專利名稱：呼腸病毒基因組及其編碼蛋白質(zhì)在sars相關(guān)的研究中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及呼腸病毒與SARS相關(guān)性，以及呼腸病毒全基因組、全部蛋白質(zhì)及其在SARS診斷，治療，藥物和疫苗等中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，冠狀病毒(coronavirus)已被廣泛認定為導(dǎo)致嚴重急性呼吸綜合征(SARS)的病原體。但是，臨床和實驗證據(jù)提示，SARS病因不太可能是單一冠狀病毒感染。具體的，在北京臨床診斷的SARS病例中，60-80％都追溯不到明確的SARS傳染源。另外，在不同地區(qū)，約有19.6-66％患者具有腹瀉癥狀，但大多數(shù)病例，都沒能從患者糞便中分離出與SARS相關(guān)的冠狀病毒(SCV)。因此，可能部分SARS病例是由另外一種病毒引起的，或者是SCV和其他病毒混合感染引起(David Heymann，WHO負責(zé)傳染性疾病的執(zhí)行理事)。
為了有效控制SARS的傳播和提高對該疾病的治療水平，迫切希望確定導(dǎo)致所述疾病的病原體和/或參與疾病病程的所有致病性微生物。
通過電鏡觀察，本發(fā)明人出人意料的從SARS患者咽拭子樣本中觀察到的一株呼腸病毒樣病毒。
目前，通過RT-PCR檢測患者樣本得到的病原體包括肺炎衣原體、肺炎支原體、副黏液病毒等常見的非典型肺炎的病原體，但其中尚無呼腸病毒感染的報道，甚至沒有同一科其它病毒感染的報道。
將所述病毒感染小鼠，能夠產(chǎn)生與呼腸病毒引起的動物急性呼吸窘迫綜合癥(ARDS)十分相似的癥狀即在發(fā)病早期出現(xiàn)以炎癥滲出和透明膜形成為典型病理特點的大面積肺泡損傷，且在短期內(nèi)出現(xiàn)肺纖維化。同時，對SARS感染的流行病學(xué)調(diào)查表明，其主要傳播途徑為飛沫傳播和糞-口傳播，這也是呼腸病毒的傳播途徑。
因此，本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)了呼腸病毒與SARS感染之間的相關(guān)性，本發(fā)明正是在此基礎(chǔ)上完成的。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人從北京兩位SARS患者痰漱液和咽拭子標(biāo)本分離到兩株新的病毒。獲自患者的病毒株最初判斷可能是SCV的變種，但采用SCV特征性引物通過PCR無法擴增出相應(yīng)的DNA片段。同時，血清學(xué)實驗證明，該病毒和SARS的發(fā)生相關(guān)。
在對所述病毒的培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、血清學(xué)凝聚反應(yīng)和PCR測序的基礎(chǔ)上，證實我們用Hep-2細胞分離到病毒直徑分別在60-80nm，不同于已知直徑為80-120nm的SCV，而且更為符合呼腸病毒屬病毒的特征。
另一方面對于本發(fā)明所分離的病毒通過RT-PCR得到其基因組中的2個片段，經(jīng)序列測定，所得PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與已公布的呼腸病毒序列基本上符合。鑒于呼腸病毒屬病毒中可以感染人類的已知病毒株沒有引起SARS的能力，因此，推測從SARS患者樣本中分離的是一種SARS相關(guān)的新呼腸病毒。
提供含有所述病毒樣本的兩位SARS患者為母女關(guān)系，女兒患病后傳染給母親。試驗結(jié)果表明，從女兒和母親的標(biāo)本中均能分離呼腸病毒。所分離到的呼腸病毒能與康復(fù)病人血清凝集，表明所分離到的新呼腸病毒可能是引起SARS的病原體之一。
因此，本發(fā)明的一個方面涉及與SARS相關(guān)的新呼腸病毒。所述病毒已經(jīng)根據(jù)國際承認用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約于2003年6月9日保藏在國際保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)(中國，北京市，海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號)，并給予了保藏號為BYD1(CGMCC，0950)和BLD1(CGMCC，0951)。本發(fā)明的另一方面還涉及呼腸病毒在SARS診斷以及在制備用于診斷SARS的試劑中的用途。
