H5n1禽流感病毒樣顆粒及其應(yīng)用和制備方法、疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種H5N1禽流感病毒樣顆粒及其應(yīng)用和制備方法、疫苗。本發(fā)明的H5N1禽流感病毒樣顆粒，其包含HA蛋白、NA蛋白和M2蛋白，所述HA蛋白的氨基酸序列為SEQ?ID?No：l，所述NA蛋白的氨基酸序列為SEQ?ID?No：3，所述M2蛋白的氨基酸序列為SEQ?ID?No：5。本發(fā)明利用酵母表達(dá)系統(tǒng)最嗜好的核苷酸密碼子，大片段合成HA、NA、M2結(jié)構(gòu)蛋白的基因，構(gòu)建HA、NA、M2在酵母表達(dá)系統(tǒng)的重組表達(dá)載體，并經(jīng)面包酵母菌轉(zhuǎn)染，制備高致病型禽流感病毒樣粒子。
【專利說明】H5N1禽流感病毒樣顆粒及其應(yīng)用和制備方法、疫苗
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種H5N1禽流感病毒樣顆粒及其應(yīng)用和制備方法、疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002]高致病性禽流感的廣泛傳播和相繼的人類感染使我們認(rèn)識(shí)到人類正面臨由H5N1型禽流感病毒引起流感大流行的危險(xiǎn)。已經(jīng)有50多個(gè)國(guó)家從禽類中分離到高致病性H5N1禽流感病毒。首例H5N1人禽流感病例于1997年出現(xiàn)在香港，而基因組分析結(jié)果表明此株H5N1病毒的HA基因來源于1996年廣東省鵝H5N1分離毒株；華南地區(qū)(特別是廣東)四季特征不明顯，是鳥類遷徙的中轉(zhuǎn)地，幾次流感大流行都發(fā)源于此，一直被認(rèn)為是世界流感的發(fā)源地之一。
[0003]病毒樣顆粒(Virus-Like Particles，VLPs)是含有病毒的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白的空心顆粒，沒有病毒的核酸，不能自主復(fù)制，其在形態(tài)上與真正病毒粒子相同或相似，可通過和病毒感染一樣的途徑呈遞給免疫細(xì)胞，有效誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)。病毒衣殼蛋白一般具有天然的自裝配能力，并且VLPs沒有感染性，穩(wěn)定性好，不易失活，可以制備為良好的疫苗。利用基因工程的分子克隆、合成既具有病毒穩(wěn)定的自然形態(tài)、又具有病毒完整的免疫原性、但又沒有病毒任何的感染源性的病毒樣顆粒VLP，要求同時(shí)具備病毒分子生物學(xué)、載體系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物工程和發(fā)酵工程等諸方面的知識(shí)、技術(shù)和工藝手段。因此，到目前為止，在病毒疫苗的研究領(lǐng)域，國(guó)際上僅有默克公司的用于預(yù)防子宮頸癌的人乳頭瘤狀病毒HPV的VLP疫苗上市。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種利用面包酵母高效生產(chǎn)高致病性H5N1禽流感病毒樣顆粒及其應(yīng)用和制備方法、疫苗。
[0005]本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案為提供一種H5N1禽流感病毒樣顆粒，其包含HA蛋白、NA蛋白和M2蛋白，所述HA蛋白的氨基酸序列為SEQ ID No:1，所述NA蛋白的氨基酸序列為SEQID No:3，所述M2蛋白的氨基酸序列為SEQ ID No:5。
[0006]優(yōu)選的，上述的H5N1禽流感病毒樣顆粒中，所述HA蛋白核苷酸序列為SEQ IDNo:2，所述NA蛋白的核苷酸序列為SEQ ID No:4，所述M2蛋白的核苷酸序列為SEQ ID
No: 6。
[0007]本發(fā)明的另一技術(shù)方案為提供一種含有上述H5N1禽流感病毒樣顆粒的疫苗。
[0008]優(yōu)選的，上述的疫苗為固態(tài)制劑、肌注或噴霧型液態(tài)制劑。
[0009]本發(fā)明的另一技術(shù)方案為提供一種H5N1禽流感病毒樣顆粒的用途，用于制備預(yù)防禽流感病毒相關(guān)疾病的組合物。
