrook J.，F(xiàn)ritsch E.F.，Maniatis T.1989.分子克隆實驗手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社)表明，在一些隨機(jī)選擇的克隆中嵌和DNA片段整合到葉綠體基因組中(圖5)。所有檢測的陽性克隆產(chǎn)生了約6.8kb的預(yù)期帶，而陰性對照(非轉(zhuǎn)化植物)產(chǎn)生了21.5kb的預(yù)期帶。當(dāng)一些轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組克隆在非篩選培養(yǎng)基上繁殖時，在Southern印跡中觀察到這些克隆產(chǎn)生了5.5kb的雜交帶，這證實了通過位于基因邊界的同向重復(fù)序列之間的同源重組消除了標(biāo)記基因(hgh)。
一些生根的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組克隆被轉(zhuǎn)移到溫室中通過自花傳粉獲得種子。收獲的種子在MS培養(yǎng)基和補(bǔ)加了15mg/L潮霉素B的MS培養(yǎng)基中發(fā)芽，結(jié)果表明在這些克隆子中除去了標(biāo)記基因，然而GUS活性仍然維持不變，以此種方式證實了轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物的同質(zhì)(homoplasmic)狀態(tài)。
在我們的試驗中也注意到，不像使用壯觀霉素作為質(zhì)粒轉(zhuǎn)化試驗的篩選試劑時得到的結(jié)果，使用潮霉素B作為篩選試劑時，我們不會得到自發(fā)的突變體。然而，要再生轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物必須建立合適的篩選濃度。
這些試驗數(shù)據(jù)證實了本發(fā)明目的載體的功能和用于獲得表達(dá)任何來源的目的基因的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物的用途。
實施例3處于兩個質(zhì)體功能啟動子(pVTPA-aadA)控制下的異源單順反子單元在煙草轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物中的表達(dá)。
通過使用pVTPA載體，在質(zhì)體中處于Prrn和水稻rbcL啟動子控制下表達(dá)基因是可能的；為了此目的，使用序列SEQ ID NO20和SEQ IDNO21所述的寡核苷酸利用PCR從載體pDE1001(遺傳學(xué)系，吉特大學(xué)，比利時)中擴(kuò)增編碼酶氨基糖苷3’-腺苷酰轉(zhuǎn)移酶(aadA，帶來鏈霉素抗性和壯觀霉素抗性)的基因。擴(kuò)增的DNA片段克隆到XhoI(Klenow)-消化的載體pVTPA中，處于上面提到的兩個啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下，產(chǎn)生了構(gòu)建體pVTPA-aadA(SEQ ID NO22)。根據(jù)實施例2所述方法獲得煙草轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，具有在第一次篩選周期中用壯觀霉素(500mg/L)和在第二次篩選周期中用鏈霉素(500mg/L)篩選得到的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組克隆的特性。為了比較使用不同特征的載體獲得轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物的頻率，我們使用載體pVSR326MOD(ICGIB，New Delhi，印度)作了一些轉(zhuǎn)化試驗。該載體在煙草rbcL和accD基因之間插入了兩個表達(dá)盒，其中含有g(shù)us基因，處于psbA基因啟動子和終止子調(diào)節(jié)下；aadA基因，處于Prrn基因啟動子和rbcL基因終止子的控制下。經(jīng)過兩次再生/篩選周期和三次非選擇性室外培養(yǎng)周期后，所述轉(zhuǎn)化試驗的結(jié)果如表3所示。
表3.載體pVTPA-aadA和pVSr326MOD轉(zhuǎn)化頻率的比較

得到的實驗結(jié)果證實了我們的假設(shè)，沒有攜帶質(zhì)體來源的終止子序列的本發(fā)明目的載體提供了高產(chǎn)率的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物。此外，結(jié)果表明該載體提供了在兩個串聯(lián)的啟動子PrbcL和Prrn的轉(zhuǎn)錄控制下，表達(dá)外源基因(在本例中是aadA基因)的可能性。
實施例4異源雙-順反子單元在西紅柿轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物中的表達(dá)(pVTPA-f-GUS-aadA)。
本發(fā)明目的載體提供了以多順反子單元形式表達(dá)幾個基因的可能性。為了闡明這種可能性，在載體pVTPA-f-GUS(見實施例2)中，gus基因的下游插入aadA基因以形成三-順反子單元(認(rèn)為hgh標(biāo)記基因也將作為rbcL啟動子生產(chǎn)的mRNA的一部分表達(dá))，通過同源重組除去hgh篩選標(biāo)記后，該三-順反子單元僅表達(dá)編碼β-葡萄糖醛酸酶和氨基糖苷3’-腺苷酰轉(zhuǎn)移酶的基因。
如實施例3所述使用PCR擴(kuò)增aadA基因，然后克隆到質(zhì)粒pVTPA-f-GUS的ApaI位點(Klenow補(bǔ)平)中，產(chǎn)生了載體pVTPA-f-GUS-aadA(SEQ ID NO23)。這個新載體用于獲得西紅柿轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，按照下面所述的方法滅菌的西紅柿種子(var.Campbell-28)在半稀釋的MSO培養(yǎng)基(MS鹽，Gamborg B5維生素，蔗糖30g/L，植物瓊脂(phytoagar)8g/L，pH5.8)上發(fā)芽12天，在液體MSO培養(yǎng)基上收獲子葉葉子，然后遠(yuǎn)軸朝下地在每個含有添加了1mg/L玉米素和0.4M甘露醇的固體MSO培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)4小時，用于滲透性預(yù)處理。使用實施例2所述用于煙草的biolistic方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轟擊的子葉葉子在相同培養(yǎng)基上維持14-16小時，然后遠(yuǎn)軸朝上地在添加了1mg/L玉米素的MSO培養(yǎng)基上放置2天。隨后，轟擊的子葉葉子遠(yuǎn)軸朝上地轉(zhuǎn)移至添加了1mg/L玉米素和5mg/L潮霉素-B(Duchefa，荷蘭)的MSO培養(yǎng)基上。3-6周培養(yǎng)內(nèi)出現(xiàn)的抗性綠芽和愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有10mg/L濃度的潮霉素B的相同選擇培養(yǎng)基上，用于第二次篩選周期。3-4星期后，抗性綠芽和愈傷組織被轉(zhuǎn)移至含有0.1mg/L玉米素和15mg/L潮霉素-B的MSO培養(yǎng)基上，3周后在添加了15mg/L潮霉素-B的MSO培養(yǎng)基上生根。所有培養(yǎng)階段執(zhí)行16小時光照和8小時黑暗的制度。評估得到克隆對500mg/L鏈霉素(Spcr)的抗性以及GUS基因的表達(dá)情況(通過組織化學(xué)分析)。三次轉(zhuǎn)化試驗結(jié)果如下表所示表4.使用構(gòu)建體pVTPA-f-GUS-aadA得到西紅柿轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物

當(dāng)植物在溫室條件下培養(yǎng)時，無可鑒別的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組西紅柿和非轉(zhuǎn)化的西紅柿之間的表型差異，這樣驗證了雜種atpB和rbcL蛋白的功能以及遺傳操作蛋白提高質(zhì)體新陳代謝活性的可行性。
這個例子不僅說明了本發(fā)明目的載體作為相同mRNA的一部分用于表達(dá)各種基因的能力，而且證實了這些載體作為獲得與用于異源DNA整合進(jìn)質(zhì)體基因組的邊界序列的供體植物不同的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組被子植物的載體的通用性。
例5在煙草轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物中表達(dá)兩個獨立的轉(zhuǎn)錄單元(pVTPA-HB-aadA)。表達(dá)多聚體疫苗抗原的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物的獲得。
用EcoRI(Klenow補(bǔ)平)/NcoI消化質(zhì)粒pSA0503(CIGB，古巴)得到編碼乙肝表面抗原(HBsAg)(Valenzuela P；Gray P；Quiroga M；Zaldivar J；Goodman H.M；Rutter W.J.Nature 1979，280815-819)的基因，然后插入NcoI/SmaI-消化的pVIEP-2載體(見實施例2)，用于融合位于HBsAg翻譯起始密碼子上游的核糖體結(jié)合位點，通過這種方式得到了質(zhì)粒pVIEP-2-HB。用XhoI消化質(zhì)粒pVIEP-2-HB得到含有編碼乙肝表面抗原的820bp的DNA片段，然后克隆到SalI-消化的pVTPA-aadA載體中aadA基因的上游(見實施例3)，得到載體pVTPA-HB-aadA(SEQ ID NO24)，其中攜帶正確方向的HbsAg基因處于水稻rbcL啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下，而且也表達(dá)處于Prrn啟動子下游的標(biāo)記基因aadA和hgh。
載體pVTPA-HB-aadA按照實施例2所述轉(zhuǎn)化程序，用于獲得表達(dá)乙肝表面抗原的煙草轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物。最初用10mg/L潮霉素-B篩選轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，最后檢測對500mg/L壯觀霉素的抗性以及用ELISA特異分析(CIGB，古巴)和蛋白質(zhì)印記(圖6)檢測HbsAg的表達(dá)情況。得到的結(jié)果如表5所示
表5.使用構(gòu)建體pVTPA-HB-aadA得到煙草轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物

這些結(jié)果證實了本發(fā)明目的載體用于在轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物的基因組中作為獨立的轉(zhuǎn)錄單元，表達(dá)兩個或多個基因的用途。此外，證實了該載體在質(zhì)體中表達(dá)編碼形成多聚體復(fù)合物的有用蛋白的基因的用途。特別地，我們獲得了乙肝病毒表面多聚體抗原的表達(dá)。顯然，這里所述內(nèi)容可用于其它疫苗抗原，同樣地，一旦在植物細(xì)胞中表達(dá)，可用于配制提供給人或動物時能夠誘導(dǎo)針對這些傳染源的免疫性的制劑。該載體表達(dá)的其它多聚體蛋白可以是免疫球蛋白。
實施例6處于兩個啟動子和微順反子(pVTPA-GUS1-aadA和pVTPA-GUS3-aadA)控制下的異源基因在質(zhì)體中的表達(dá)。
用于在本發(fā)明目的載體中克隆和表達(dá)基因的中間載體(見實施例2)，允許克隆的基因處于設(shè)計的用于增加穩(wěn)定性和促進(jìn)產(chǎn)生的mRNA翻譯的PpsbA*啟動子和微順反子的控制下。如實施例2所述用于克隆基因uidA得到質(zhì)粒pVIEP-GUS1。
為了檢測微順反子的功能，構(gòu)建了一個遺傳構(gòu)建體，它是用SnaBI和NdeI消化質(zhì)粒pVIEP除去微順反子，用S1核酸酶作填平處理，然后再連接得到pVIEP-3載體，其中如前所述克隆uidA基因產(chǎn)生了質(zhì)粒pVIEP-3。含有g(shù)us基因的表達(dá)盒都是通過HindIII消化中間載體并克隆到pVTPA-aadA載體中得到的。最終獲得的構(gòu)建體含有處于水稻rbcL和PpsbA*啟動子控制下的gus基因，它們分別被命名為pVTPA-GUS1-aadA和pVTPA-GUS3-aadA。煙草植物的質(zhì)體如實施例2所述用這些質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
利用這些構(gòu)建體得到了轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，然后我們根據(jù)Jefferson(Jefferson R.A.Plant Mol.Biol.Rep.1987，5387-405)所述步驟，使用4-MUG熒光測定法，比較了來自每個構(gòu)建體的5個克隆的GUS表達(dá)水平。結(jié)果如表6所示。
表6.處于兩個啟動子和微順反子控制下的uidA基因在煙草質(zhì)體中的表達(dá)。

如前表所示，處于串聯(lián)的水稻rbcL和PpsbA*啟動子控制下，表達(dá)uidA基因的構(gòu)建體都表現(xiàn)了高水平的GUS活性。此外，表中顯示在攜帶含有微順反子的遺傳構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化植物中，GUS活性的平均值要高很多，這樣證明了這個遺傳元件在質(zhì)體中的功能以其作為在植物細(xì)胞器中增強(qiáng)基因表達(dá)的工具的用途。