本發(fā)明還涉及呼腸病毒在治療SARS以及制備用于治療SARS的藥物中的用途。
本發(fā)明還涉及呼腸病毒在制備SARS相關(guān)疫苗，特別是基因工程疫苗、減毒疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗等中的用途。
本發(fā)明的又一方面涉及一種SARS疫苗，其中含有免疫有效量的呼腸病毒片段、減毒呼腸病毒、滅活呼腸病毒，和以及藥學(xué)上可接受的載體，任選的其中還含有用于制備疫苗的常用佐劑。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，其中所述呼腸病毒選自至少一種本發(fā)明所分離的新呼腸病毒CGMCC 0950和CGMCC 0951。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，免疫有效量是指能夠在受試者體內(nèi)有效引起針對SARS相關(guān)呼腸病毒的免疫反應(yīng)的量。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉如何根據(jù)所選具體給藥途徑等因素選擇適當(dāng)?shù)膭┝俊?br> 本發(fā)明的再一方面涉及一種SARS疫苗，其中含有免疫有效量的滅活呼腸病毒，以及藥學(xué)上可接受的載體，任選的，所述疫苗中還含有用于制備疫苗的常用佐劑。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，其中所述呼腸病毒是本發(fā)明所分離的新呼腸病毒。
本發(fā)明還涉及保護哺乳動物免受呼腸病毒引起的病毒感染或SARS侵襲的方法，包括給有此需要的動物接種免疫有效量的本發(fā)明的疫苗。優(yōu)選地，接種途徑是皮下、鼻內(nèi)、口服、皮內(nèi)、肌內(nèi)、或腸胃外途徑。
已知呼腸病毒為雙股RNA(dsRNA)病毒，全基因組共約16.7kb，有10個片段L1、L2、L3、S1、S2、S3、S4、M1、M2、M3，分別編碼8個結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和3個非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，其中S1編碼兩個蛋白質(zhì)σ1和σ1S。序列高度保守的蛋白質(zhì)有λ1、σ3、σ2、σNS、μ1等。其病毒粒子直徑在60-80nm之間，具有雙層同心二十面體衣殼，無包膜。其雙層衣殼的病毒顆粒具有完全的感染力。呼腸病毒外面的雙層衣殼由8種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中內(nèi)層衣殼也稱為核心區(qū)域，由5種蛋白質(zhì)組成(λ1、λ2、λ3、μ2和σ2)，外層衣殼由另外的三種蛋白質(zhì)(μ1、σ3和σ1)組成?；蚪M片段和病毒的轉(zhuǎn)錄酶被封裝在內(nèi)層衣殼內(nèi)。
具體地，L2序列編碼核心刺突蛋白質(zhì)λ2，該蛋白涉及到病毒正股轉(zhuǎn)錄的酶反應(yīng)；L3編碼核殼蛋白λ1，該蛋白和核酸結(jié)合活性密切相關(guān)；S1編碼蛋白質(zhì)σ1，這個蛋白質(zhì)是細胞和呼腸病毒相互作用的主要決定因素，該蛋白可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性中和抗體；S4編碼一個主要的病毒外部衣殼組件σ3；M2編碼外部衣殼蛋白μ1，該蛋白與σ3、σ1一起在感染細胞中組裝成類似果核的顆粒，然后進行子代病毒的生產(chǎn)；S3編碼RNA結(jié)合多肽σNS，該蛋白質(zhì)具有和ssRNA的高親和力，并且出呼腸病毒形態(tài)發(fā)生中的發(fā)揮作用功能；s2編碼病毒內(nèi)部衣殼核心多肽σ2，具有與雙股RNA結(jié)合的活性；L1序列編碼λ3，是RNA依賴的RNA聚合酶。非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)有M3基因編碼的μNS蛋白、S1基因編碼的σ1S蛋白和M1基因編碼的μ2蛋白，但它們的功能目前尚不十分明確。
因此，本發(fā)明涉及包含呼腸病毒全基因組、及其編碼的諸蛋白質(zhì)在SARS的診斷，治療，藥物和疫苗等中的應(yīng)用。