[0010]本發(fā)明的另一技術(shù)方案為提供一種H5N1禽流感病毒樣顆粒的制備方法，包括如下步驟:將人工合成的禽流感病毒基因克隆到克隆載體中，所述禽流感病毒基因的核苷酸序列為SEQ ID No:3,SEQ ID No:4和SEQ ID No:6依次的組合，將克隆載體的禽流感病毒基因連入重組表達(dá)載體，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到酵母感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)后將培養(yǎng)物純化即得H5N1禽流感病毒樣顆粒。
[0011]優(yōu)選的，上述的H5N1禽流感病毒樣顆粒的制備方法中，所述克隆載體為PVD5質(zhì)粒。
[0012]優(yōu)選的，上述的H5N1禽流感病毒樣顆粒的制備方法中，所述重組表達(dá)載為PTG3828 質(zhì)粒。
[0013]優(yōu)選的，上述的H5N1禽流感病毒樣顆粒的制備方法中，所述酵母感受態(tài)細(xì)胞為C13BYS86。
[0014]優(yōu)選的，上述的H5N1禽流感病毒樣顆粒的制備方法中，所述步驟“將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到酵母感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)后將培養(yǎng)物純化即得H5N1禽流感病毒樣顆?！本唧w為:將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染酵母感受態(tài)細(xì)胞C13BYS86，經(jīng)30°C，72小時(shí)震蕩培養(yǎng)飽和培養(yǎng)后，進(jìn)行I分鐘超聲波裂解，3000rpm高速離心除細(xì)胞碎片，收集上清即為液態(tài)免疫原的H5N1禽流感病毒樣顆粒。
[0015]本發(fā)明有益效果:本發(fā)明利用酵母表達(dá)系統(tǒng)最嗜好的核苷酸密碼子，大片段合成HA、NA、M2結(jié)構(gòu)蛋白的基因，構(gòu)建HA、NA、M2在酵母表達(dá)系統(tǒng)的重組表達(dá)載體，并經(jīng)面包酵母工程菌轉(zhuǎn)染，制備高致病型禽流感病毒樣粒子。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為H5N1禽流感病毒樣顆粒的凝血因子HA蛋白、神經(jīng)氨酸酶NA蛋白和細(xì)胞基質(zhì)M2蛋白的基因表達(dá)構(gòu)架；
[0017]圖2為H5N1禽流感病毒樣顆粒的克隆載體pVD5質(zhì)粒基因表達(dá)構(gòu)架；
[0018]圖3為H5N1禽流感病毒樣顆粒的表達(dá)載體PTG3828質(zhì)?；虮磉_(dá)構(gòu)架；
[0019]圖4為H5N1禽流感病毒樣顆粒的電子顯微鏡照片；
[0020]圖5為H5N1禽流感病毒樣顆?？乖腤estern-blot免疫檢測(cè)法照片。
【具體實(shí)施方式】
[0021]為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、構(gòu)造特征、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式并配合附圖詳予說明。
[0022]H5N1型禽流感病毒的核酸是單股RNA、有8個(gè)節(jié)段組成，每個(gè)節(jié)段編碼1_2個(gè)蛋白，血凝素(HA)、神經(jīng)氨酸酶(NA)和基質(zhì)蛋白(M2)構(gòu)成病毒的外殼；膜內(nèi)層為基質(zhì)蛋白Ml ;病毒顆粒的內(nèi)部為核衣殼，由核蛋白(NP)，三種聚合酶蛋白(PB1，PB2, PA)和病毒的單鏈RNA片斷組成。其中HA主要有三個(gè)功能:①在感染之前和細(xì)胞表面特異性病毒受體結(jié)合；②介導(dǎo)病毒外膜與核內(nèi)體膜融合；③刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。NA的主要功能是清除HA、NA和細(xì)胞表面的唾液酸，幫助病毒穿過呼吸道粘蛋白，并與上皮細(xì)胞結(jié)合；促進(jìn)HA蛋白水解，破壞宿主細(xì)胞上的HA受體，幫助子代病毒顆粒脫離感染細(xì)胞，有利于病毒的釋放。NA既具有酶活性，同時(shí)又是流感病毒重要的表面抗原?？筃A抗體不能中和流感病毒的毒力，但可以降低病毒量，減少肺部損傷程度。因?yàn)榭筃A抗體能阻止子代病毒脫離受染細(xì)胞，使這些受染細(xì)胞最終被機(jī)體的防御系統(tǒng)清除。M2蛋白在病毒的生活周期中起著裝配病毒的作用，其功能的改變直接影響病毒復(fù)制過程。