例7使用構(gòu)建體pVTPA-f-GUS-aadA得到水稻轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物。
使用如下的步驟得到水稻轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物滅菌的成熟水稻種子在N6-2培養(yǎng)基上(N6-2培養(yǎng)基的鹽和維生素(Chu C.C等Scientia Sinic1975，18659)；肌醇0.1g/L；酪蛋白水解液1g/L；2，4D 2mg/L；蔗糖30g/L；植物凝膠3g/L，pH5.7)培養(yǎng)21天產(chǎn)生水稻胚體愈傷組織。這些愈傷組織在新鮮的N6-2培養(yǎng)基上再培養(yǎng)5天，然后在添加了3mg/L細(xì)胞分裂素的N6-2培養(yǎng)基上避光放置48-72小時。轟擊前，胚體愈傷組織在添加了0.4M甘露醇的相同培養(yǎng)基上作再培養(yǎng)用于滲透性預(yù)處理。每個培養(yǎng)皿中放置約30個愈傷組織，被質(zhì)粒pVTPA-f-GUS-aadA包裹的金粒子(0.6μm)用于如實施例2所述的轟擊。轟擊后的愈傷組織在相同的滲透性培養(yǎng)基上避光維持16小時，隨后在相同條件下的N6-2培養(yǎng)基上再培養(yǎng)2天。后來，愈傷組織被轉(zhuǎn)移至添加了20mg/L的潮霉素B的N6-2培養(yǎng)基上。10天后，抗生素抗性的愈傷組織被轉(zhuǎn)移至相同的新鮮培養(yǎng)基上用于10天的第二次篩選周期。最后，抗性愈傷組織被轉(zhuǎn)移至添加了30mg/L的潮霉素B的改良KIBAN再生培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基的鹽和維生素；細(xì)胞分裂素3mg/L；BAP 0.5mg/L；NAA 1mg/L；麥芽糖30g/L；植物凝膠3g/L，pH5.8)上，在16小時光照和8小時黑暗的光照周期培養(yǎng)3-4周后，得到的約2cm的綠芽轉(zhuǎn)移至添加了20mg/L的潮霉素B的改良液體MS培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基的鹽和維生素；蔗糖30g/L；BAP 5mg/L；pH5.7)中進(jìn)行微繁殖周期。芽放置在裝有這種液體培養(yǎng)基的50ml錐形瓶中，28℃，150rpm的振蕩速度，16小時光照和8小時黑暗的光照周期的條件下培育。孵育7天后，每個培養(yǎng)皿得到了約7個新芽，它們在含有30g/L蔗糖和30mg/L的潮霉素B的固體MS培養(yǎng)基上生根。評估得到的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組克隆的壯觀霉素抗性(500mg/L)以及用組織化學(xué)分析gus基因的表達(dá)情況。此外，結(jié)果證明在轟擊之前用細(xì)胞分裂素預(yù)處理細(xì)胞顯著地增加了轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物的產(chǎn)率。這些轉(zhuǎn)化試驗的結(jié)果如表7所示。
表7.用構(gòu)建體pVTPA-f-GUS-aadA在有和沒有細(xì)胞分裂素(細(xì)胞分裂素3mg/L)預(yù)處理的情況下，得到水稻轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物(var.IAC-28)

本實施例通過轉(zhuǎn)化單子葉植物證實了本發(fā)明目的載體的通用性和功能。
實施例8使用構(gòu)建體pVTPA-f-GUS-aadA得到甘蔗轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物。
使用如下方法得到甘蔗轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物6個月大的野生甘蔗(var.Ja60-5)的莖底部的幼葉切成0.5×1cm的片段，滅菌后在添加了3mg/L細(xì)胞分裂素的P+5固體培養(yǎng)基(MS鹽和維生素；肌醇100mg/L；酪蛋白水解液500mg/L；蔗糖20g/L；2，4D5mg/L；植物凝膠4g/L；pH5.7)上光照培養(yǎng)48小時。隨后，這些外植體在添加了0.4M甘露醇的相同培養(yǎng)基上光照放置6-8小時，用于轟擊前的滲透性預(yù)處理。被質(zhì)粒pVTPA-f-GUS-aadA包裹的金粒子(0.6μm)按照實施例2所述，使用PDS-1000/He系統(tǒng)(Bio-Rad)進(jìn)行轟擊。轟擊后的外植體在同樣的培養(yǎng)基上避光維持24小時，隨后在P+5培養(yǎng)基上放置2天，然后在添加了15mg/L潮霉素B的P+5培養(yǎng)基上避光培養(yǎng)。經(jīng)過4周的培養(yǎng)后，出現(xiàn)了潮霉素抗性愈傷組織，它們被轉(zhuǎn)移至光照的含有潮霉素B的P-固體培養(yǎng)基(不含有2，4D的P+5培養(yǎng)基)上用于再生。分離抗性的再生芽，使其在含有20mg/L的潮霉素B的P-培養(yǎng)基上生根。
評估得到的甘蔗克隆中的壯觀霉素(500mg/L)抗性以及gus基因的表達(dá)情況(通過組織化學(xué)分析)。兩次轉(zhuǎn)化試驗的結(jié)果如表8所示。
表8使用構(gòu)建體pVTPA-f-GUS-aadA得到甘蔗轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物

本實施例再次證實了本發(fā)明目的載體作為獲得與用于異源DNA整合進(jìn)質(zhì)體基因組的重組邊界序列的供體植物不同的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組被子植物的載體的通用性。
例9具有目的農(nóng)學(xué)特征的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物的獲得。
在針對害蟲，疾病，雜草，增產(chǎn)，降低成本和提高農(nóng)作物品質(zhì)的斗爭中，沒有傳播新基因到環(huán)境中的危險而得到含有新引入的農(nóng)業(yè)特征的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，是一個重要的目標(biāo)。
用XbaI(S1核酸酶補(bǔ)平)和BamHI消化質(zhì)粒pBS-Bar(C.I.G.B)得到編碼吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)(Thompson C.J；Movva N.R；Tizard R；Crameri R；Davies J.E等EMBO Journal 1987，62519-2523)的膦絲菌素(BASTATM除草劑的活性成分)乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因pat(bar)，克隆到用NcoI處理(S1核酸酶補(bǔ)平)和BamHI-消化的pVIEP-2載體(見實施例2)產(chǎn)生了質(zhì)粒pVIEP2-Bar。包含用XhoI消化pVIEP2-Bar得到的帶有一個RBS的pat基因的670bp的DNA片段，克隆到pVTPA載體中產(chǎn)生了構(gòu)建體pVTPA-Bar(SEQ ID NO25)。根據(jù)實施例2所述步驟得到了煙草轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，鑒定轉(zhuǎn)化子對培養(yǎng)基中5mg/L的膦絲菌素(Duchefa，荷蘭)的抗性。得到的結(jié)果如表9所示。
表9.使用構(gòu)建體pVTPA-Bar得到抗除草劑的煙草轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物

顯然，在本發(fā)明目的載體中克隆和表達(dá)帶來對除草劑例如，草甘膦，磺草靈(asulam)，磺酰脲類(sulphonilurea)，咪唑啉酮和溴苯腈抗性的其它基因，會產(chǎn)生抗這些化學(xué)藥品的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物。同樣地，顯然，使用本發(fā)明目的載體在轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物中克隆和表達(dá)帶來對害蟲和疾病有抗性的基因是可行的，例如編碼蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)的蛋白晶體的基因；或編碼有抗真菌活性如幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶的蛋白質(zhì)的基因；或有抗非生物壓力特性如膽堿氧化酶的蛋白質(zhì)的基因。修飾或引入增強(qiáng)光合作用效率或農(nóng)作物品質(zhì)的基因是使植物的一些功能能夠通過使用本發(fā)明提出的用于被子植物質(zhì)體轉(zhuǎn)化的通用載體得到提高。
實施例10非農(nóng)業(yè)用途的蛋白質(zhì)在質(zhì)體中的表達(dá)。
在實施例5中我們證實了本發(fā)明目的載體用于在被子植物質(zhì)體中穩(wěn)定地導(dǎo)入和表達(dá)編碼多聚體蛋白的基因的用途。利用我們的轉(zhuǎn)化/表達(dá)載體系統(tǒng)在轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物中生產(chǎn)其它有醫(yī)學(xué)，獸醫(yī)或工業(yè)用途的蛋白是同樣可行的。
為了在葉綠體中表達(dá)對治療血栓和心臟病非常有用的血纖維蛋白溶解劑鏈激酶，用EcoRI(S1核酸酶補(bǔ)平)和BamHI消化pEKG-3載體(Estrada M.P；Hernández L；Pérez A；Rodr íguez P；Serrano R；Rubiera R；Pedraza A等Bio/Technology 1992，101138-1142)，切下編碼鏈球菌成熟蛋白SKC-2的1254bp DNA片段，插入NcoI(S1核酸酶補(bǔ)平)/BamHI-消化的載體pVIEP(見實施例2)中得到質(zhì)粒pVIEP-Strep。用SalI/XhoI消化質(zhì)粒pVIEP-Strep得到用于在質(zhì)體中處于PpsbA*啟動子和微順反子控制下的鏈激酶基因的表達(dá)盒，然后克隆到SalI/XhoI-消化的pVTPA載體(見實施例1)以構(gòu)建質(zhì)粒pVTPA-Strep(SEQ ID NO26)。
用實施例2所述載體pVTPA-Strep轉(zhuǎn)化煙草植物的質(zhì)體。獲得的結(jié)果如表10所示(一些克隆中產(chǎn)生的鏈激酶血纖維蛋白溶解活性通過酪蛋白/血纖維蛋白溶解酶原平皿技術(shù)測定(Estrada M.P；Hernández L；Pérez A；Rodr íguez P；Serrano R；Rubiera R；Pedraza A；y otros.Bio/Technology 1992，101138-1142)。
表10.煙草質(zhì)體中鏈激酶的表達(dá)

這些結(jié)果證實了本發(fā)明目的載體用于在質(zhì)體中表達(dá)編碼有用蛋白的基因的用途，特別是如溶栓劑，干擾素，細(xì)胞因子，生長因子，激素，抗原，細(xì)胞受體等這樣有藥學(xué)或獸醫(yī)用途的特殊蛋白。顯然，通過使用本申請所述轉(zhuǎn)化/表達(dá)載體，這里舉例的內(nèi)容也可應(yīng)用到其它有工業(yè)用途的如脂肪酶，蛋白水解酶等酶和蛋白質(zhì)在質(zhì)體中的表達(dá)。
例11免疫球蛋白在質(zhì)體中的表達(dá)。
用NcoI/XbaI分別消化質(zhì)粒pHESΩHbsAgCL和pHESΩHBsAgCH(Nadia Ram írez，“轉(zhuǎn)基因煙草(Nicotiana tabacum L.)一種用于生產(chǎn)抗乙肝表面抗原的抗體及其片段的體系”，博士論文，C.I.G.B.，2002)，得到編碼特異于HBsAg的單克隆抗體CB-Hep.1的重鏈和輕鏈的DNA片段，然后插入NcoI/XbaI-消化的pVIEP載體用于制備質(zhì)粒pVIEP-Hc和pVIEP-Lc。隨后，用SnaBI/BamHI消化pVIEP-Lc載體，切下編碼輕鏈的DNA片段，插入SmaI/BamHI-消化的載體pVIEP-Hc中產(chǎn)生了雙順反子構(gòu)建體pVIEP-HcLc。進(jìn)一步，每個融合了RBS，包含重鏈和輕鏈的表達(dá)盒以HindIII片段克隆到pVTPA-f載體中；這樣，得到了質(zhì)粒pVTPA-f-HcLc。該質(zhì)粒按照實施例2所述用于煙草質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。
用western印跡分析得到的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，用于檢測CB-Hep.1單克隆抗體雙鏈的存在情況(圖7)；而且此外，通過用來自轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物的蛋白質(zhì)抽提物和綴合了堿性磷酸酶的兔抗鼠多克隆抗體作ELISA檢測HbsAg的存在證實了生產(chǎn)的重組免疫球蛋白的功能。
本試驗證明了使用我們的轉(zhuǎn)化/表達(dá)載體在轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物中生產(chǎn)全功能抗體的可能性，而且同時我們再次證實了在質(zhì)體中表達(dá)和正確裝配多聚體蛋白的可能性。
序列表<110>遺傳工程及生物工程學(xué)中心.
<120>用于制備被子植物質(zhì)體基因組轉(zhuǎn)化(transplastomic)植物的載體.