具體的，本發(fā)明的一個方面，涉及呼腸病毒基因組或其編碼特定蛋白質(zhì)的核苷酸分子或其片段用于診斷SARS感染的用途，尤其是選自編碼呼腸病毒σ1蛋白的L3或其片段，編碼呼腸病毒λ1蛋白的S1或其片段，編碼呼腸病毒σ3蛋白的S4或其片段，編碼呼腸病毒σ2蛋白的S2或其片段，編碼呼腸病毒λ2蛋白的L2或其片段，編碼呼腸病毒λ3蛋白L1或其片段，編碼呼腸病毒σNS蛋白的S3或其片段，編碼呼腸病毒μ1的M2或其片段用于制備診斷SARS感染的藥劑的用途。
本發(fā)明的又一方面涉及一種獲自本發(fā)明所述新呼腸病毒的特征性DNA片段SEQ ID NO5和SEQ ID NO6。本發(fā)明的另一方面還涉及所述DNA片段編碼的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的再一方面還涉及所述新呼腸病毒DNA片段用于診斷SARS的用途。本發(fā)明的又一方面還涉及所述DNA片段用于制備診斷SARS的試劑的用途。
本發(fā)明所述新呼腸病毒DNA片段SEQ ID NO5，其長度為268bp，與已知呼腸病毒核殼蛋白λ1編碼序列L3具有較高的同源性(93％，詳見實施例5)，因此，所述DNA片段或其片段能夠用作核酸探針，用于檢測樣本中是否含有SARS相關(guān)的呼腸病毒。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，能用于檢測目的的上述DNA片段并不局限于SEQ ID NO5自身，還包括其簡并性片段，或與其同源性高于80％功能等同性核苷酸序列或其片段，或能夠與其雜交的核苷酸序列。
本發(fā)明所述DNA片段SEQ ID NO6，其長度為483bp，與已知呼腸病毒核殼蛋白σ2編碼序列S2具有較高的同源性(87％，詳見實施例5)，因此，所述DNA片段或其片段能夠用作核酸探針，用于檢測樣本中是否含有本發(fā)明所述新呼腸病毒。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，能用于檢測目的的上述DNA片段并不局限于SEQ ID NO6自身，還包括其簡并性片段，或與其同源性高于80％的功能等同性核苷酸序列或其片段，或能夠與其雜交的核苷酸序列。
本發(fā)明再一方面涉及一種呼腸病毒基因組編碼的蛋白質(zhì)或其片段用于診斷和/或治療SARS的用途，尤其是用于制備診斷和/或治療SARS的藥物的用途。具體的，本發(fā)明涉及選自呼腸病毒σ1蛋白或其片段，呼腸病毒λ1蛋白或其片段，呼腸病毒σ3蛋白或其片段，呼腸病毒σ2蛋白或其片段，呼腸病毒λ2蛋白或其片段，呼腸病毒λ3蛋白L1或其片段，呼腸病毒σNS蛋白或其片段，呼腸病毒μ1或其片段用于制備診斷和/或SARS感染的藥劑的用途。
本發(fā)明又一方面涉及一種用于預(yù)防和/或治療SARS藥物組合物，其中含有預(yù)防和/或治療有效量的呼腸病毒蛋白質(zhì)，和任選的藥學(xué)可接受的載體。
在本發(fā)明的一個實施方案中，所述藥物組合物中含有預(yù)防和/或治療有效量的選自呼腸病毒σ1蛋白或其片段，呼腸病毒λ1蛋白或其片段，呼腸病毒σ3蛋白或其片段，呼腸病毒σ2蛋白或其片段，呼腸病毒λ2蛋白或其片段，呼腸病毒λ3蛋白或其片段，呼腸病毒σNS蛋白或其片段，呼腸病毒μ1蛋白或其片段中的任一項或其組合，以及藥學(xué)可接受的載體。
本發(fā)明所述預(yù)防和/或治療SARS的藥物組合物還包括，但不限于，由所述呼腸病毒蛋白質(zhì)或其片段制備的基因工程疫苗，或亞單位疫苗。在所述疫苗中，包括藥學(xué)可接受的載體，以及任選的，包括適當(dāng)?shù)淖魟?br> 在本發(fā)明的一個實施方案中，采用PCR方法，釣取呼腸病毒基因組中S1蛋白的全基因或胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域的基因，將其插入真核表達載體pBLCFA質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)染CHO細胞并進行分離純化。對純化后的病毒蛋白通過諸如免疫動物等方法進行抗原性測定，并利用所述病毒抗原制備亞單位疫苗。
因此，本發(fā)明的再一方面還涉及所述特征性DNA片段SEQ IDNO5和SEQ ID NO6編碼的蛋白質(zhì)的用途。
本發(fā)明的再一方面還涉及所述DNA片段SEQ ID NO5和SEQ IDNO6編碼的蛋白質(zhì)用于診斷和/或治療SARS的用途。