[0023]實(shí)施例1本發(fā)明H5N1禽流感病毒樣顆粒的制備
[0024]步驟1、基因片段合成和克隆
[0025]本發(fā)明H5N1高致病型禽流感病毒樣粒子基因的構(gòu)建是采用了世界衛(wèi)生組織公布的印度尼西亞型(A/Indonesia/2005) H5N1病毒的HA病毒基因、越南型(A/Vietnam/2005)H5N1病毒的NA病毒基因、中國(guó)福建型(A/Fujian/2005)H5N1病毒的M2病毒基因，構(gòu)建成“泛亞型” H5N1高致病禽流感病毒樣顆粒的病毒基因架構(gòu)。
[0026]本發(fā)明根據(jù)酵母表達(dá)系統(tǒng)最嗜好的基因編碼設(shè)計(jì)了 H5N1禽流感病毒凝血因子HA蛋白、神經(jīng)氨酸酶NA蛋白和細(xì)胞基質(zhì)M2蛋白的酵母優(yōu)化基因3225個(gè)堿基的核苷酸序列、并利用DNA化學(xué)合成儀大片段合成HA、NA、M2結(jié)構(gòu)蛋白的基因編碼(H5N1VLP基因)，所述基因的核苷酸序列為SEQ ID No:3、SEQ ID No:4和SEQ ID No:6的組合，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0027]將人工合成的H5N1禽流感病毒的凝血因子HA蛋白、神經(jīng)氨酸酶NA蛋白和細(xì)胞基質(zhì)M2蛋白的基因克隆到中間載體PVD5質(zhì)粒中。在合成該基因時(shí)，在基因的N’末端和C’末端分別人工加入Hind III (AAGCTT)和BamH I (GGATCC)酶切位點(diǎn)作為目的基因的克隆位點(diǎn)，并在基因的C’末端上游人工插入兩個(gè)人工突變位點(diǎn)TAA TAG,作為蛋白翻譯的終止位點(diǎn)。
[0028]步驟2.克隆載體構(gòu)建
[0029]克隆載體pVD5的構(gòu)建:將步驟I合成的H5N1VLP基因克隆到克隆載體pVD5的克隆位點(diǎn):分別將步驟I經(jīng)人工合成基因片段，即H5N1禽流感凝血因子HA蛋白、神經(jīng)氨酸酶NA蛋白和細(xì)胞基質(zhì)M2蛋白的酵母優(yōu)化基因和克隆載體pVD5進(jìn)行核酸限制性內(nèi)切酶(HindIII/BamH I)酶切并線性化后，施行第一次連接反應(yīng)；轉(zhuǎn)染ToplO感受態(tài)細(xì)胞，利用氨芐霉素篩選菌落，并獲得重組克隆載體PVD5，構(gòu)成中間載體PVD-H5N1-HNM，其中克隆載體pVD5基因表達(dá)構(gòu)架如圖2所示。
[0030]步驟3.表達(dá)載體構(gòu)建
[0031]利用核酸限制性內(nèi)切酶(Sal I和BamH I)線性化并釋放含有:(I)、位于H5N1VLP基因上游的酵母爾法配對(duì)基因啟動(dòng)子(MFa I) ; (2)、H5N1VLP基因；(3)、位于H5N1VLP基因下游的兩個(gè)表達(dá)終止位點(diǎn)(TAATAG)的基因族群；并利用核酸限制性內(nèi)切酶(Sal I和BglII)線性化處理表達(dá)載體PTG3828質(zhì)粒，將該基因片段克隆到表達(dá)質(zhì)粒PTG3828的SalI和Bgl II的克隆位點(diǎn)之間，施行第二次連接反應(yīng)；轉(zhuǎn)染ToplO感受態(tài)細(xì)胞，利用氨芐霉素篩選菌落，重組的表達(dá)載體PTG3828，形成表達(dá)載體PTG3828-H5N1-HNM。所述表達(dá)載體的基因表達(dá)架構(gòu)如圖3所示。
[0032]步驟4.面包酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
[0033]使用C13BYS86 感受態(tài)細(xì)胞，是由 Global Bioreactor PTY.LTD.饋贈(zèng)。