<130>用于質(zhì)體轉(zhuǎn)化的載體<140>0000<141>2002-08-05<160>26<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述相應(yīng)于煙草rbcL基因的-291至-270區(qū)(從翻譯起點)的寡核苷酸。
<400>1gggaagttct tattatttag g 21<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述相應(yīng)于煙草rbcL基因的+1213至+1233區(qū)(從翻譯起點)的寡核苷酸。
<400>2ccaaggatgt cctaaagttc 20<210>3<211>133<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述相應(yīng)于煙草rbcL基因的非翻譯lider的-162至-29區(qū)的合成DNA片段，帶有引入“理想的”lacO的修飾。
<400>3ccatggtcta ataatcaaac attctgatta gttgataatt caaattgtga gcgctcacaa 60tttgaaagat tcctgtgaaa agtttcatta acacggaatt cgtgtcgagt agaccttgtt 120gttgtgagaa ttc133<210>4<211>1523<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述rbcL-邊界的核苷酸序列。
<400>4gggaagttct tattatttag gttagtcagg tatttccatt tcaaaaaaaa aaaaagtaaa 60aaagaaaaat tgggttgcgc tatatatatg aaagagtata caataatgat gtatttggca 120aatcaaatac catggtctaa taatcaaaca ttctgattag ttgataattc aaattgtgag 180cgctcacaat ttgaaagatt cctgtgaaaa gtttcattaa cacggaattc gtgtcgagta 240gaccttgttg ttgtgagaat tcttaattca tgagttgtag ggagggattt atgtcaccac 300aaacagagac taaagcaagt gttggattca aagctggtgt taaagagtac aaattgactt 360attatactcc tgagtaccaa accaaggata ctgatatatt ggcagcattc cgagtaactc 420ctcaacctgg agttccacct gaagaagcag gggccgcggt agctgccgaa tcttctactg 480gtacatggac aactgtatgg accgatggac ttaccagcct tgatcgttac aaagggcgat 540gctaccgcat cgagcgtgtt gttggagaaa aagatcaata tattgcttat gtagcttacc 600ctttagacct ttttgaagaa ggttctgtta ccaacatgtt tacttccatt gtaggtaacg 660tatttgggtt caaagccctg cgcgctctac gtctggaaga tctgcgaatc cctcctgctt 720atgttaaaac tttccaaggt ccgcctcatg ggatccaagt tgaaagagat aaattgaaca 780agtatggtcg tcccctgttg ggatgtacta ttaaacctaa attggggtta tctgctaaaa 840actacggtag agccgtttat gaatgtcttc gcggtggact tgattttact aaagatgatg 900agaacgtgaa ctcacaacca tttatgcgtt ggagagatcg tttcttattt tgtgccgaag 960cactttataa agcacaggct gaaacaggtg aaatcaaagg gcattacttg aatgctactg 1020caggtacatg cgaagaaatg atcaaaagag ctgtatttgc tagagaattg ggcgttccga 1080tcgtaatgca tgactactta acggggggat tcaccgcaaa tactagcttg gctcattatt 1140gccgagataa tggtctactt cttcacatcc accgtgcaat gcatgcggtt attgatagac 1200agaagaatca tggtatccac ttccgggtat tagcaaaagc gttacgtatg tctggtggag 1260atcatattca ctctggtacc gtagtaggta aacttgaagg tgaaagagac ataactttgg 1320gctttgttga tttactgcgt gatgattttg ttgaacaaga tcgaagtcgc ggtatttatt 1380tcactcaaga ttgggtctct ttaccaggtg ttctacccgt ggcttcagga ggtattcacg 1440tttggcatat gcctgctctg accgagatct ttggggatga ttccgtacta cagttcggtg 1500
gaggaacttt aggacatcct tgg 1523<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述相應(yīng)于稻atpB基因的-543至-519(從翻譯起點)區(qū)的寡核苷酸。
<400>5gacttgagtt gttgttattg taag24<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述相應(yīng)于稻atpB基因的+1188至+1211(從翻譯起點)區(qū)的寡核苷酸。
<400>6atgtcctgaa gttctttgta acg 23<210>7<211>132<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述相應(yīng)于稻atpB基因的非翻譯lider的-654至-543區(qū)的合成DNA片段<400>7aagcttggcc aaaaaggccg tcgacaaaat ggggggcatg cttaagttaa tgaatatgtt 60tcattcatat aatatgtttc attcatatat aatgggtaca ccctgtgtac attctatgct 120ataggaattc at 132<210>8<211>1887
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述atpB-邊界的核苷酸序列。
<400>8aagcttggcc aaaaaggccg tcgacaaaat ggggggcatg cttaagttaa tgaatatgtt 60tcattcatat aatatgtttc attcatatat aatgggtaca ccctgtgtac attctatgct 120ataggaattc attcgacttg agttgttgtt attgtaagtt aacatgcttc gattattaaa 180ccatggattt gattcaccaa atccatcttt attgtatact ctttaataga tatagcgcaa 240ccccaaatca acttctaatc cttattaagt tcttaataga cccccttttc ttattttgag 300tggaaatacc taaatactac gaaaattctc tgttgacagc aatctatgct tcacagtagt 360atatattttg tatatcgaag tcctagataa gaaagtagag taggcacaaa tcgtttacaa 420aaggcaaaat gtatatgaaa aaaagattga ttgaactttc cgacggactc attccatgag 480taaacgattg aatgggattc gtttgggcaa cgaaatcaag tgctggtccc cttttctctc 540ttattgaatt aactaattca tttccttttg acttttggat ttttggatat ttttttggtg 600ttgatttggc attattcaac aagaaaaaaa tcaaaatttc gataaattcc ttttttttga 660aaattatgtg ataattatga gaaccaatcc tactacttct cgtcccgggg tttctacaat 720tgaagaaaaa agtacagggc gtatcgatca aattattgga cccgtgctgg atgtcacttt 780tcccccgggc aagttacctt atatttataa tgctttggta gtcaagagtc gagacactga 840cggtaagcaa attaatgtaa cttgtgaggt acaacaatta ttaggaaata atcgagttag 900agctgtagct atgagtgcta cagatgggtt gatgagagga atggaagtga ttgacacggg 960agctcctctc agtgttcctg tcggtggagc tactcttgga cgaattttca acgttcttgg 1020ggagcctgtt gacaatttgg gtcctgtaga tactagtgca acattcccta ttcatagatc 1080cgcgcccgcc tttatcgagt tagatacgaa attatccatc tttgaaactg gtattaaggt 1140ggtcgatctt ttagctcctt atcggcgtgg aggaaaaatc ggactatttg ggggagctgg 1200agtaggtaaa acagtactca tcatggaatt aatcaacaat attgctaaag ctcacggggg 1260cgtatccgta tttggcggag taggggaacg gactcgtgaa ggaaatgatc tttatatgga 1320aatgaaggaa tctggagtaa ttaatgaaaa aaatcttgag gaatcaaagg tagctctagt 1380ctatggccaa atgaatgaac cgccaggagc tcgtatgaga gttggtttga ctgccctaac 1440tatggcagaa tatttccgag atgttaataa gcaagacgtg cttctattca tcgataatat 1500ctttcgtttt gttcaagcag gatcggaggt atctgcctta ttagggagaa tgccctctgc 1560agtgggttat caacctactc ttagtacaga aatgggttct ttgcaagaaa gaattacttc 1620tactaaaaag ggatctataa cttcgatcca agcggtttat gtacctgcgg acgatttgac 1680cgaccctgct cctgctacaa catttgcaca tttggatgct actaccgtac tttccagagg 1740attagcttcc aaagggattt atcctgcagt agatccttta gattcaacct caactatgtt 1800acaacctcgg atcgttggca acgaacatta tgaaactgca caaagagtta agcaaacttt 1860acaacgttac aaagaacttc aggacat 1887<210>9<211>24<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述用于PCR擴(kuò)增hgh基因的寡核苷酸引物，具有RBS<400>9gggaggaatg agatatgaaa aagc 24<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述用于PCR擴(kuò)增hgh基因的寡核苷酸引物，具有添加的KpnI位點<400>10gtcggtacct actctatttc tttg 24<210>11<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述帶有用于構(gòu)建具有hgh基因的篩選盒的有用的限制位點的合成DNA片段<400>11aagcttgatt cgagtgaacg cgtatagggc ccgggagatc t41<210>12<211>2223<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述包含帶有克隆在pBluescript中的重復(fù)邊界的篩選盒的DNA片段的核苷酸序列<400>12
aagcttgatt cgagtgaacg cgtatagggc ccaattcgag ctcggtacca gcaccaccag 60cggtgaggtg cggaacttct acaacctcaa agcccataac gttgcggata gaacccttct 120cagggtcaat cagagcagcg tagtttgctg cgttcggcat cagtgctgcc agaatcgcag 180agtagctatc tgggtcacag tagaacacac ggtcagcagc cggaacatag ttcttggtca 240gagccgcacg agccttagtc agagccgcaa taatctcctt acccagcgca acttggtcgg 300tcaagtgcgg ccttgttctg agtggtctca attacggtag cagtacctaa gccctcgggg 360gatctgggga ggaatgagat atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt 420ttctgatcga aaagttcgac agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat 480ctcgtgcttt cagcttcgat gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg 540ccgatggttt ctacaaagat cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga 600ttccggaagt gcttgacatt ggggagttta gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc 660gtgcacaggg tgtcacgttg caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctacaac 720cggtcgcgga ggctatggat gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg 780gcccattcgg accgcaagga atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga 840ttgctgatcc ccatgtgtat cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg 900tcgcgcaggc tctcgatgag ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc 960tcgtgcacgc ggatttcggc tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg 1020tcattgactg gagcgaggcg atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct 1080tctggaggcc gtggttggct tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc 1140cggagcttgc aggatcgcca cgactccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac 1200tctatcagag cttggttgac ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg 1260acgcaatcgt ccgatccgga gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg 1320cggccgtctg gaccgatggc tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca 1380gcactcgtcc gagggcaaag aaatagagta ggtaccagca ccaccagcgg tgaggtgcgg 1440aacttctaca acctcaaagc ccataacgtt gcggatagaa cccttctcag ggtcaatcag 1500agcagcgtag tttgctgcgt tcggcatcag tgctgccaga atcgcagagt agctatctgg 1560gtcacagtag aacacacggt cagcagccgg aacatagttc ttggtcagag ccgcacgagc 1620cttagtcaga gccgcaataa tctccttacc cagcgcaact tggtcggtaa gtgcggcctt 1680gttctgagtg gtctcaatta cggtagcagt acctaagccc tcgggggatc agcttggctg 1740ttttggcgga tgagagaaga ttttcagcct gatacagatt aaatcagaac gcagaagcgg 1800tctgataaaa cagaatttgc ctggcggcag tagcgcggtg gtcccacctg accccatgcc 1860gaactcagaa gtgaaacgcc gtagcgccga tggtagtgtg gggtctcccc atgcgagagt 1920agggaactgc caggcatcaa ataaaacgaa aggctcagtc gaaagactgg gcctttcgtt 1980ttatctgttg tttgtcggtg aacgctctcc tgagtaggac aaatccgccg ggagcggatt 2040tgaacgttgc gaagcaacgg cccggagggt ggcgggcagg acgcccgcca taaactgcca 2100ggcatcaaat taagcagaag gccatcctga cggatggcct ttttgcgttt ctacaaactc 2160tttttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctgggggatc cactagttct 2220aga 2223<210>13<211>5669<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述來自載體pVTPA-f稻atpB和煙草rbcL邊界之間的DNA片段的核苷酸序列<400>13gtcgaggtca tgtcctgaag ttctttgtaa cgttgtaaag tttgcttaac tctttgtgca 60gtttcataat gttcgttgcc aacgatccga ggttgtaaca tagttgaggt tgaatctaaa 120ggatctactg caggataaat ccctttggaa gctaatcctc tggaaagtac ggtagtagca 180tccaaatgtg caaatgttgt agcaggagca gggtcggtca aatcgtccgc aggtacataa 240accgcttgga tcgaagttat agatcccttt ttagtagaag taattctttc ttgcaaagaa 300cccatttctg tactaagagt aggttgataa cccactgcag agggcattct ccctaataag 360gcagatacct ccgatcctgc ttgaacaaaa cgaaagatat tatcgatgaa tagaagcacg 420tcttgcttat taacatctcg gaaatattct gccatagtta gggcagtcaa accaactctc 480atacgagctc ctggcggttc attcatttgg ccatagacta gagctacctt tgattcctca 540agattttttt cattaattac tccagattcc ttcatttcca tataaagatc atttccttca 600cgagtccgtt cccctactcc gccaaatacg gatacgcccc cgtgagcttt agcaatattg 660ttgattaatt ccatgatgag tactgtttta cctactccag ctcccccaaa tagtccgatt 720tttcctccac gccgataagg agctaaaaga tcgaccacct taataccagt ttcaaagatg 780gataatttcg tatctaactc gataaaggcg ggcgcggatc tatgaatagg gaatgttgca 840ctagtatcta caggacccaa attgtcaaca ggctccccaa gaacgttgaa aattcgtcca 900agagtagctc caccgacagg aacactgaga ggagctcccg tgtcaatcac