本發(fā)明的再一方面還涉及呼腸病毒基因組DNA或片段編碼的蛋白質(zhì)用于診斷和/或治療SARS的用途。
由所述核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)，可以用來制備相應(yīng)的抗體，用于制備檢測樣本中是否含有本發(fā)明所述病毒。由已知抗原制備相應(yīng)抗體的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉。采用不同的檢測方法測定樣本中是否含有特定的抗原或抗體，也在本領(lǐng)域技術(shù)人員知識范圍之內(nèi)。
此外，由于在已知呼腸病毒中L3所編碼的核殼蛋白λ與核酸的結(jié)合活性密切相關(guān)，因此，所述編碼蛋白質(zhì)能夠用于體外篩選抗本發(fā)明所述病毒復(fù)制的藥物靶點。
本發(fā)明再一方面還涉及一種藥物組合物，其中含有治療和/或診斷有效量的本發(fā)明所述的DNA片段SEQ ID NO5和SEQ ID NO6，或其編碼的蛋白質(zhì)，以及藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明又一方面涉及針對選自呼腸病毒σ1蛋白，λ1蛋白，σ3蛋白，σ2蛋白，λ2蛋白，λ3蛋白，σNS蛋白，μ1蛋白中任一項的蛋白質(zhì)或其片段所制備的單克隆抗體或多克隆抗體，以及所述抗體用于制備診斷SARS感染的試劑盒的用途。
本發(fā)明又一方面涉及一種用于診斷SARS感染的試劑盒，其中含有診斷有效量的針對選自呼腸病毒σ1蛋白，λ1蛋白，σ3蛋白，σ2蛋白，λ2蛋白，λ3蛋白，σNS蛋白，μ1蛋白中任一項的蛋白質(zhì)或其片段所制備的單克隆抗體，或多克隆抗體，或其組合，以及任選的顯色試劑。
本發(fā)明還涉及在動物中檢測呼腸病毒感染或診斷SARS的方法，包括將本發(fā)明的抗體或本發(fā)明的呼腸病毒與來自所述動物的生物樣品接觸，并檢測或觀察抗原-抗體復(fù)合物的存在。該動物優(yōu)選是哺乳動物，例如人。


圖1A-E本發(fā)明所述呼腸病毒在Hep-2細胞的胞質(zhì)中聚集的情況。F為冠狀病毒接種感染的細胞胞漿中可見呼腸病毒(Re)和冠狀病毒的(Co)混合感染。右上角為呼腸病毒，左下角為冠狀病毒。
圖2對38位患者血清學(xué)檢驗結(jié)果。
圖3呼腸病毒腹腔接種Balb/C小鼠21天后肺組織切片(A和B)，和對照小鼠肺組織切片(C和D)在光鏡下的觀察。
實施例實施例1本發(fā)明所述新呼腸病毒的分離和形態(tài)學(xué)表征本發(fā)明所述標(biāo)本來源于2003年3月13日收到301醫(yī)院呼吸科送檢的SARS患者痰漱液和咽拭子標(biāo)本。分離用的細胞為Hep-G2和McCoy細胞，其中Hep-2和McCoy為傳代細胞，由本室保存((來源于美國組織采集中心(ATCC))。用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基RPIM 1640為Gibco/BRL公司產(chǎn)品；青霉素、鏈霉素為華北制藥廠產(chǎn)品；2％小牛血清為美國HyClone公司產(chǎn)品。
采用如下方法分離本發(fā)明的新病毒。
細胞培養(yǎng)法將處理好的標(biāo)本接種于長成單層細胞的10mL細胞培養(yǎng)瓶中，每份標(biāo)本接種兩瓶，37℃吸附1h，然后吸出標(biāo)本液、加含有2％小牛血清的細胞維持液，置37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每天觀察細胞變化，連續(xù)觀察10天。若不出現(xiàn)CPE進行盲傳，連續(xù)盲傳3代。
對于本發(fā)明的新病毒的形態(tài)學(xué)觀察和表征如下進行取痰漱液和咽拭子標(biāo)本，浸于無血清1640培養(yǎng)基，經(jīng)孔徑為0.22μm無菌濾膜過濾和青、鏈霉素處理后，分別接種于Hep-2和McCoy細胞，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱孵育，24小時后通過電鏡觀察細胞病變。結(jié)果見圖1超薄切片的電鏡觀察刮取感染病毒24h后的細胞，800-1000rpm離心3min；組織樣品為瀕死小鼠的肺組織，大小約1mm3。3％戊二醛固定2h，磷酸緩沖液漂洗，1％OsO4后固定2h，經(jīng)逐級酒精、丙酮脫水，Epon812樹脂包埋，組織樣品半薄切片定位，超薄切片，醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛雙重染色后，用Philips CM120透射電鏡觀察。對照樣品同步處理、觀察。