[0034]將步驟3構(gòu)建得到的表達(dá)載體pTG3828-H5Nl-HNM和IOmg魚精DNA，與LiCl處理制備的酵母感受態(tài)細(xì)胞充分混勻后，280C靜置培育12小時(shí)，使用氨基酸缺陷型選擇培養(yǎng)基平板篩選重組酵母菌落。只有成功轉(zhuǎn)化的C13BYS86細(xì)胞才能形成菌落。利用PCR和酶切法確認(rèn)所轉(zhuǎn)染酵母細(xì)胞含有所克隆的目的基因。
[0035]步驟5.電子顯微鏡觀察
[0036]利用電子顯微鏡對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行觀測(cè)確定:在對(duì)培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞樣本進(jìn)行負(fù)染后，鏡下觀察可見大量的病毒樣顆粒。其中有10萬倍放大的酵母細(xì)胞顯示放大的病毒樣顆粒在細(xì)胞器內(nèi)形成的過程和部位。顆粒形狀與流感病毒的自然形態(tài)相同，在一維平面照片上，顆粒的基本形態(tài)是“表盤狀”。
[0037]步驟6.免疫原制備:
[0038]液態(tài)發(fā)酵免疫原的制備:
[0039]將pTG3828-H5Nl-HNM轉(zhuǎn)染酵母細(xì)胞經(jīng)30°C，72小時(shí)震蕩培養(yǎng)飽和培養(yǎng)后，進(jìn)行I分鐘中低強(qiáng)度超聲波裂解，3000rpm高速離心除細(xì)胞碎片，收集上清備用。
[0040]固態(tài)發(fā)酵免疫原的制備:
[0041]將pTG3828-H5Nl-HNM轉(zhuǎn)染酵母細(xì)胞經(jīng)20%葡萄糖溶液稀釋后接種于適量的市售小麥精粉中，含水量大約為50%。經(jīng)30°C、24小時(shí)發(fā)酵后，加入30%新鮮小麥精粉收水后，置于旋轉(zhuǎn)熱風(fēng)干烤箱內(nèi)，經(jīng)70°C烘烤12小時(shí)。粉碎至0.2厘米大小的顆粒備用。
[0042]本發(fā)明技術(shù)方案特點(diǎn):
[0043](I)用面包酵母共表達(dá)HA、NA、M2蛋白制備H5N1禽流感病毒樣粒子，現(xiàn)有技術(shù)中多用原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建病毒樣顆粒，本發(fā)明的特色之處在于用面包酵母固態(tài)發(fā)酵、大量制備H5N1型禽流感病毒樣粒子。
[0044](2)制備的H5N1禽流感病毒樣粒子疫苗:目前多種H5N1禽流感疫苗正處于研發(fā)階段，如滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗、腺病毒載體疫苗、DNA疫苗，但所有這些處于研發(fā)階段的疫苗都存在生產(chǎn)成本高、產(chǎn)量相對(duì)較低、難以大規(guī)模生產(chǎn)、免疫程序額費(fèi)工費(fèi)時(shí)等問題。而利用重組的面包酵母固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵大量生產(chǎn)包括口服型、噴霧型和注射型高致病禽流感H5N1疫苗的發(fā)明以及相關(guān)的技術(shù)和工藝，由于在病毒基因的最佳組合、面包酵母工程菌的篩選、以及重組面包酵母工程菌的表達(dá)穩(wěn)定性等關(guān)鍵技術(shù)和工藝方面仍有許多難題亟待解決，所以本發(fā)明中利用面包酵母工程菌制備H5N1病毒樣顆粒疫苗的設(shè)計(jì)、相關(guān)的技術(shù)和工藝，在國(guó)際上處于領(lǐng)先水平。
[0045](3) H5N1高致病型禽流感病毒樣粒子的鑒定:采用電子顯微鏡技術(shù)和Western-blot免疫檢測(cè)法對(duì)所表達(dá)的病毒樣粒子進(jìn)行鑒定，圖4所示為禽流感病毒(H5N1)樣顆粒的電子顯微鏡照片，H5N1病毒樣粒子(10萬倍)電子顯微鏡照片顯示:圖1所示的H5N1病毒的HA、NA和M2基因族群在轉(zhuǎn)染的面包酵母細(xì)胞中自然裝配成均勻一致如“表盤狀”形狀的病毒樣顆粒狀物質(zhì)；圖5所示為禽流感病毒(H5N1)樣顆?？乖腤estern-blot免疫檢測(cè)法照片，檢測(cè)中采用標(biāo)準(zhǔn)的H5N1抗原檢測(cè)試劑盒(美國(guó)新澤西檢測(cè)試劑公司DrSun饋贈(zèng))；檢測(cè)中的陰性對(duì)照為未轉(zhuǎn)染的面包酵母細(xì)胞的裂解產(chǎn)物，其檢測(cè)結(jié)果未顯示與H5N1病毒相關(guān)的抗原反應(yīng)；而經(jīng)PTG3828-H5N1-HNM轉(zhuǎn)染的面包酵母的固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵物的裂解液，在檢測(cè)中則分別顯示與H5N1病毒HA抗原的陽性反應(yīng)。