ttccattcct 960ctcatcaacc catctgtagc actcatagct acagctctaa ctcgattatt tcctaataat 1020tgttgtacct cacaagttac attaatttgc ttaccgtcag tgtctcgact cttgactacc 1080aaagcattat aaatataagg taacttgccc gggggaaaag tgacatccag cacgggtcca 1140ataatttgat cgatacgccc tgtacttttt tcttcaattg tagaaacccc gggacgagaa 1200gtagtaggat tggttctcat aattatcaca taattttcaa aaaaaaggaa tttatcgaaa 1260ttttgatttt tttcttgttg aataatgcca aatcaacacc aaaaaaatat ccaaaaatcc 1320aaaagtcaaa aggaaatgaa ttagttaatt caataagaga gaaaagggga ccagcacttg 1380atttcgttgc ccaaacgaat cccattcaat cgtttactca tggaatgagt ccgtcggaaa 1440gttcaatcaa tctttttttc atatacattt tgccttttgt aaacgatttg tgcctactct 1500actttcttat ctaggacttc gatatacaaa atatatacta ctgtgaagca tagattgctg 1560tcaacagaga attttcgtag tatttaggta tttccactca aaataagaaa agggggtcta 1620ttaagaactt aataaggatt agaagttgat ttggggttgc gctatatcta ttaaagagta 1680tacaataaag atggatttgg tgaatcaaat ccatggttta ataatcgaag catgttaact 1740tacaataaca acaactcaag tcgaatgaat tcctatagca tagaatgtac acagggtgta 1800cccattatat atgaatgaaa catattatat gaatgaaaca tattcattaa cttaagcatg 1860ccccccattt tgtcgacggc ctttttggcc aagcttgatt cgagtgaacg cgtatagggc 1920ccaattcgag ctcggtacca gcaccaccag cggtgaggtg cggaacttct acaacctcaa 1980agcccataac gttgcggata gaacccttct cagggtcaat cagagcagcg tagtttgctg 2040cgttcggcat cagtgctgcc agaatcgcag agtagctatc tgggtcacag tagaacacac 2100ggtcagcagc cggaacatag ttcttggtca gagccgcacg agccttagtc agagccgcaa 2160taatctcctt acccagcgca acttggtcgg tcaagtgcgg ccttgttctg agtggtctca 2220attacggtag cagtacctaa gccctcgggg gatctgggga ggaatgagat atgaaaaagc 2280
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cctgttggga tgtactatta aacctaaatt ggggttatct gctaaaaact acggtagagc 4980cgtttatgaa tgtcttcgcg gtggacttga ttttactaaa gatgatgaga acgtgaactc 5040acaaccattt atgcgttgga gagatcgttt cttattttgt gccgaagcac tttataaagc 5100acaggctgaa acaggtgaaa tcaaagggca ttacttgaat gctactgcag gtacatgcga 5160agaaatgatc aaaagagctg tatttgctag agaattgggc gttccgatcg taatgcatga 5220ctacttaacg gggggattca ccgcaaatac tagcttggct cattattgcc gagataatgg 5280tctacttctt cacatccacc gtgcaatgca tgcggttatt gatagacaga agaatcatgg 5340tatccacttc cgggtattag caaaagcgtt acgtatgtct ggtggagatc atattcactc 5400tggtaccgta gtaggtaaac ttgaaggtga aagagacata actttgggct ttgttgattt 5460actgcgtgat gattttgttg aacaagatcg aagtcgcggt atttatttca ctcaagattg 5520ggtctcttta ccaggtgttc tacccgtggc ttcaggaggt attcacgttt ggcatatgcc 5580tgctctgacc gagatctttg gggatgattc cgtactacag ttcggtggag gaactttagg 5640acatccttgg atctgcagct agttctaga 5669<210>14<211>176<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述編碼質(zhì)體16S核糖體RNA(Prrn)的啟動子區(qū)的合成DNA片段，帶有添加的限制位點<400>14gaattccccc gggctgctcc cccgccgtcg ttcaatgaga atggataaga ggctcgtggg 60attgacgtga gggggcaggg atggctatat ttctgggagc gaactccggg cgaatacgaa 120gcgcttggat acagttgtag ggagggattt catcgtttaa actcgagtga acgcgt 176<210>15<211>5834<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述來自載體pVTPA稻atpB和煙草rbcL邊界之間的DNA片段的核苷酸序列<400>15gtcgaggtca tgtcctgaag ttctttgtaa cgttgtaaag tttgcttaac tctttgtgca 60gtttcataat gttcgttgcc aacgatccga ggttgtaaca tagttgaggt tgaatctaaa 120ggatctactg caggataaat ccctttggaa gctaatcctc tggaaagtac ggtagtagca 180tccaaatgtg caaatgttgt agcaggagca gggtcggtca aatcgtccgc aggtacataa 240accgcttgga tcgaagttat agatcccttt ttagtagaag taattctttc ttgcaaagaa 300
cccatttctg tactaagagt aggttgataa cccactgcag agggcattct ccctaataag 360gcagatacct ccgatcctgc ttgaacaaaa cgaaagatat tatcgatgaa tagaagcacg 420tcttgcttat taacatctcg gaaatattct gccatagtta gggcagtcaa accaactctc 480atacgagctc ctggcggttc attcatttgg ccatagacta gagctacctt tgattcctca 540agattttttt cattaattac tccagattcc ttcatttcca tataaagatc atttccttca 600cgagtccgtt cccctactcc gccaaatacg gatacgcccc cgtgagcttt agcaatattg 660ttgattaatt ccatgatgag tactgtttta cctactccag ctcccccaaa tagtccgatt 720tttcctccac gccgataagg agctaaaaga tcgaccacct taataccagt ttcaaagatg 780gataatttcg tatctaactc gataaaggcg ggcgcggatc tatgaatagg gaatgttgca 840ctagtatcta caggacccaa attgtcaaca ggctccccaa gaacgttgaa aattcgtcca 900agagtagctc caccgacagg aacactgaga ggagctcccg tgtcaatcac ttccattcct 960ctcatcaacc catctgtagc actcatagct acagctctaa ctcgattatt tcctaataat 1020tgttgtacct cacaagttac attaatttgc ttaccgtcag tgtctcgact cttgactacc 1080aaagcattat aaatataagg taacttgccc gggggaaaag tgacatccag cacgggtcca 1140ataatttgat cgatacgccc tgtacttttt tcttcaattg tagaaacccc gggacgagaa 1200gtagtaggat tggttctcat aattatcaca taattttcaa aaaaaaggaa tttatcgaaa 1260ttttgatttt tttcttgttg aataatgcca aatcaacacc aaaaaaatat ccaaaaatcc 1320aaaagtcaaa aggaaatgaa ttagttaatt caataagaga gaaaagggga ccagcacttg 1380atttcgttgc ccaaacgaat cccattcaat cgtttactca tggaatgagt ccgtcggaaa 1440gttcaatcaa tctttttttc atatacattt tgccttttgt aaacgatttg tgcctactct 1500actttcttat ctaggacttc gatatacaaa atatatacta ctgtgaagca tagattgctg 1560tcaacagaga attttcgtag tatttaggta tttccactca aaataagaaa agggggtcta 1620ttaagaactt aataaggatt agaagttgat ttggggttgc gctatatcta ttaaagagta 1680tacaataaag atggatttgg tgaatcaaat ccatggttta ataatcgaag catgttaact 1740tacaataaca acaactcaag tcgaatgaat tcctatagca tagaatgtac acagggtgta 1800cccattatat atgaatgaaa catattatat gaatgaaaca tattcattaa cttaagcatg 1860ccccccattt tgtcgacggc ctttttggcc aagcttgata tcgaattccc ccgggctgct 1920cccccgccgt cgttcaatga gaatggataa gaggctcgtg ggattgacgt gagggggcag 1980ggatggctat atttctggga gcgaactccg ggcgaatacg aagcgcttgg atacagttgt 2040agggagggat ttcatcgttt aaactcgagt gaacgcgtat agggcccaat tcgagctcgg 2100taccagcacc accagcggtg aggtgcggaa cttctacaac ctcaaagccc ataacgttgc 2160ggatagaacc cttctcaggg tcaatcagag cagcgtagtt tgctgcgttc ggcatcagtg 2220ctgccagaat cgcagagtag ctatctgggt cacagtagaa cacacggtca gcagccggaa 2280catagttctt ggtcagagcc gcacgagcct tagtcagagc cgcaataatc tccttaccca 2340gcgcaacttg gtcggtcaag tgcggccttg ttctgagtgg tctcaattac ggtagcagta 2400cctaagccct cgggggatct ggggaggaat gagatatgaa aaagcctgaa ctcaccgcga 2460cgtctgtcga gaagtttctg atcgaaaagt tcgacagcgt ctccgacctg atgcagctct 2520cggagggcga agaatctcgt gctttcagct tcgatgtagg agggcgtgga tatgtcctgc 2580gggtaaatag ctgcgccgat ggtttctaca aagatcgtta tgtttatcgg cactttgcat 2640cggccgcgct cccgattccg gaagtgcttg acattgggga gtttagcgag agcctgacct 2700attgcatctc ccgccgtgca cagggtgtca cgttgcaaga cctgcctgaa accgaactgc 2760ccgctgttct acaaccggtc gcggaggcta tggatgcgat cgctgcggcc gatcttagcc 2820agacgagcgg gttcggccca ttcggaccgc aaggaatcgg tcaatacact acatggcgtg 2880atttcatatg cgcgattgct gatccccatg tgtatcactg gcaaactgtg atggacgaca 2940
ccgtcagtgc gtccgtcgcg caggctctcg atgagctgat gctttgggcc gaggactgcc 3000ccgaagtccg gcacctcgtg cacgcggatt tcggctccaa caatgtcctg acggacaatg 3060gccgcataac agcggtcatt gactggagcg aggcgatgtt cggggattcc caatacgagg 3120tcgccaacat cttcttctgg aggccgtggt tggcttgtat ggagcagcag acgcgctact 3180tcgagcggag gcatccggag cttgcaggat cgccacgact ccgggcgtat atgctccgca 3240ttggtcttga ccaactctat cagagcttgg ttgacggcaa tttcgatgat gcagcttggg 3300cgcagggtcg atgcgacgca atcgtccgat ccggagccgg gactgtcggg cgtacacaaa 3360tcgcccgcag aagcgcggcc gtctggaccg atggctgtgt agaagtactc gccgatagtg 3420gaaaccgacg ccccagcact cgtccgaggg caaagaaata gagtaggtac cagcaccacc 3480agcggtgagg tgcggaactt ctacaacctc aaagcccata acgttgcgga tagaaccctt 3540ctcagggtca atcagagcag cgtagtttgc tgcgttcggc atcagtgctg ccagaatcgc 3600agagtagcta tctgggtcac agtagaacac acggtcagca gccggaacat agttcttggt 3660cagagccgca cgagccttag tcagagccgc aataatctcc ttacccagcg caacttggtc 3720ggtaagtgcg gccttgttct gagtggtctc aattacggta gcagtaccta agccctcggg 3780ggatcagctt ggctgttttg gcggatgaga gaagattttc agcctgatac agattaaatc 3840agaacgcaga agcggtctga taaaacagaa tttgcctggc ggcagtagcg cggtggtccc 3900acctgacccc atgccgaact cagaagtgaa acgccgtagc gccgatggta gtgtggggtc 3960tccccatgcg agagtaggga actgccaggc atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag 4020actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt aggacaaatc 4080cgccgggagc ggatttgaac gttgcgaagc aacggcccgg agggtggcgg gcaggacgcc 4140cgccataaac tgccaggcat caaattaagc agaaggccat cctgacggat ggcctttttg 4200cgtttctaca aactcttttt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctggg 4260ggatcagctt gatggccgcc agtgtgatgg atgggaagtt cttattattt aggttagtca 4320ggtatttcca tttcaaaaaa aaaaaaagta aaaaagaaaa attgggttgc gctatatata 4380tgaaagagta tacaataatg atgtatttgg caaatcaaat accatggtct aataatcaaa 4440cattctgatt agttgataat tcaaattgtg agcgctcaca atttgaaaga ttcctgtgaa 4500aagtttcatt aacacggaat tcgtgtcgag tagaccttgt tgttgtgaga attcttaatt 4560catgagttgt agggagggat ttatgtcacc acaaacagag actaaagcaa gtgttggatt 4620caaagctggt gttaaagagt acaaattgac ttattatact cctgagtacc aaaccaagga 4680tactgatata ttggcagcat tccgagtaac tcctcaacct ggagttccac ctgaagaagc 4740aggggccgcg gtagctgccg aatcttctac tggtacatgg acaactgtat ggaccgatgg 4800acttaccagc cttgatcgtt acaaagggcg atgctaccgc atcgagcgtg ttgttggaga 4860aaaagatcaa tatattgctt atgtagctta ccctttagac ctttttgaag aaggttctgt 4920taccaacatg tttacttcca ttgtaggtaa cgtatttggg ttcaaagccc tgcgcgctct 4980acgtctggaa gatctgcgaa tccctcctgc ttatgttaaa actttccaag gtccgcctca 5040tgggatccaa gttgaaagag ataaattgaa caagtatggt cgtcccctgt tgggatgtac 5100tattaaacct aaattggggt tatctgctaa aaactacggt agagccgttt atgaatgtct 5160tcgcggtgga cttgatttta ctaaagatga tgagaacgtg aactcacaac catttatgcg 5220ttggagagat cgtttcttat tttgtgccga agcactttat aaagcacagg ctgaaacagg 5280tgaaatcaaa gggcattact tgaatgctac tgcaggtaca tgcgaagaaa tgatcaaaag 5340agctgtattt gctagagaat tgggcgttcc gatcgtaatg catgactact taacgggggg 5400attcaccgca aatactagct tggctcatta ttgccgagat aatggtctac ttcttcacat 5460ccaccgtgca atgcatgcgg ttattgatag acagaagaat catggtatcc acttccgggt 5520attagcaaaa gcgttacgta tgtctggtgg agatcatatt cactctggta ccgtagtagg 5580