具體的，如圖1A-E所述病毒在Hep-2細胞的胞質(zhì)中聚集的情況表明，感染所述細胞的病毒具有不同成熟階段以及兩種類型的病毒粒子有致密核心的成熟粒子和有透明核心的不完全裝配的病毒粒子，這兩種類型的病毒粒子都有一個大約14nm厚的衣殼。大多數(shù)病毒顆粒都是成群分布的，呈晶格狀排列(圖1C-E)。電子顯微鏡(EM)證實該病毒為直徑60-80納米。
鏡下觀察到的病毒大小，雙層衣殼以及晶格狀排列等均符合呼腸病毒科病毒典型的形態(tài)特征。因此可以鑒定該株病毒屬于呼腸病毒。
用同樣的方法從該患者的母親身上也分離出上述病毒，但是從這2例患者的咽拭子中未能分離出SARS相關(guān)的冠狀病毒(SCV)。這可能是因為從咽拭子中分離SCV的幾率比痰中要少得多，因此不適合于SCV的分離。
令人感興趣的是，在感染SCV BJ01株的Vero-E6細胞中發(fā)現(xiàn)的典型冠狀病毒粒子其粒子直徑為80-120nm，具有一個黑的中心核衣殼和包膜(圖1F)。更重要的是，BJ01感染的Vero-E6細胞中同時觀察到位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的冠狀病毒和分布在胞質(zhì)中的呼腸病毒，而在作為對照的Vero-E6細胞中兩種病毒均未被發(fā)現(xiàn)。
由上述病毒形態(tài)學(xué)表征顯示，所分離的病毒是一種呼腸病毒科病毒。
實施例2本發(fā)明所述病毒的血清學(xué)檢驗對38例SARS患者的血清樣本和隨機獲得的35例健康人對照樣本，采用標(biāo)準(zhǔn)ELISA技術(shù)檢測對呼腸病毒的反應(yīng)。38例患者都經(jīng)過臨床癥狀診斷，而且經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)ELISA和免疫熒光方法檢測對SCV的血清學(xué)反應(yīng)呈陽性。來自北京市健康捐獻者的對照組血清樣品中，全部對呼腸病毒呈陰性反應(yīng)。陰性對照組平均OD值為0.037±0.023，閾值設(shè)定為0.098，OD超過閾值或者Positive/Negative＞2.65的樣品為陽性。北京市首例SARS患者及其母親身上分離的呼腸病毒用來檢測血清學(xué)反應(yīng)，這兩株呼腸病毒用RT-PCR和其它方法檢測未發(fā)現(xiàn)SCV。
血清學(xué)檢測結(jié)果(圖2)表明，來自SARS患者的38例血清樣品中，有24例，即63％的對呼腸病毒為陽性反應(yīng)。表明本發(fā)明所述病毒與SARS患者由較高的相關(guān)性，提示其也是參與SARS病程的一種致病微生物。
具體方法培養(yǎng)的病毒上清凍融三次，56℃60min滅活，10,000rpm 30min，上清用PEG6000 4℃沉淀過夜，12,000rpm 30min，沉淀用病毒裂解液(2％SDS PBS 0.01M Ph7.2)裂解，測定蛋白含量。
用250μug/mL病毒純化液包被酶聯(lián)板，100μL/孔包被酶聯(lián)板。37℃60min，PBS 0.01M pH7.2(2％BSA) 封閉30min，血清1∶10稀釋37℃水浴40min，加抗人酶標(biāo)抗體(中國人民解放軍微生物檢驗研究中心制備)后按常規(guī)ELISA方法檢測。
實施例3動物實驗
Balb/c鼠接種法選擇健康的4周BALB/c鼠，在無菌條件下，用0.5mL的微量注射器腹腔內(nèi)接種，余和李樣品分別接種5只，Balb/c鼠腹腔內(nèi)接種0.5mL/只，10天后同樣劑量追加接種一針。
每日觀測小鼠的發(fā)病情況，體溫變化情況，一般觀察一個月左右。若觀察到小鼠發(fā)病，將瀕死解剖取肺組織，若觀察期內(nèi)若未出現(xiàn)鼠發(fā)病，將鼠解剖取肺組織，分別進行固定染色后進行光鏡組織病理學(xué)觀察和電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察。