[0046](4)病毒樣粒子表達(dá)條件的優(yōu)化:優(yōu)化在不同條件下的最佳表達(dá)狀態(tài)。本發(fā)明的重組酵母細(xì)胞的最佳生長(zhǎng)條件為:將48小時(shí)震蕩培養(yǎng)的菌種、經(jīng)20%葡萄糖溶液稀釋后，以1%_3%的接種量、接種于優(yōu)質(zhì)小麥精粉，接種后通過緩慢攪拌、使得培養(yǎng)基氧氣的分布均勻和充分，發(fā)酵溫度為30°C，相對(duì)濕度75%，發(fā)酵的PH值是4-6度之間，發(fā)酵時(shí)間為24小時(shí)，期間進(jìn)行3次深層的溫和攪拌以增加有氧發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基中糖含量應(yīng)控制在6%以下，以確保酵母菌種在適宜的滲透壓下高效繁殖。
[0047]實(shí)施例2[0048]免疫效果測(cè)定:用實(shí)施例1所得H5N1禽流感病毒樣顆粒對(duì)健康青年雞進(jìn)行不同途徑的免疫接種，對(duì)疫苗的安全性、免疫原性和免疫保護(hù)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0049]免疫方案:對(duì)4周齡未接種免疫的小雞，分別于I天進(jìn)行一次免疫、第14天和21天、進(jìn)行兩次免疫加強(qiáng)的程序。每次免疫前采血，末次免疫I周后(第28天)采血、收集血清。
[0050]免疫途徑:
[0051]免疫分組:每組由9羽隨機(jī)性別的雞群所組成，在統(tǒng)計(jì)表中以wl_w9所代表。 [0052]免疫效果判定:以未接種H5N1禽流感疫苗的健康雞血清、判定為陰性對(duì)照；以ELISA被檢血清抗體效價(jià)高于陰性對(duì)照2倍以上者、判定為陽性。以ELISA被檢血清抗體效價(jià)高于陰性對(duì)照、但低于陰性對(duì)照2倍以上者、判為可疑。
[0053]第一組:實(shí)施例1中所得固態(tài)發(fā)酵免疫原分別于1、14、21天直接飼喂；
[0054]第二組:實(shí)施例1中所得固態(tài)發(fā)酵免疫原經(jīng)制粒并經(jīng)聚丙烯酸鈉包被成抗胃酸微囊劑型后，分別于1、14、21天直接飼喂；
[0055]第三組:實(shí)施例1中所得液態(tài)發(fā)酵免疫原經(jīng)超聲波破碎后，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定，蛋白含量約為3%的濃度，分別于1、14、21天直接雞翅膀下肌肉注射0.2毫升/次；
[0056]第四組:實(shí)施例1中所得液態(tài)發(fā)酵免疫原經(jīng)超聲波破碎后，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定，蛋白含量約為3%的濃度，經(jīng)純凈水10倍稀釋至蛋白濃度值為0.3%后，分別于1、14、21天直接噴霧，平均每只雞0.2毫升/次。
[0057]免疫效果:將采集的所有試驗(yàn)雞群血清、應(yīng)用間接ELISA檢測(cè)禽流感病毒血清特異性抗體。表1所示為禽流感病毒(H5N1)顆粒樣疫苗對(duì)雞群免疫后的病毒特異性抗體的水平。所有四個(gè)組別均顯示抗H5N1抗體陽性反應(yīng)。其中，第一組，固態(tài)發(fā)酵免疫原直接飼喂組，抗體效價(jià)低于第二組為固態(tài)發(fā)酵免疫原經(jīng)制粒并經(jīng)聚丙烯酸鈉包被后的飼喂組；而第二組抗體效價(jià)又低于第三組的肌注免疫組；而最高抗體效價(jià)的是第四組的液態(tài)發(fā)酵免疫原經(jīng)超聲波破碎后的直接噴霧接種組。因?yàn)閲婌F接種組最接近于H5N1高致病性禽流感并得的自然感染途徑。因此這幾種不同的免疫接種途徑、以及所產(chǎn)生的免疫效果也包括在本發(fā)明中。
[0058]表1
[0059]