taaacttgaa ggtgaaagag acataacttt gggctttgtt gatttactgc gtgatgattt 5640tgttgaacaa gatcgaagtc gcggtattta tttcactcaa gattgggtct ctttaccagg 5700tgttctaccc gtggcttcag gaggtattca cgtttggcat atgcctgctc tgaccgagat 5760ctttggggat gattccgtac tacagttcgg tggaggaact ttaggacatc cttggatctg 5820cagctagttc taga 5834<210>16<211>96<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述帶有添加的限制位點和RBS的嵌合PpsbA*啟動子的核苷酸序列<400>16gaattcacct tggttgacac gagtatataa gtcatgttat actgttgaat aaaaagcctt 60ccattttgat taaataaagg aggattttca tatgat 96<210>17<211>106<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述編碼小順反子，RBS和限制位點的合成DNA片段<400>17catatgtatc gattacgtaa ggaggaataa accatggacg agctctagac tgcagcatgc 60ccgggatcct aggcctgata tcaagcttct cgagctgtcg acagct106<210>18<211>365<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述來自顯示表達(dá)盒和周圍限制位點的載體的片段的核苷酸序列<400>18ggtaccgggc cccccctcga ggtcgacggt atcgataagc ttgatatcga attcaccttg 60gttgacacga gtatataagt catgttatac tgttgaataa aaagccttcc attttgatta 120
aataaaggag gattttcata tgtatcgatt acgtaaggag gaataaacca tggacgagct 180ctagactgca gcatgcccgg gatccggctg ctaacaaagc ccgaaaggaa gctgagttgg 240ctgctgccac cgctgagcaa taactagcat aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga 300ggggtttttt gctgaaagga ggaactatat ccggatcctg atatcaagct tctcgagctg 360tcgac 365<210>19<211>7510<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述來自載體pVTPA-f-GUS稻atpB和煙草rbcL邊界之間的DNA片段的核苷酸序列<400>19gtcgaggtca tgtcctgaag ttctttgtaa cgttgtaaag tttgcttaac tctttgtgca 60gtttcataat gttcgttgcc aacgatccga ggttgtaaca tagttgaggt tgaatctaaa 120ggatctactg caggataaat ccctttggaa gctaatcctc tggaaagtac ggtagtagca 180tccaaatgtg caaatgttgt agcaggagca gggtcggtca aatcgtccgc aggtacataa 240accgcttgga tcgaagttat agatcccttt ttagtagaag taattctttc ttgcaaagaa 300cccatttctg tactaagagt aggttgataa cccactgcag agggcattct ccctaataag 360gcagatacct ccgatcctgc ttgaacaaaa cgaaagatat tatcgatgaa tagaagcacg 420tcttgcttat taacatctcg gaaatattct gccatagtta gggcagtcaa accaactctc 480atacgagctc ctggcggttc attcatttgg ccatagacta gagctacctt tgattcctca 540agattttttt cattaattac tccagattcc ttcatttcca tataaagatc atttccttca 600cgagtccgtt cccctactcc gccaaatacg gatacgcccc cgtgagcttt agcaatattg 660ttgattaatt ccatgatgag tactgtttta cctactccag ctcccccaaa tagtccgatt 720tttcctccac gccgataagg agctaaaaga tcgaccacct taataccagt ttcaaagatg 780gataatttcg tatctaactc gataaaggcg ggcgcggatc tatgaatagg gaatgttgca 840ctagtatcta caggacccaa attgtcaaca ggctccccaa gaacgttgaa aattcgtcca 900agagtagctc caccgacagg aacactgaga ggagctcccg tgtcaatcac ttccattcct 960ctcatcaacc catctgtagc actcatagct acagctctaa ctcgattatt tcctaataat 1020tgttgtacct cacaagttac attaatttgc ttaccgtcag tgtctcgact cttgactacc 1080aaagcattat aaatataagg taacttgccc gggggaaaag tgacatccag cacgggtcca 1140ataatttgat cgatacgccc tgtacttttt tcttcaattg tagaaacccc gggacgagaa 1200gtagtaggat tggttctcat aattatcaca taattttcaa aaaaaaggaa tttatcgaaa 1260ttttgatttt tttcttgttg aataatgcca aatcaacacc aaaaaaatat ccaaaaatcc 1320aaaagtcaaa aggaaatgaa ttagttaatt caataagaga gaaaagggga ccagcacttg 1380atttcgttgc ccaaacgaat cccattcaat cgtttactca tggaatgagt ccgtcggaaa 1440gttcaatcaa tctttttttc atatacattt tgccttttgt aaacgatttg tgcctactct 1500actttcttat ctaggacttc gatatacaaa atatatacta ctgtgaagca tagattgctg 1560tcaacagaga attttcgtag tatttaggta tttccactca aaataagaaa agggggtcta 1620
ttaagaactt aataaggatt agaagttgat ttggggttgc gctatatcta ttaaagagta 1680tacaataaag atggatttgg tgaatcaaat ccatggttta ataatcgaag catgttaact 1740tacaataaca acaactcaag tcgaatgaat tcctatagca tagaatgtac acagggtgta 1800cccattatat atgaatgaaa catattatat gaatgaaaca tattcattaa cttaagcatg 1860ccccccattt tgtcgacggc ctttttggcc aagcttgata tcggtaagga ggaataaacc 1920atggtacgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca 1980ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa 2040gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt 2100cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca 2160ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat 2220aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg 2280tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtatc accgtttgtg tgaacaacga actgaactgg 2340cagactatcc cgccgggaat ggtgattacc gacgaaaacg gcaagaaaaa gcagtcttac 2400ttccatgatt tctttaacta tgccggaatc catcgcagcg taatgctcta caccacgccg 2460aacacctggg tggacgatat caccgtggtg acgcatgtcg cgcaagactg taaccacgcg 2520tctgttgact ggcaggtggt ggccaatggt gatgtcagcg ttgaactgcg tgatgcggat 2580caacaggtgg ttgcaactgg acaaggcact agcgggactt tgcaagtggt gaatccgcac 2640ctctggcaac cgggtgaagg ttatctctat gaactgtgcg tcacagccaa aagccagaca 2700gagtgtgata tctacccgct tcgcgtcggc atccggtcag tggcagtgaa gggcgaacag 2760ttcctgatta accacaaacc gttctacttt actggctttg gtcgtcatga agatgcggac 2820ttgcgtggca aaggattcga taacgtgctg atggtgcacg accacgcatt aatggactgg 2880attggggcca actcctaccg tacctcgcat tacccttacg ctgaagagat gctcgactgg 2940gcagatgaac atggcatcgt ggtgattgat gaaactgctg ctgtcggctt taacctctct 3000ttaggcattg gtttcgaagc gggcaacaag ccgaaagaac tgtacagcga agaggcagtc 3060aacggggaaa ctcagcaagc gcacttacag gcgattaaag agctgatagc gcgtgacaaa 3120aaccacccaa gcgtggtgat gtggagtatt gccaacgaac cggatacccg tccgcaaggt 3180gcacgggaat atttcgcgcc actggcggaa gcaacgcgta aactcgaccc gacgcgtccg 3240atcacctgcg tcaatgtaat gttctgcgac gctcacaccg ataccatcag cgatctcttt 3300gatgtgctgt gcctgaaccg ttattacgga tggtatgtcc aaagcggcga tttggaaacg 3360gcagagaagg tactggaaaa agaacttctg gcctggcagg agaaactgca tcagccgatt 3420atcatcaccg aatacggcgt ggatacgtta gccgggctgc actcaatgta caccgacatg 3480tggagtgaag agtatcagtg tgcatggctg gatatgtatc accgcgtctt tgatcgcgtc 3540agcgccgtcg tcggtgaaca ggtatggaat ttcgccgatt ttgcgacctc gcaaggcata 3600ttgcgcgttg gcggtaacaa gaaagggatc ttcactcgcg accgcaaacc gaagtcggcg 3660gcttttctgc tgcaaaaacg ctggactggc atgaacttcg gtgaaaaacc gcagcaggga 3720ggcaaacaat gaattcgagc tcggtacccc gcgtataggg cccaattcga gctcggtacc 3780agcaccacca gcggtgaggt gcggaacttc tacaacctca aagcccataa cgttgcggat 3840agaacccttc tcagggtcaa tcagagcagc gtagtttgct gcgttcggca tcagtgctgc 3900cagaatcgca gagtagctat ctgggtcaca gtagaacaca cggtcagcag ccggaacata 3960gttcttggtc agagccgcac gagccttagt cagagccgca ataatctcct tacccagcgc 4020aacttggtcg gtcaagtgcg gccttgttct gagtggtctc aattacggta gcagtaccta 4080agccctcggg ggatctgggg aggaatgaga tatgaaaaag cctgaactca ccgcgacgtc 4140tgtcgagaag tttctgatcg aaaagttcga cagcgtctcc gacctgatgc agctctcgga 4200gggcgaagaa tctcgtgctt tcagcttcga tgtaggaggg cgtggatatg tcctgcgggt 4260
aaatagctgc gccgatggtt tctacaaaga tcgttatgtt tatcggcact ttgcatcggc 4320cgcgctcccg attccggaag tgcttgacat tggggagttt agcgagagcc tgacctattg 4380catctcccgc cgtgcacagg gtgtcacgtt gcaagacctg cctgaaaccg aactgcccgc 4440tgttctacaa ccggtcgcgg aggctatgga tgcgatcgct gcggccgatc ttagccagac 4500gagcgggttc ggcccattcg gaccgcaagg aatcggtcaa tacactacat ggcgtgattt 4560catatgcgcg attgctgatc cccatgtgta tcactggcaa actgtgatgg acgacaccgt 4620cagtgcgtcc gtcgcgcagg ctctcgatga gctgatgctt tgggccgagg actgccccga 4680agtccggcac ctcgtgcacg cggatttcgg ctccaacaat gtcctgacgg acaatggccg 4740cataacagcg gtcattgact ggagcgaggc gatgttcggg gattcccaat acgaggtcgc 4800caacatcttc ttctggaggc cgtggttggc ttgtatggag cagcagacgc gctacttcga 4860gcggaggcat ccggagcttg caggatcgcc acgactccgg gcgtatatgc tccgcattgg 4920tcttgaccaa ctctatcaga gcttggttga cggcaatttc gatgatgcag cttgggcgca 4980gggtcgatgc gacgcaatcg tccgatccgg agccgggact gtcgggcgta cacaaatcgc 5040ccgcagaagc gcggccgtct ggaccgatgg ctgtgtagaa gtactcgccg atagtggaaa 5100ccgacgcccc agcactcgtc cgagggcaaa gaaatagagt aggtaccagc accaccagcg 5160gtgaggtgcg gaacttctac aacctcaaag cccataacgt tgcggataga acccttctca 5220gggtcaatca gagcagcgta gtttgctgcg ttcggcatca gtgctgccag aatcgcagag 5280tagctatctg ggtcacagta gaacacacgg tcagcagccg gaacatagtt cttggtcaga 5340gccgcacgag ccttagtcag agccgcaata atctccttac ccagcgcaac ttggtcggta 5400agtgcggcct tgttctgagt ggtctcaatt acggtagcag tacctaagcc ctcgggggat 5460cagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcagcc tgatacagat taaatcagaa 5520cgcagaagcg gtctgataaa acagaatttg cctggcggca gtagcgcggt ggtcccacct 5580gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg atggtagtgt ggggtctccc 5640catgcgagag tagggaactg ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg 5700ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc 5760gggagcggat ttgaacgttg cgaagcaacg gcccggaggg tggcgggcag gacgcccgcc 5820ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg acggatggcc tttttgcgtt 5880tctacaaact ctttttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctgggggat 5940cagcttgatg gccgccagtg tgatggatgg gaagttctta ttatttaggt tagtcaggta 6000tttccatttc aaaaaaaaaa aaagtaaaaa agaaaaattg ggttgcgcta tatatatgaa 6060agagtataca ataatgatgt atttggcaaa tcaaatacca tggtctaata atcaaacatt 6120ctgattagtt gataattcaa attgtgagcg ctcacaattt gaaagattcc tgtgaaaagt 6180ttcattaaca cggaattcgt gtcgagtaga ccttgttgtt gtgagaattc ttaattcatg 6240agttgtaggg agggatttat gtcaccacaa acagagacta aagcaagtgt tggattcaaa 6300gctggtgtta aagagtacaa attgacttat tatactcctg agtaccaaac caaggatact 6360gatatattgg cagcattccg agtaactcct caacctggag ttccacctga agaagcaggg 6420gccgcggtag ctgccgaatc ttctactggt acatggacaa ctgtatggac cgatggactt 6480accagccttg atcgttacaa agggcgatgc taccgcatcg agcgtgttgt tggagaaaaa 6540gatcaatata ttgcttatgt agcttaccct ttagaccttt ttgaagaagg ttctgttacc 6600aacatgttta cttccattgt aggtaacgta tttgggttca aagccctgcg cgctctacgt 6660ctggaagatc tgcgaatccc tcctgcttat gttaaaactt tccaaggtcc gcctcatggg 6720atccaagttg aaagagataa attgaacaag tatggtcgtc ccctgttggg atgtactatt 6780aaacctaaat tggggttatc tgctaaaaac tacggtagag ccgtttatga atgtcttcgc 6840ggtggacttg attttactaa agatgatgag aacgtgaact cacaaccatt tatgcgttgg 6900
agagatcgtt tcttattttg tgccgaagca ctttataaag cacaggctga aacaggtgaa 6960atcaaagggc attacttgaa tgctactgca ggtacatgcg aagaaatgat caaaagagct 7020gtatttgcta gagaattggg cgttccgatc gtaatgcatg actacttaac ggggggattc 7080accgcaaata ctagcttggc tcattattgc cgagataatg gtctacttct tcacatccac 7140cgtgcaatgc atgcggttat tgatagacag aagaatcatg gtatccactt ccgggtatta 7200gcaaaagcgt tacgtatgtc tggtggagat catattcact ctggtaccgt agtaggtaaa 7260cttgaaggtg aaagagacat aactttgggc tttgttgatt tactgcgtga tgattttgtt 7320gaacaagatc gaagtcgcgg tatttatttc actcaagatt gggtctcttt accaggtgtt 7380ctacccgtgg cttcaggagg tattcacgtt tggcatatgc ctgctctgac cgagatcttt 7440ggggatgatt ccgtactaca gttcggtgga ggaactttag gacatccttg gatctgcagc 7500tagttctaga7510<210>20<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述用于通過PCR擴(kuò)增aadA基因的寡核苷酸引物，具有RBS.