感染呼腸病毒的肺組織切片中，肺泡中隔顯著增厚，肺泡腔內(nèi)有大量單核細胞和少數(shù)多形核白細胞浸入(圖3)。在感染肺組織的電鏡切片中，發(fā)現(xiàn)纖維組織明顯增生。正常Balb/C小鼠肺組織切片觀察顯示肺泡結(jié)構(gòu)基本正常。由上述實驗結(jié)果表明，獲自SARS患者樣本的本發(fā)明所述新呼腸病毒能夠在動物體內(nèi)引發(fā)與臨床SARS患者相類似的癥狀，表明所述病毒確實參與SARS相關(guān)病程，能夠作為一個診斷和治療SARS感染患者的新靶標(biāo)。
實施例4新呼腸病毒部分基因的克隆及序列測定引物設(shè)計為進一步確證本發(fā)明所分離的病毒與呼腸病毒的關(guān)系，我們根據(jù)位于呼腸病毒基因組L3基因及S2基因區(qū)段內(nèi)的保守區(qū)域設(shè)計兩對引物1)483+正向引物5′-GTT GGA TTT GGT GGT CTG C-3′(SEQ ID NO1)；483-反向引物5′-CCA CTC CAC ATA TCC TCG-3′(SEQ ID NO；2)；2)268+正向引物5’-CAG TCG ACA TTG TGG TC-3’(SEQ ID NO3)268-反向引物5’-GCG TAC TGA CGT GGA TCA TA-3’(SEQ ID NO4)RT-PCR及PCR產(chǎn)物測序從細胞培養(yǎng)上清中按QIAamp Viral RNA Mini Kit說明書提取病毒RNA。首先進行反轉(zhuǎn)錄，在管中加入5μl總RNA，1μl SuperscriptII反轉(zhuǎn)錄酶(200u)，1μl隨機引物，4μL 5×反應(yīng)緩沖液，1μl RNA酶抑制劑和1μL 10mM dNTP以及2μL 0.1M DTT，最后用不含RNase的水補足體積至20μl。于42℃反應(yīng)60min后，95℃滅活5min。然后進行PCR擴增，反應(yīng)系統(tǒng)包括5μL 10×PCR反應(yīng)緩沖液，1μL 10mMdNTP，2μL 25mM MgCl2，1μLTaqDNA聚合酶(2.5U)，上下游引物各1μL(10μM)，2μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，用水補足至50μL。分別擴增40個循環(huán)。反應(yīng)完畢，將產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。
PCR產(chǎn)物切膠回收純化后由中國科學(xué)院北京基因組研究所及軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所測序。
序列測定結(jié)果1、268bp PCR產(chǎn)物具體如下序列5′TTTATGCGGATTCGCAATTCTCCCCTCTTGATCACGCATCGAACTGTTGATTAAAGTATCGTGTGTTCATTTGCCAAAGTGCCAGTGGGAAAATCCAATTTCCTTCAAAAGGCACCATCATCCCAGTCTCATCTCTAATCATTGGCGCGGCGCCATTCATTCCAAACGATATACGGCAATCTCGTCCGAATATGTGAACGCCAGGAGTATCACGATCAAACACCAAGTCAGGTGGAGGAGCCAGAGGCGACCACAAATGTGTCGACTG 3′(SEQ ID NO5)2.483bp PCR產(chǎn)物具體如下序列5′CCACTCCACATATCCTCGTCCACCCGAACGTACGAAATTGGACCGAACCCCGTTAAGTTGAGTAAACGTTACGGCACTCAATTGCTGGTACACTCGGTGCTTAAATCTTGGATCACGTGCTAAGAATGGGTAATCGTCGCAATCATACACTCGATCTGCTTGCGCCTGCAAAGCGGGCTGTGCCAGAACTTGTGGTGGGGCTACAACTAAACCATCAAGCGTAGGAGCTGACCACACTAGGCGCAGGAACCTGATATCTCCCCATCGGTGGTTAGGCCGAAATGGTATCTGAAGAGTACCACTTAAAAGGCAACTCATTTGATAATATCTTGAACCAGCGGTTGGAACGAGAGCCGATGTAGCTAGACCTCGCCCTAGACTTATCCAATCCAGAAATTGAGTCAGCTGCCATGGTGAATTACCCGCTCGAAGAAGATGTGAAGACAACTCATCGTTAATTGGCACATTTTGCAGACCACCAAA 3′(SEQ ID NO6)BLAST結(jié)果表明268bp片段與呼腸病毒(Reovirus 3 Dearing)L3基因區(qū)段同源性高達93％，483bp片段與呼腸病毒(Reovirus sp.)S2基因同源性為87％。