【權(quán)利要求】
1.一種H5N1禽流感病毒樣顆粒，其特征在于，其包含HA蛋白、NA蛋白和M2蛋白，所述HA蛋白的氨基酸序列為SEQ ID No:1，所述NA蛋白的氨基酸序列為SEQ ID No:3，所述M2蛋白的氨基酸序列為SEQ ID No:5。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的H5N1禽流感病毒樣顆粒，其特征在于，所述HA蛋白核苷酸序列為SEQ ID No:2，所述NA蛋白的核苷酸序列為SEQ ID No:4，所述M2蛋白的核苷酸序列為 SEQ ID No:6。
3.含有權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述H5N1禽流感病毒樣顆粒的疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗為固態(tài)制劑、肌注或噴霧型液態(tài)制劑。
5.如權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)所述H5N1禽流感病毒樣顆粒的用途，用于制備預(yù)防禽流感病毒相關(guān)疾病的組合物。
6.—種如權(quán)利要求2所述的H5N1禽流感病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟:將人工合成的禽流感病毒基因克隆到克隆載體中，所述禽流感病毒基因的核苷酸序列為SEQ ID No:3、SEQ ID No:4和SEQ ID No:6依次的組合，將克隆載體的禽流感病毒基因連入重組表達(dá)載體，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到酵母感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)后將培養(yǎng)物純化即得H5N1禽流感病毒樣顆粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的H5N1禽流感病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，所述克隆載體為PVD5質(zhì)粒。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的H5N1禽流感病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，所述重組表達(dá)載為PTG3828質(zhì)粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的H5N1禽流感病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，所述酵母感受態(tài)細(xì)胞為C13BYS86。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的H5N1禽流感病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于，所述步驟“將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到酵母感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)后將培養(yǎng)物純化即得H5N1禽流感病毒樣顆?！本唧w為:將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染酵母感受態(tài)細(xì)胞C13BYS86，經(jīng)30°C，72小時(shí)震蕩培養(yǎng)飽和培養(yǎng)后，進(jìn)行I分鐘超聲波裂解，3000rpm高速離心除細(xì)胞碎片，收集上清即為液態(tài)免疫原的H5N1禽流感病毒樣顆粒。
【文檔編號(hào)】C12N7/01GK103740655SQ201410025271
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2014年1月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月20日
【發(fā)明者】曲新勇, 陳文彬 申請(qǐng)人:瑞鑫百奧生物科技（深圳）有限公司