<400>20aaggagaata ccatggggga agcggtgatc gcc 33<210>21<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述用于通過PCR擴(kuò)增aadA基因的寡核苷酸引物<400>21gaacgagctc ttagacatta tttgccgac 29<210>22<211>6659<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述來自載體pVTPA-aadA稻atpB和煙草rbcL邊界之間的DNA片段的核苷酸序列<400>22gtcgaggtca tgtcctgaag ttctttgtaa cgttgtaaag tttgcttaac tctttgtgca 60gtttcataat gttcgttgcc aacgatccga ggttgtaaca tagttgaggt tgaatctaaa 120ggatctactg caggataaat ccctttggaa gctaatcctc tggaaagtac ggtagtagca 180tccaaatgtg caaatgttgt agcaggagca gggtcggtca aatcgtccgc aggtacataa 240accgcttgga tcgaagttat agatcccttt ttagtagaag taattctttc ttgcaaagaa 300cccatttctg tactaagagt aggttgataa cccactgcag agggcattct ccctaataag 360gcagatacct ccgatcctgc ttgaacaaaa cgaaagatat tatcgatgaa tagaagcacg 420tcttgcttat taacatctcg gaaatattct gccatagtta gggcagtcaa accaactctc 480atacgagctc ctggcggttc attcatttgg ccatagacta gagctacctt tgattcctca 540agattttttt cattaattac tccagattcc ttcatttcca tataaagatc atttccttca 600cgagtccgtt cccctactcc gccaaatacg gatacgcccc cgtgagcttt agcaatattg 660ttgattaatt ccatgatgag tactgtttta cctactccag ctcccccaaa tagtccgatt 720tttcctccac gccgataagg agctaaaaga tcgaccacct taataccagt ttcaaagatg 780gataatttcg tatctaactc gataaaggcg ggcgcggatc tatgaatagg gaatgttgca 840ctagtatcta caggacccaa attgtcaaca ggctccccaa gaacgttgaa aattcgtcca 900agagtagctc caccgacagg aacactgaga ggagctcccg tgtcaatcac ttccattcct 960ctcatcaacc catctgtagc actcatagct acagctctaa ctcgattatt tcctaataat 1020tgttgtacct cacaagttac attaatttgc ttaccgtcag tgtctcgact cttgactacc 1080aaagcattat aaatataagg taacttgccc gggggaaaag tgacatccag cacgggtcca 1140ataatttgat cgatacgccc tgtacttttt tcttcaattg tagaaacccc gggacgagaa 1200gtagtaggat tggttctcat aattatcaca taattttcaa aaaaaaggaa tttatcgaaa 1260ttttgatttt tttcttgttg aataatgcca aatcaacacc aaaaaaatat ccaaaaatcc 1320aaaagtcaaa aggaaatgaa ttagttaatt caataagaga gaaaagggga ccagcacttg 1380atttcgttgc ccaaacgaat cccattcaat cgtttactca tggaatgagt ccgtcggaaa 1440gttcaatcaa tctttttttc atatacattt tgccttttgt aaacgatttg tgcctactct 1500actttcttat ctaggacttc gatatacaaa atatatacta ctgtgaagca tagattgctg 1560tcaacagaga attttcgtag tatttaggta tttccactca aaataagaaa agggggtcta 1620ttaagaactt aataaggatt agaagttgat ttggggttgc gctatatcta ttaaagagta 1680tacaataaag atggatttgg tgaatcaaat ccatggttta ataatcgaag catgttaact 1740tacaataaca acaactcaag tcgaatgaat tcctatagca tagaatgtac acagggtgta 1800cccattatat atgaatgaaa catattatat gaatgaaaca tattcattaa cttaagcatg 1860ccccccattt tgtcgacggc ctttttggcc aagcttgata tcgaattccc ccgggctgct 1920cccccgccgt cgttcaatga gaatggataa gaggctcgtg ggattgacgt gagggggcag 1980ggatggctat atttctggga gcgaactccg ggcgaatacg aagcgcttgg atacagttgt 2040agggagggat ttcatcgttt aaactcgaaa ggagaatacc atgggggaag cggtgatcgc 2100cgaagtatcg actcaactat cagaggtagt tggcgtcatc gagcgccatc tcgaaccgac 2160gttgctggcc gtacatttgt acggctccgc agtggatggc ggcctgaagc cacacagtga 2220tattgatttg ctggttacgg tgaccgtaag gcttgatgaa acaacgcggc gagctttgat 2280caacgacctt ttggaaactt cggcttcccc tggagagagc gagattctcc gcgctgtaga 2340agtcaccatt gttgtgcacg acgacatcat tccgtggcgt tatccagcta agcgcgaact 2400
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<223>人工序列描述來自載體pVTPA-HB-aadA稻atpB和煙草rbcL邊界之間的DNA片段的核苷酸序列<400>24gtcgaggtca tgtcctgaag ttctttgtaa cgttgtaaag tttgcttaac tctttgtgca 60gtttcataat gttcgttgcc aacgatccga ggttgtaaca tagttgaggt tgaatctaaa 120ggatctactg caggataaat ccctttggaa gctaatcctc tggaaagtac ggtagtagca 180tccaaatgtg caaatgttgt agcaggagca gggtcggtca aatcgtccgc aggtacataa 240accgcttgga tcgaagttat agatcccttt ttagtagaag taattctttc ttgcaaagaa 300cccatttctg tactaagagt aggttgataa cccactgcag agggcattct ccctaataag 360gcagatacct ccgatcctgc ttgaacaaaa cgaaagatat tatcgatgaa tagaagcacg 420tcttgcttat taacatctcg gaaatattct gccatagtta gggcagtcaa accaactctc 480atacgagctc ctggcggttc attcatttgg ccatagacta gagctacctt tgattcctca 540agattttttt cattaattac tccagattcc ttcatttcca tataaagatc atttccttca 600cgagtccgtt cccctactcc gccaaatacg gatacgcccc cgtgagcttt agcaatattg 660ttgattaatt ccatgatgag tactgtttta cctactccag ctcccccaaa tagtccgatt 720tttcctccac gccgataagg agctaaaaga tcgaccacct taataccagt ttcaaagatg 780gataatttcg tatctaactc gataaaggcg ggcgcggatc tatgaatagg gaatgttgca 840ctagtatcta caggacccaa attgtcaaca ggctccccaa gaacgttgaa aattcgtcca 900agagtagctc caccgacagg aacactgaga ggagctcccg tgtcaatcac ttccattcct 960ctcatcaacc catctgtagc actcatagct acagctctaa ctcgattatt tcctaataat 1020tgttgtacct cacaagttac attaatttgc ttaccgtcag tgtctcgact cttgactacc 1080aaagcattat aaatataagg taacttgccc gggggaaaag tgacatccag cacgggtcca 1140ataatttgat cgatacgccc tgtacttttt tcttcaattg tagaaacccc gggacgagaa 1200gtagtaggat tggttctcat aattatcaca taattttcaa aaaaaaggaa tttatcgaaa 1260ttttgatttt tttcttgttg aataatgcca aatcaacacc aaaaaaatat ccaaaaatcc 1320aaaagtcaaa aggaaatgaa ttagttaatt caataagaga gaaaagggga ccagcacttg 1380atttcgttgc ccaaacgaat cccattcaat cgtttactca tggaatgagt ccgtcggaaa 1440gttcaatcaa tctttttttc atatacattt tgccttttgt aaacgatttg tgcctactct 1500actttcttat ctaggacttc gatatacaaa atatatacta ctgtgaagca tagattgctg 1560tcaacagaga attttcgtag tatttaggta tttccactca aaataagaaa agggggtcta 1620ttaagaactt aataaggatt agaagttgat ttggggttgc gctatatcta ttaaagagta 1680tacaataaag atggatttgg tgaatcaaat ccatggttta ataatcgaag catgttaact 1740tacaataaca acaactcaag tcgaatgaat tcctatagca tagaatgtac acagggtgta 1800
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<223>人工序列描述來自載體pVTPA-Bar稻atpB和煙草rbcL邊界之間的DNA片段的核苷酸序列<400>25gtcgaggtca tgtcctgaag ttctttgtaa cgttgtaaag tttgcttaac tctttgtgca 60gtttcataat gttcgttgcc aacgatccga ggttgtaaca tagttgaggt tgaatctaaa 120ggatctactg caggataaat ccctttggaa gctaatcctc tggaaagtac ggtagtagca 180tccaaatgtg caaatgttgt agcaggagca gggtcggtca aatcgtccgc aggtacataa 240accgcttgga tcgaagttat agatcccttt ttagtagaag taattctttc ttgcaaagaa 300cccatttctg tactaagagt aggttgataa cccactgcag agggcattct ccctaataag 360gcagatacct ccgatcctgc ttgaacaaaa cgaaagatat tatcgatgaa tagaagcacg 420tcttgcttat taacatctcg gaaatattct gccatagtta gggcagtcaa accaactctc 480atacgagctc ctggcggttc attcatttgg ccatagacta gagctacctt tgattcctca 540agattttttt cattaattac tccagattcc ttcatttcca tataaagatc atttccttca 600cgagtccgtt cccctactcc gccaaatacg gatacgcccc cgtgagcttt agcaatattg 660ttgattaatt ccatgatgag tactgtttta cctactccag ctcccccaaa tagtccgatt 720tttcctccac gccgataagg agctaaaaga tcgaccacct taataccagt ttcaaagatg 780gataatttcg tatctaactc gataaaggcg ggcgcggatc tatgaatagg gaatgttgca 840ctagtatcta caggacccaa attgtcaaca ggctccccaa gaacgttgaa aattcgtcca 900agagtagctc caccgacagg aacactgaga ggagctcccg tgtcaatcac ttccattcct 960ctcatcaacc catctgtagc actcatagct acagctctaa ctcgattatt tcctaataat 1020tgttgtacct cacaagttac attaatttgc ttaccgtcag tgtctcgact cttgactacc 1080aaagcattat aaatataagg taacttgccc gggggaaaag tgacatccag cacgggtcca 1140ataatttgat cgatacgccc tgtacttttt tcttcaattg tagaaacccc gggacgagaa 1200gtagtaggat tggttctcat aattatcaca taattttcaa aaaaaaggaa tttatcgaaa 1260ttttgatttt tttcttgttg aataatgcca aatcaacacc aaaaaaatat ccaaaaatcc 1320aaaagtcaaa aggaaatgaa ttagttaatt caataagaga gaaaagggga ccagcacttg 1380atttcgttgc ccaaacgaat cccattcaat cgtttactca tggaatgagt ccgtcggaaa 1440