以上分子生物學(xué)實驗證實，該病毒為呼腸病毒科，正呼腸病毒屬病毒。
實施例5利用呼腸病毒蛋白進行檢測的ELISA方法。
包被抗原重組表達病毒蛋白用包被液稀釋到0.5μg/μL。每孔50μL，4℃過夜。之后PBST洗三次。
封閉10％FCS(PBS配制)。加滿孔(約0.2mL/孔)4C過夜或室溫2h或37C1.5h PBST洗三次。
患者血清1∶10稀釋。
將患者血清加入包被好的96孔板中，50μL/孔，37℃ 1h或室溫2h，PBST洗三次。
加入酶標(biāo)二抗(如酶標(biāo)羊抗人二抗)抗體用PBS按說明書稀釋濃度配制。50μL/孔室溫40min。
加入底物OPD(鄰苯二胺)。4mg OPD+10mL底物緩沖液+15μLH2O2。避光反應(yīng)。測OD490-492。
實施例6利用呼腸病毒相關(guān)蛋白及其制備的抗體進行間接免疫熒光染色的方法分離物感染細胞片的制備將培養(yǎng)成單層的Hep-2細胞用Hank’s液洗一次，然后接種分離物細胞培養(yǎng)懸液，放37℃孵箱中吸附1h，加入細胞維持液，1mL/瓶，放37℃繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞剛剛出現(xiàn)病變時，取感染細胞滴片，將滴好的玻片放37℃CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)8h使細胞貼壁。取出玻片，放入0.005M pH7.2 PBS中漂洗，除去未貼壁的懸浮細胞，涼干。放入冷丙酮內(nèi)，-30℃過夜固定，涼干，-20℃密封保存?zhèn)溆谩?br> 間接免疫熒光抗體染色方法將病人血清標(biāo)本1∶10稀釋后，56℃作用30min，然后再適當(dāng)稀釋后分別滴加到細胞抗原片上，置37℃濕盒中作用30min(若檢測IgM抗體則作用90min)，沖洗，PBS振蕩洗3次，涼干。然后加羊抗人FITC(Sigma公司產(chǎn)品)標(biāo)記熒光抗體，置37℃濕盒中作用30min，沖洗同前，涼干，在熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。
序列表<110> 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院儀器檢測分析中心<120> 呼腸病毒基因組及其編碼蛋白質(zhì)在SARS相關(guān)的研究中的用途<130>
<160> 6<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 19<212> DNA<213> 引物<400> 1gttggatttg gtggtctgc19<210> 2<211> 18<212> DNA<213> 引物
<400> 2ccactccaca tatcctcg18<210> 3<211> 17<212> DNA<213> 引物<400> 3cagtcgacat tgtggtc 17<210> 4<211> 20<212> DNA<213> 引物<400> 4gcgtactgac gtggatcata 20<210> 5<211> 268<212> DNA<213> 呼腸病毒<400> 5
tttatgcgga ttcgcaattc tcccctcttg atcacgcatc gaactgttga ttaaagtatc60gtgtgttcat ttgccaaagt gccagtggga aaatccaatt tccttcaaaa ggcaccatca120tcccagtctc atctctaatc attggcgcgg cgccattcat tccaaacgat atacggcaat180ctcgtccgaa tatgtgaacg ccaggagtat cacgatcaaa caccaagtca ggtggaggag240ccagaggcga ccacaaatgt gtcgactg 268<210> 6<211> 483<212> DNA<213> 呼腸病毒<400> 6ccactccaca tatcctcgtc cacccgaacg tacgaaattg gaccgaaccc cgttaagttg60agtaaacgtt acggcactca attgctggta cactcggtgc ttaaatcttg gatcacgtgc120taagaatggg taatcgtcgc aatcatacac tcgatctgct tgcgcctgca aagcgggctg180tgccagaact tgtggtgggg ctacaactaa accatcaagc gtaggagctg accacactag240gcgcaggaac ctgatatctc cccatcggtg gttaggccga aatggtatct gaagagtacc300acttaaaagg caactcattt gataatatct tgaaccagcg gttggaacga gagccgatgt360agctagacct cgccctagac ttatccaatc cagaaattga gtcagctgcc atggtgaatt420acccgctcga agaagatgtg aagacaactc atcgttaatt ggcacatttt gcagaccacc480aaa 48權(quán)利要求
1.呼腸病毒在治療SARS，特別是制備用于治療SARS的藥物組合物中的用途。
2.呼腸病毒在制備SARS相關(guān)疫苗，特別是減毒疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗中的用途。
3.一種SARS疫苗，其中含有免疫有效量的減毒和/或滅活呼腸病毒或呼腸病毒亞單位，優(yōu)選為減毒和/或滅活的BYD1(CGMCC0950)和/或BLD1(CGMCC 0951)或其蛋白質(zhì)片段，和以及藥學(xué)上可接受的載體，任選的其中還含有用于制備疫苗的常用佐劑。
4.呼腸病毒基因組或其編碼特定蛋白質(zhì)的核苷酸分子或其片段用于診斷SARS感染的用途，尤其是選自編碼呼腸病毒σ1蛋白的L3或其片段，編碼呼腸病毒λ1蛋白的S1或其片段，編碼呼腸病毒σ3蛋白的S4或其片段，編碼呼腸病毒σ2蛋白的S2或其片段，編碼呼腸病毒λ2蛋白的L2或其片段，編碼呼腸病毒λ3蛋白L1或其片段，編碼呼腸病毒σNS蛋白的S3或其片段，編碼呼腸病毒μ1的M2或其片段用于制備診斷SARS感染的藥劑的用途。
5.一種獲自新呼腸病毒BYD1(0950)或BLD1(0951)的DNA片段，其選自SEQ ID NO5或SEQ ID NO6，或其簡并性片段，或與其同源性高于80％功能等同性核苷酸序列或其片段，或能夠與其雜交的核苷酸序列。
6.權(quán)利要求5所述DNA片段用于診斷SARS的用途，尤其是制備診斷SARS的試劑的用途。
7.權(quán)利要求5所述DNA片段編碼的蛋白質(zhì)用于診斷和/或治療SARS的用途。
8.一種用于預(yù)防和/或治療SARSD藥物組合物，含有預(yù)防和/或治療有效量的選自呼腸病毒σ1蛋白或其片段，呼腸病毒λ1蛋白或其片段，呼腸病毒σ3蛋白或其片段，呼腸病毒σ2蛋白或其片段，呼腸病毒λ2蛋白或其片段，呼腸病毒λ3蛋白或其片段，呼腸病毒σNS蛋白或其片段，呼腸病毒μ1蛋白或其片段中的任一項或其組合，以及藥學(xué)可接受的載體。
9.針對選自呼腸病毒σ1蛋白，λ1蛋白，σ3蛋白，σ2蛋白，λ2蛋白，λ3蛋白，σNS蛋白，μ1蛋白中任一項的蛋白質(zhì)或其片段所制備的單克隆抗體或多克隆抗體，
10.一種用于診斷SARS感染的試劑盒，其中含有診斷有效量的針對選自呼腸病毒σ1蛋白，λ1蛋白，σ3蛋白，σ2蛋白，λ2蛋白，λ3蛋白，σNS蛋白，μ1蛋白中任一項的蛋白質(zhì)或其片段所制備的單克隆抗體，或多克隆抗體，或其組合，以及任選的顯色試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及呼腸病毒與SARS相關(guān)性，以及呼腸病毒全基因組、全部蛋白質(zhì)及其在SARS診斷，治療，藥物和疫苗等中的應(yīng)用。
文檔編號A61P11/00GK1565628SQ03146589
公開日2005年1月19日 申請日期2003年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月8日
發(fā)明者端青, 張學(xué)敏, 朱虹, 周育森, 楊怡, 李衛(wèi)華, 何君, 何昆, 張浩杰, 周濤, 宋立華, 靳寶峰, 檀華, 李慧艷, 左庭婷, 陳德蕙 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院儀器測試分析中心, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所