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<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述來自載體pVTPA-Estrep稻atpB和煙草rbcL邊界之間的DNA片段的核苷酸序列<400>26gtcgaggtca tgtcctgaag ttctttgtaa cgttgtaaag tttgcttaac tctttgtgca 60gtttcataat gttcgttgcc aacgatccga ggttgtaaca tagttgaggt tgaatctaaa 120ggatctactg caggataaat ccctttggaa gctaatcctc tggaaagtac ggtagtagca 180tccaaatgtg caaatgttgt agcaggagca gggtcggtca aatcgtccgc aggtacataa 240accgcttgga tcgaagttat agatcccttt ttagtagaag taattctttc ttgcaaagaa 300cccatttctg tactaagagt aggttgataa cccactgcag agggcattct ccctaataag 360gcagatacct ccgatcctgc ttgaacaaaa cgaaagatat tatcgatgaa tagaagcacg 420tcttgcttat taacatctcg gaaatattct gccatagtta gggcagtcaa accaactctc 480atacgagctc ctggcggttc attcatttgg ccatagacta gagctacctt tgattcctca 540agattttttt cattaattac tccagattcc ttcatttcca tataaagatc atttccttca 600cgagtccgtt cccctactcc gccaaatacg gatacgcccc cgtgagcttt agcaatattg 660ttgattaatt ccatgatgag tactgtttta cctactccag ctcccccaaa tagtccgatt 720tttcctccac gccgataagg agctaaaaga tcgaccacct taataccagt ttcaaagatg 780gataatttcg tatctaactc gataaaggcg ggcgcggatc tatgaatagg gaatgttgca 840ctagtatcta caggacccaa attgtcaaca ggctccccaa gaacgttgaa aattcgtcca 900agagtagctc caccgacagg aacactgaga ggagctcccg tgtcaatcac ttccattcct 960ctcatcaacc catctgtagc actcatagct acagctctaa ctcgattatt tcctaataat 1020tgttgtacct cacaagttac attaatttgc ttaccgtcag tgtctcgact cttgactacc 1080aaagcattat aaatataagg taacttgccc gggggaaaag tgacatccag cacgggtcca 1140ataatttgat cgatacgccc tgtacttttt tcttcaattg tagaaacccc gggacgagaa 1200gtagtaggat tggttctcat aattatcaca taattttcaa aaaaaaggaa tttatcgaaa 1260ttttgatttt tttcttgttg aataatgcca aatcaacacc aaaaaaatat ccaaaaatcc 1320aaaagtcaaa aggaaatgaa ttagttaatt caataagaga gaaaagggga ccagcacttg 1380atttcgttgc ccaaacgaat cccattcaat cgtttactca tggaatgagt ccgtcggaaa 1440gttcaatcaa tctttttttc atatacattt tgccttttgt aaacgatttg tgcctactct 1500actttcttat ctaggacttc gatatacaaa atatatacta ctgtgaagca tagattgctg 1560tcaacagaga attttcgtag tatttaggta tttccactca aaataagaaa agggggtcta 1620ttaagaactt aataaggatt agaagttgat ttggggttgc gctatatcta ttaaagagta 1680tacaataaag atggatttgg tgaatcaaat ccatggttta ataatcgaag catgttaact 1740tacaataaca acaactcaag tcgaatgaat tcctatagca tagaatgtac acagggtgta 1800cccattatat atgaatgaaa catattatat gaatgaaaca tattcattaa cttaagcatg 1860ccccccattt tgtcgacggt atcgataagc ttgatatcga attcaccttg gttgacacga 1920gtatataagt catgttatac tgttgaataa aaagccttcc attttgatta aataaaggag 1980gattttcata tgtatcgatt acgtaaggag gaataaacca tgattgctgg acctgagtgg 2040ctgctagacc gtccatctgt caacaacagc caattagttg ttagcgttgc tggtactgtt 2100gaggggacga atcaagacat tagtcttaaa ttttttgaaa ttgacctaac atcacgacct 2160
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1.一種用于在質(zhì)體中穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化和表達(dá)基因的DNA載體，其中所述的欲被表達(dá)的基因插入由兩個自然轉(zhuǎn)錄方向相反且屬于不同綱或門的植物的質(zhì)體基因的5′非翻譯區(qū)組合而成的人工基因間區(qū)域中。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA載體，用于在被子植物的質(zhì)體中高頻率穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化和表達(dá)基因，其特征在于a)含有人工基因間區(qū)域，其中可能插入編碼多肽、處于質(zhì)體中適于其轉(zhuǎn)錄和翻譯的信號下、使用非質(zhì)體來源的轉(zhuǎn)錄終止序列的DNA序列，b)人工基因間區(qū)域側(cè)翼與質(zhì)體基因組中兩個自然轉(zhuǎn)錄方向相反的基因相鄰，其中這兩個基因的核苷酸序列與來源于不同綱(雙子葉和單子葉)的被子植物的質(zhì)體的atpB和rbcL基因的編碼序列一致，c)人工基因間區(qū)域包括用于atpB和rbcL基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的5′調(diào)節(jié)序列；用于插入目的基因的限制性酶切位點，后面有非質(zhì)體來源的轉(zhuǎn)錄終止子；用于屬于不同與前面rbcL基因所屬綱的被子植物的質(zhì)體中rbcL基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的第二個5′調(diào)節(jié)區(qū)。
3.如權(quán)利要求2所述的DNA載體，包含與來自煙草或水稻質(zhì)體rbcL基因的序列同源的邊界DNA序列。
4.如權(quán)利要求3所述的DNA載體，其中所述的與rbcL基因同源的DNA序列至少包含煙草rbcL基因的，始于翻譯起始密碼子的第-291位至第+1233位的核苷酸序列片段。
5.如權(quán)利要求4所述的DNA載體，其中所述的與rbcL基因同源的邊界DNA序列包含序列SEQ ID NO4。
6.如權(quán)利要求2所述的DNA載體，包含與來源于水稻或煙草質(zhì)體atpB基因的序列同源的邊界DNA序列。
7.如權(quán)利要求6所述的DNA載體，其中所述的與atpB基因同源的DNA序列至少包含水稻atpB基因的，始于翻譯起始密碼子的第-654位至第+1211位的核苷酸序列片段。
8.如權(quán)利要求7所述的DNA載體，其中所述與atpB基因同源的邊界序列包含序列SEQ ID NO8。
9.如權(quán)利要求2所述的DNA載體，其中所述的人工基因間區(qū)域中非質(zhì)體來源的轉(zhuǎn)錄終止子是來源于大腸桿菌(Escherichia coli)的雙向終止子rrnBT1T2或其同源物。
10.如權(quán)利要求2所述的DNA載體，在人工基因間區(qū)域插入允許篩選轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物的基因。
11.如權(quán)利要求10所述的DNA載體，其中所述的篩選基因能夠通過基因邊界處的同向重復(fù)DNA序列之間的同源重組被消除。
12.如權(quán)利要求11所述的DNA載體，其中所述的篩選基因編碼允許植物細(xì)胞在抗微生物化合物存在時存活的蛋白。
13.如權(quán)利要求12所述的DNA載體，其中所述的抗微生物化合物屬于氨基糖苷抗生素類。
14.如權(quán)利要求13所述的DNA載體，其中所述的抗生素化合物是潮霉素B。
15.如權(quán)利要求13所述的DNA載體，其中所述的抗生素化合物是壯觀霉素。
16.如權(quán)利要求12所述的DNA載體，其中所述的抗微生物化合物屬于磺胺類化合物。
17.如權(quán)利要求16所述的DNA載體，其中所述的抗微生物化合物是磺胺嘧啶。
18.如權(quán)利要求10所述的DNA載體，其中所述的篩選基因編碼允許植物細(xì)胞在除草劑化合物存在時存活的蛋白。
19.如權(quán)利要求18所述的DNA載體，其中所述的除草劑化合物屬于谷氨酰胺合成酶抑制劑類。
20.如權(quán)利要求19所述的DNA載體，其中所述的除草劑化合物是草銨膦(膦絲菌素)。
21.如權(quán)利要求19所述的DNA載體，其中所述的除草劑化合物是雙丙氨膦。
22.如權(quán)利要求18所述的DNA載體，其中所述的除草劑化合物屬于5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)抑制劑類。
23.如權(quán)利要求22所述的DNA載體，其中所述的除草劑化合物是草甘膦(N-磷酸甲基氨基乙酸)。
24.如權(quán)利要求18所述的DNA載體，其中所述的除草劑化合物屬于葉酸合成抑制劑類。
25.如權(quán)利要求24所述的DNA載體，其中所述的除草劑化合物是磺草靈((4-氨基苯磺酰)-氨基甲酸甲酯)。
26.如權(quán)利要求18所述的DNA載體，其中所述的除草劑化合物屬于乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制劑類。
27.如權(quán)利要求26所述的DNA載體，其中所述的除草劑化合物是磺酰脲(sulphonylurea)。
28.如權(quán)利要求26所述的DNA載體，其中所述的除草劑化合物是咪唑啉酮。
29.如權(quán)利要求18所述的DNA載體，其中所述的除草劑化合物屬于光合系統(tǒng)II抑制劑類。
30.如權(quán)利要求29所述的DNA載體，其中所述的除草劑化合物是溴苯腈(3，5-二溴-4-羥基芐腈)。
31.如權(quán)利要求10所述的DNA載體，其中所述的篩選基因編碼允許植物細(xì)胞在毒性化合物存在時存活的蛋白。
32.如權(quán)利要求31所述的DNA載體，其中所述的毒性化合物是甜菜醛。
33.如權(quán)利要求1-8所述的DNA載體，具有圖1A所示的一般結(jié)構(gòu)或其變體。
34.如權(quán)利要求1-11所述的DNA載體，具有圖1B所示的一般結(jié)構(gòu)或其變體。
35.如權(quán)利要求1-11所述的DNA載體，具有圖1C所示的一般結(jié)構(gòu)或其變體。
36.如權(quán)利要求1-11所述的DNA載體，有圖1D所示的一般結(jié)構(gòu)或其變體。
37.如權(quán)利要求1-11所述的DNA載體，具有圖1E所示的一般結(jié)構(gòu)或其變體。
38.如權(quán)利要求1-11所述的DNA載體，有圖1F所示的一般結(jié)構(gòu)或其變體。
39.如權(quán)利要求2所述的DNA載體，在rbcL基因的第二個5′非翻譯區(qū)有與大腸桿菌lacI阻抑蛋白結(jié)合位點功能上同源的序列。
40.一種DNA載體，在rbcL基因的翻譯起始密碼子上游有一個DNA序列，允許在非誘導(dǎo)條件下抑制該基因的轉(zhuǎn)錄，這樣所述的載體在任何宿主中都能維持在和復(fù)制。
41.如權(quán)利要求40所述的DNA載體，在rbcL基因的5′非翻譯區(qū)有一個與大腸桿菌lacI阻抑蛋白結(jié)合位點功能上同源的序列。
42.如權(quán)利要求41所述的DNA載體，其中所述的lacI結(jié)合位點的核苷酸序列，至少部分對應(yīng)于SEQ ID NO3所示序列。
43.如權(quán)利要求1-11所述的DNA載體，在人工基因間區(qū)域，插入一個或多個處于一個或多個質(zhì)體功能啟動子下的單順反子或多順反子轉(zhuǎn)錄單元。
44.如權(quán)利要求12-17所述的DNA載體，在人工基因間區(qū)域，插入一個或多個處于一個或多個質(zhì)體功能啟動子下的單順反子或多順反子轉(zhuǎn)錄單元。
45.如權(quán)利要求18-38所述的DNA載體，在人工基因間區(qū)域，插入一個或多個處于一個或多個質(zhì)體功能啟動子下的單順反子或多順反子轉(zhuǎn)錄單元。
46.如權(quán)利要求43，44或45所述的DNA載體，其中至少一個所述的質(zhì)體功能啟動子是人工基因間區(qū)域的rbcL啟動子。
47.如權(quán)利要求46所述的DNA載體，其中所述的質(zhì)體功能啟動子是包含于序列SEQ ID NO8的水稻rbcL啟動子。
48.如權(quán)利要求43，44或45所述的DNA載體，其中至少一個所述的質(zhì)體功能啟動子是包含于序列SEQ ID NO16的psbA*啟動子或其變體。
49.如權(quán)利要求48所述的DNA載體，具有一個與所述的psbA*啟動子相功能上連接的微順反子。
50.如權(quán)利要求49所述的DNA載體，其中所述的微順反子具有與SEQ ID NO17所示序列或其變異體同源的核苷酸序列。
51.一種用于在質(zhì)體中穩(wěn)定導(dǎo)入和表達(dá)基因的DNA載體，它使用微順反子來增強(qiáng)導(dǎo)入轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物中的基因的表達(dá)。
52.如權(quán)利要求43，44或45所述的DNA載體，其中至少一個農(nóng)業(yè)、獸醫(yī)、藥學(xué)、食品或工業(yè)的目的基因是所述的轉(zhuǎn)錄單元的組件。
53.如權(quán)利要求52所述的DNA載體，其中所述的農(nóng)業(yè)目的基因編碼有殺蟲劑活性的蛋白。
54.如權(quán)利要求53所述的DNA載體，其中所述的殺蟲劑蛋白屬于來源于蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的Cry蛋白家族。
55.如權(quán)利要求53所述的DNA載體，其中所述的殺蟲劑蛋白是蛋白酶抑制劑。
56.如權(quán)利要求52所述的DNA載體，其中所述的農(nóng)業(yè)目的基因編碼有抗微生物活性的多肽。
57.如權(quán)利要求56所述的DNA載體，其中所述的多肽屬于與致病力相關(guān)的植物蛋白(PR蛋白)類的一種。
58.如權(quán)利要求57所述的DNA載體，其中所述的PR蛋白是葡聚糖酶。
59.如權(quán)利要求57所述的DNA載體，其中所述的PR蛋白是幾丁質(zhì)酶
60.如權(quán)利要求57所述的DNA載體，其中所述的PR蛋白是奇異果甜蛋白樣蛋白。
61.如權(quán)利要求56所述的DNA載體，其中所述的多肽是核糖體失活蛋白(RIP)。
62.如權(quán)利要求52所述的DNA載體，其中所述的農(nóng)業(yè)目的基因編碼帶來對非生物壓力產(chǎn)生抗性的蛋白。
63.如權(quán)利要求62所述的DNA載體，其中所述的蛋白有膽堿氧化酶活性。
64.如權(quán)利要求52所述的DNA載體，其中所述的農(nóng)業(yè)目的基因編碼有助于增加植物產(chǎn)率的蛋白。
65.如權(quán)利要求64所述的DNA載體，其中所述的蛋白參與提高植物的光合作用。
66.如權(quán)利要求65所述的DNA載體，其中所述的蛋白有果糖-1，6-二磷酸磷酸酶(FBPase)活性。
67.如權(quán)利要求65所述的DNA載體，其中所述的蛋白有原卟啉原氧化酶(PROTOX)活性。
68.如權(quán)利要求65所述的DNA載體，其中所述的蛋白有核酮糖-1-5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RUBISCO)活性。
69.如權(quán)利要求65所述的DNA載體，其中所述的蛋白直接或非直接地參加了植物的碳固定過程。
70.如權(quán)利要求52所述的DNA載體，其中所述的農(nóng)業(yè)目的基因編碼有助于增加植物產(chǎn)品收獲后保存期的蛋白。
71.如權(quán)利要求52所述的DNA載體，其中所述的食品目的基因編碼有助于增加植物產(chǎn)品的營養(yǎng)品質(zhì)的蛋白。
72.如權(quán)利要求52所述的DNA載體，其中所述的獸醫(yī)或藥學(xué)目的基因編碼細(xì)胞因子。
73.如權(quán)利要求72所述的DNA載體，其中所述的細(xì)胞因子屬于干擾素家族。
74.如權(quán)利要求72所述的DNA載體，其中所述的細(xì)胞因子屬于白細(xì)胞介素家族。
75.如權(quán)利要求52所述的DNA載體，其中所述的獸醫(yī)或藥學(xué)目的基因編碼在免疫反應(yīng)中有調(diào)節(jié)活性的多肽。
76.如權(quán)利要求52所述的DNA載體，其中所述的獸醫(yī)或藥學(xué)目的基因編碼有激素活性的多肽。
77.如權(quán)利要求76所述的DNA載體，其中所述的有激素活性的多肽是胰島素。
78.如權(quán)利要求76所述的DNA載體，其中所述的有激素活性的多肽是生長激素。
79.如權(quán)利要求76所述的DNA載體，其中所述的有激素活性的多肽是促生長素。
80.如權(quán)利要求76所述的DNA載體，其中所述的有激素活性的多肽是促性腺激素。
81.如權(quán)利要求52所述的DNA載體，其中所述的獸醫(yī)或藥學(xué)目的基因編碼細(xì)胞增殖因子。
82.如權(quán)利要求81所述的DNA載體，其中所述的細(xì)胞增殖因子是表皮生長因子(EGF)。
83.如權(quán)利要求52所述的DNA載體，其中所述的獸醫(yī)或藥學(xué)目的基因編碼有造血活性的多肽。
84.如權(quán)利要求52所述的DNA載體，其中所述的獸醫(yī)或藥學(xué)目的基因編碼細(xì)胞受體。
85.如權(quán)利要求52所述的DNA載體，其中所述的獸醫(yī)或藥學(xué)目的基因編碼蛋白酶抑制劑。
86.如權(quán)利要求52所述的DNA載體，其中所述的獸醫(yī)或藥學(xué)目的基因編碼有溶栓活性的多肽。
87.如權(quán)利要求86所述的DNA載體，其中所述的多肽是鏈激酶。
88.如權(quán)利要求86所述的DNA載體，其中所述的多肽是組織溶酶原激活劑(t-PA)。
89.如權(quán)利要求52所述的DNA載體，其中所述的獸醫(yī)或藥學(xué)目的基因編碼疫苗抗原。
90.如權(quán)利要求89所述的DNA載體，其中所述的疫苗抗原屬于病毒。
91.如權(quán)利要求90所述的DNA載體，其中所述的疫苗抗原屬于肝炎病毒。
92.如權(quán)利要求91所述的DNA載體，其中所述的疫苗抗原是乙肝表面抗原。
93.如權(quán)利要求91所述的DNA載體，其中所述的疫苗抗原屬于甲肝病毒。
94.如權(quán)利要求90所述的DNA載體，其中所述的疫苗抗原屬于丙肝病毒。
95.如權(quán)利要求90所述的DNA載體，其中所述的疫苗抗原屬于口蹄疫病毒(FMDV)。
96.如權(quán)利要求90所述的DNA載體，其中所述的疫苗抗原屬于人類免疫缺陷病毒(HIV)。
97.如權(quán)利要求89所述的DNA載體，其中所述的疫苗抗原屬于細(xì)菌。
98.如權(quán)利要求89所述的DNA載體，其中所述的疫苗抗原屬于原生動物。
99.如權(quán)利要求52所述的DNA載體，其中所述的基因編碼免疫球蛋白可變區(qū)的片段。
100.如權(quán)利要求52所述的DNA載體，其中所述的基因編碼多聚蛋白。
101.如權(quán)利要求100所述的DNA載體，其中所述的多聚體蛋白是免疫球蛋白。
102.如權(quán)利要求100所述的DNA載體，其中所述的多聚體蛋白是激素。
103.如權(quán)利要求100所述的DNA載體，其中所述的多聚體蛋白是疫苗抗原。
104.如權(quán)利要求100所述的DNA載體，其中所述的多聚體蛋白是酶。
105.如權(quán)利要求100所述的DNA載體，其中所述的多聚體蛋白是細(xì)胞受體。
106.如權(quán)利要求52所述的DNA載體，其中所述的工業(yè)目的基因編碼生物聚合體的蛋白質(zhì)組分。
107.如權(quán)利要求52所述的DNA載體，其中所述的工業(yè)目的基因編碼酶。
108.如權(quán)利要求107所述的DNA載體，其中所述的酶是蛋白酶。
109.如權(quán)利要求107所述的DNA載體，其中所述的酶是脂肪酶。
110.如權(quán)利要求107所述的DNA載體，其中所述的酶是異構(gòu)酶。
111.如權(quán)利要求107所述的DNA載體，其中所述的酶有g(shù)lycosil-水解酶活性。
112.如權(quán)利要求111所述的DNA載體，其中所述的有g(shù)lycosil-水解酶活性的酶是果聚糖蔗糖酶。
113.如權(quán)利要求111所述的DNA載體，其中所述的有g(shù)lycosil-水解酶活性的酶是蔗糖酶。
114.如權(quán)利要求111所述的DNA載體，其中所述的有g(shù)lycosil-水解酶活性的酶是果聚糖酶。
115.如權(quán)利要求111所述的DNA載體，其中所述的有g(shù)lycosil-水解酶活性的酶是葡聚糖酶。
116.將如權(quán)利要求1-115任一所述的DNA載體轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞之前，加入細(xì)胞分裂素的植物細(xì)胞培養(yǎng)物，用于增加轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物的產(chǎn)率。
117.如權(quán)利要求116所述的細(xì)胞分裂素的用途。
118.如權(quán)利要求1-115任一所述的DNA載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組被子植物。
119.權(quán)利要求118的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物的子代。
120.權(quán)利要求118和119的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，其穩(wěn)定地表達(dá)至少一種存在于用于轉(zhuǎn)化的DNA載體中的基因。
121.權(quán)利要求118和119的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，含有雜合的atpB和/或rbcL蛋白。
122.權(quán)利要求120的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物的培養(yǎng)物。
123.權(quán)利要求120的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物細(xì)胞的培養(yǎng)物。
124.由于表達(dá)所述基因，生產(chǎn)權(quán)利要求120的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物的細(xì)胞的蛋白的純化和應(yīng)用。
125.權(quán)利要求118-121的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，其是被子植物。
126.權(quán)利要求125的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，其是雙子葉植物。
127.權(quán)利要求126的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，其為茄科。
128.權(quán)利要求127的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，其屬于以下一種煙草，西紅柿或馬鈴薯。
129.權(quán)利要求125的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，其是單子葉植物。
130.權(quán)利要求129的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，其是禾本科植物。
131.權(quán)利要求130的轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組植物，其屬于以下一種水稻，甘蔗，玉米，小麥或大麥。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備轉(zhuǎn)質(zhì)體基因組被子植物的載體。更具體而言，本發(fā)明涉及一種能在任何被子植物細(xì)胞的質(zhì)體基因組中穩(wěn)定地插入和表達(dá)異源基因的DNA載體。在該載體中，外源基因可插到位于由屬于不同綱(雙子葉和單子葉)的植物的atpB和rbcL操縱子的組合得到的人工基因間區(qū)域的多克隆位點中。表達(dá)盒通過載體的atpB和rbcL邊界序列與質(zhì)體基因組相應(yīng)同源區(qū)域之間的同源重組插入基因組中；以這種方式能夠在與編碼atpB基因的邊界區(qū)域相鄰的rbcL啟動子的控制下表達(dá)一個以上的目的基因。
文檔編號C12N15/82GK1685047SQ03822991
公開日2005年10月19日 申請日期2003年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月27日
發(fā)明者G·塞爾曼－侯塞因索薩, E·阿吉亞爾卡韋薩, A·D·C·岡薩雷斯奎恩特羅, O·拉莫斯岡薩雷斯 申請人:遺傳工程與生物技術(shù)中心